我国西洋参引种30年后遗传稳定性研究

[摘要]以人参及加拿大西洋参为对照，对我国14个产地的西洋参的遗传多样性进行分析，以了解我国西洋参引种30年后遗传稳定性是否发生了明显变异。应用了RAPD分子标记技术，POPGEN32数据分析，NTSYS2.10聚类图绘制。结果显示，各产地西洋参遗传多样性丰富，其中13条随机引物共扩增出多态性条带81条，多态性83.51%；有效等位基因数（Ne）1.456 7；Nei′s基因多样性指数（H）0.274 8；Shannon′s多样性信息指数（Ho）0.419 4。聚类分析可知，人参与西洋参分类明显，特别发现无人参生产的地区的西洋参与有人参生产的地区的西洋参可明显各聚一类，认为在遗传上未达到质的变异。因此提出吉林省西洋参要注意建立良种田，以保持种质纯净的建议。

[关键词]西洋参；随机扩增多态性DNA；遗传稳定性

西洋参Panax quinqufolium L.为五加科多年生草本植物，以根入药，是《中国药典》中的品种[1]。西洋参原产于美国、加拿大[2]。20世纪80年代后开始规模化在中国种植[3]。其中，东北栽培区是西洋参的主要栽培区，栽培面积占全国的50%以上[4]，尤以吉林省为主。由于吉林省也是我国人参P. ginseng C. A. Meyer的主要产区，二者在分类学上的亲缘关系极其相近，又都是常异花授粉植物[5]，因此我国引种30多年，西洋参的遗传稳定性是否会受到人参影响是值得关注的课题。

本试验采用RAPD分子标记技术以人参和加拿大产西洋参为对照，对我国不同产地的西洋参进行种质资源多样性研究，可说明我国西洋参种质是否存在变异现象，为西洋参建立良种田的必要性提供理论依据。

1 材料

供试材料为3个吉林省产地的人参、加拿大3个产地的西洋参及国内14个产地的西洋参，参龄4年，均通过吉林农业大学中药材学院田义新教授鉴定。样品来源、编号与代号情况见表1。

TC-XP型PCR扩增仪（杭州博日）；BIS910凝胶成像系统（北京东胜）；超微量紫外-可见分光光度计（北京百泰克）。2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克）；100 bp DNA Maker（北京鼎国昌盛）；随机引物（北京六合华大基因科技）。

2 方法

2.1 基因组DNA提取 采用CTAB法[6-7]提取基因组DNA。

2.2 引物的筛选 用随机选取的25个引物进行扩增，筛选出13个多态性丰富，条带清晰且重复行良好的引物用于20个样品的DNA扩增。

2.3 RAPD-PCR扩增及电泳检测 扩增反应体系为20 μL：2×Power Taq PCR MasterMix 9 μL （2 mmol・L-1 Mg2+）；引物1.5 μL （10 mmol・L-1）；DNA模板1 μL （40 mg・L-1）；ddH2O补足20 μL。

PCR扩增程序：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 1 min，38 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 7 min。4 ℃保存。

电泳检测：扩增后的产物使用含有0.5 g・L-1 EB的2%的琼脂糖凝胶电泳分离，电压100 V，电泳1 h，使用凝胶成像系统化照相，保存，见图1，2。

2.4 数据统计及分析 对分离后的电泳条带进行人工读带，其中每条条带视为一个分子标记[8]，以100 bp DNA Maker为标准，对重复性好的条带进行统计，有带的记为“1”，无则为“0”，形成0/1/矩阵。将数据输入数据矩阵，使用NTSYS-pc软件对20个样品之间的相似系数进行分析，构建遗传树状图，进行聚类分析。用软件POPGEN32对样品进行遗传参数分析。

3 结果

3.1 RAPD-PCR 13个引物对人参3个产地及西洋参17个产地的DNA样品进行PCR扩增，条带在3～11条不等，扩增的片段在100～2 000 bp。引物P3扩增的的条带最多，为11条；引物P1扩增的最少，为3条。13个引物共扩增出97条重复性高、清晰的条带。平均每个引物扩增出7条，其中多态性条带为81条，多态性为83.51%，见表2。

