太子参药材的快速分子鉴定

[摘要]为建立一种简便快捷的太子参分子鉴定方法，对太子参药材及其混伪品的rDNA-ITS片段进行比对分析，找出特异性片段，设计太子参鉴别引物，并优选扩增条件，扩增产物经100×SYBR Green I染色后紫外光下观察。结果显示，PCR扩增反应液（包括DNA Taq聚合酶预混液5.5 μL，Tzs-2F，Tzs-2R各10 pmol，DNA模板20～80 ng，双重灭菌蒸馏水加至25 μL）经95 ℃预变性1 min，95 ℃变性5 s，56 ℃退火延伸15 s，30个循环，72 ℃后延伸30 s后，在扩增产物中加入1 μL 100×SYBR Green I混匀后于紫外光下呈绿色荧光的为太子参，混伪品无绿色荧光出现。40 min内即可完成DNA提取、扩增等整个鉴定过程。该方法能特异性扩增太子参DNA，紫外光下肉眼观察即可鉴定药材的真伪，且操作简捷、结果准确、利于推广，可为快速鉴定中药材的真伪提供参考。

[关键词]太子参；分子鉴定；特异性PCR；SYBR Green I

太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostella riaheterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺的功效，用于脾虚体倦、食欲不振、病后虚弱、气阴不足、肺燥干咳等症的治疗[1]。作为药食两用品种，太子参近年来得到了广泛的开发与利用。为牟取私利，市场上出现以淡竹叶Lophatherum gracile Brongn.、繁缕Stellaria media （L.） Cirillo、宝铎草Disporum sessile D. Don、直立百部Stemona sessilifolia （Miq.） Miq.、阔叶山麦冬Liriope platyphylla F. T. Wang & Tang、矮小山麦冬L. minor （Maxim.） Makino等植物的根或块根冒充太子参销售[2-5]。其外形与太子参较为相似，特别是加工粉碎后，药材饮片特征消失、细胞差异不明显、理化反应繁锁等等。针对这种传统鉴定方法难以准确判定的易混药材，建立一种操作简捷、结果准确可靠的新型鉴定方法具有现实价值和实践意义。

DNA分子鉴定方法是根据基因组序列进行比较研究，在很大程度上弥补和克服了传统鉴定的缺陷和难题。其中的特异性PCR是根据正品、伪品药材特定区域的DNA序列，设计有高度特异性的正品鉴别引物，此引物能有效扩增来自正品药材DNA模板中的特定区域。鉴定样品时，用鉴别引物对所提取样品的DNA进行PCR扩增，经凝胶电泳检测鉴别样品真伪[6]。但电泳过程繁琐、耗时，所用溴化乙锭（EB）试剂污染环境和危害人体健康[7]。探讨一种更安全、更灵敏的分子标记检测方法将有助于特异性PCR鉴定技术的推广及大规模样品的鉴定。

本文针对太子参及其常见混伪品（淡竹叶、繁缕、宝铎草、禾叶山麦冬、阔叶山麦冬、矮小山麦冬、直立百部、蔓生百部、对叶百部）的物种DNA，采用特异性PCR鉴定技术对DNA进行特异性片段扩增，然后在扩增产物中加入DNA核酸荧光染料SYBR Green I，紫外光下观察荧光反应的有无，从而判断太子参药材的真伪。这是一种不需要凝胶电泳操作，即可准确鉴定太子参药材的快速分子鉴定方法。

1 材料

实验材料太子参药材购于贵州施秉、安徽宣城、江苏句容、福建柘荣、山东临沂等地，共37份样本，每份样本500～1 000 g，按产地混合后四分法取100 g打粉。另收集到太子参伪品共41份，分别为宝铎草、繁缕、直立百部、蔓生百部、对叶百部、阔叶山麦冬、禾叶山麦冬、矮小山麦