3.2 遗传多样性分析 由POPGEN32软件分析，20个样品间种间的遗传多样性非常丰富，平均每个位点的有效等位基因数（Ne）为1.456 7；H为0.274 8；Ho 为0.419 4，数据表明人参与西洋参中间的遗传多样性非常丰富。在种内水平上，Ne在1.014 6～1.072 9，平均为1.047 1；Nei′s基因多样性指数（H）反应了基因的多样性和基因的分化程度，在0.008 5～0.047 0，平均为0.030 8，表明种内遗传多样性偏低；Shannon′s多样性信息指数（Ho）在0.012 5～0.068 6，平均为0.040 5。从以上3个指数可以看出，种群间遗传多样性规律一致，吉林通化西洋参遗传多样性较高，遗传变异最丰富；山东西洋参的种内遗传变异普遍小于其他种内的，见表3。

3.3 遗传分化分析 用POPGEN32软件对20个种群间的遗传变异进行分析，结果表明种间存在一定的遗传分化，Ht为0.274 8，Hs为0.027 8，种间基因多样性（Dst=Ht-Hs）为0.247 0，Gst为0.899 0，表明种间有89.90%存在遗传变异，有10.01%遗传变异在种内，以上数据表明种群间的遗传多样性相对较高。根据Shannon′s多样性信息指数的分析结果可以得出种间的分化系数为0.903 4，说明在种间有90.34%存在遗传变异，9.66%的变异分布在种内。以上2种分析结果基本一致，说明人参与西洋参种间的遗传分化明显，遗传变异主要存在种间。

3.4 遗传距离分析 遗传距离（遗传相似系数）是衡量种群间遗传分化程度的最重要指标。利用POPGEN32计算不同产地的人参与西洋参之间的遗传距离D和遗传一致度I。由数据可以看出人参与西洋参的遗传一致度在0.556 73～0.670 1，说明西洋参与人参种间的相似度较低；在加拿大西洋参与国内产地西洋参种群中，其遗传相似度在0.639 23～0.948 5，以加拿大BC省与北京的最高，说明二者种间相似程度最高；加拿大BC省与吉林兴参镇的遗传一致度最差，说明二者种间相似程度也最差。西洋参与人参种群间的遗传距离（D）在0.400 3 3～0.585 7，表明二者遗传距离较大；在加拿大西洋参与国内产地西洋参种群中，遗传距离在0.052 9～0.447 6，以加拿大BC省与北京的最小，说明二者种间遗传距离较小，与吉林兴参镇的最大，说明二者种间遗传距离最大。

3.5 聚类分析 用NTSYS2.10对种群进行聚类分析，见图3。人参与西洋参各种群间的遗传距离较大，能明显的区分开来。以遗传系数0.682 3为分类点，可以将20个种质资源划分为四大类群。第Ⅰ类群均为人参种质：吉林长白县、抚松县及集安县。第Ⅱ类群为吉林通化西洋参。第Ⅲ类群包括2个产地西洋参种质：吉林抚松县兴参镇及抚松县北岗镇。第Ⅳ类群包括14个产地西洋参种质，在遗传系数为0.825 6处，又可将其分为3个亚种群：第i类包括加拿大BC省、加拿大安省01、加拿大安省02、北京怀柔及山东文登市；第ii类包括吉林集安及吉林抚松04；第iii类包括吉林长白县、长春市西洋参、靖宇县、吉林珲春县、抚松县01，02，03。

4 讨论

人参与西洋参是人参属五加科的2个不同种群，通过RAPD分子标记技术对人参与国内外不同产地的西洋参进行基因组DNA分析，采用POPGEN32计算各种参数，同时使用NTSYS2.10对种群进行聚类分析，构建种群树状图。从结果中可以看出，人参与西洋参之间存在着很大的差异，彼此各自聚为一类。且遗传距离远远大于西洋参种内的。通过RAPD分子标记技术，根据有效等位基因数、Shannon多样性指数，以及遗传一致度与遗传距离的分析，表明国内外西洋参有着很丰富的遗传多样性，与姜玉新等[9]研究结果相一致。西洋参与人参种群间的遗传距离在0.400 3～0.623 5，说明西洋参与人参种群间的遗传距离较大，种群间的遗传多样性（0.247 0）大于种群内的遗传多样性（0.027 8），此结果与杨天天[10]的结果相一致。更好地说明RAPD法可以很好的作为一种区分西洋参与人参的分子标记，还可以应用与亲缘关系的分析。

西洋参属于常异花授粉植物，自然异交率为45.72%，且吉林省内的西洋参种植基地多与人参种植基地相邻，在长期的人工和自然的选择下，不断丰富了自身的遗传基础，使其与原产地加拿大西洋参相比出现较大的变异度与丰富的多样性。通过树状图可以看出，北京与山东的西洋参与加拿大遗传距离较近，聚为一类，而吉林省内的多个产地的西洋参与原产地相对于北京与山东两地相比在遗传距离上较远，但总的来说，由于生长特性与种植环境等相关因素的影响，使吉林省内的部分西洋参在遗传特性上受到了人参种植的影响，同时也使吉林省西洋参与加拿大、北京、山东等地在遗传特性上出现差别。

我国西洋参均属于人工栽培，并已成为我国东北三省的支柱性产业。实验结果表明，西洋参种内存在遗传变异，因此，有必要大力开展西洋参的育种工作；聚类分析显示开始有与人参混杂的趋势，因此应建立相应的良种繁育田，对保证西洋参种质资源的纯净意义重大。

[参考文献]

[1]中国药典.一部[S]. 2010：8.

[2]王林娣. 西洋参的历史溯源以及种类特征[J]. 中成药， 1999， 21（2）： 44.

[3]周婧. 西洋参质量标准的系统研究及加工方法考察[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学， 2005：1.

[4]赵英，赵国刚. 我国西洋参栽培的生态环境研究[J].农业与技术， 1995， 2：1.

[5]李向高. 西洋参的研究[M]. 北京：中国科学技术出版社， 2001：30.

[6]苏前， 吕杰，任曼丽，等. 硅胶干燥罗布麻叶片DNA提取及RAPD反应体系建立[J]. 新疆农业科学， 2013， 50（3）： 524.

[7]马小军，汪小全，蔡美琳，等. 野山参微量DNA提取方法的研究[J]. 中国中药杂志， 1999， 24（4）： 1.

[8]熊发前，蒋菁，钟瑞春，等. 目标起始密码子多态性分子标记技术在花生属的应用[J]. 作物学报， 2010， 36（12）： 2055.

[9]姜玉新，石思信，张志娥，等. 人参西洋参的基因组DNA的RAPD分析[J]. 特产研究， 1998 （1）： 5.

[10]杨天天. 栽培人参和西洋参种质资源遗传多样性研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学， 2007.

Research on genetic stability to American ginseng

introduced into China for 30 years

WEI Xiao-yu， TIAN Yi-xin*， ZHAO Zhi-ling， WEI Wei

（College of Traditional Chinese Medicine Materials， Jilin Agriculture University， Changchun 130118， China）

[Abstract] To study the genetic stability of Panax quinquefolium after introduced into China for 30 years， the samples of P. quinquefolium from 14 regions of China were studied. RAPD molecular marker technology was applied in this research， and POPGEN32 data analysis and NTSYS2.10 cluster diagram were used to analyze the data. The results showed that there are abundant genetic diversity in the ginseng samples. There were 81 polymorphic bands based on the 13 random primers. The polymorphism was 83.51%， the effective number of alleles （Ne） was 1.456 7； Nei′s gene diversity index （H） was 0.274 8； Shannon′s diversity index （Ho） was 0.419 4. The clustering analyses indicated that P. quinquefolium and P. ginseng were classified into two obvious groups， especially， it was also found that the P. quinquefolium could be divided into two obvious groups based on whether the P. ginseng was cultivated in the same region or not， but it was thought that there was not genetically a qualitative difference. Thus it suggests that a good breeding field should be established in Jilin Province of China for the germplasm purification.

[Key words] American ginseng； randomly amplified polymorphic DNA； genetic stability

doi：10.4268/cjcmm20141912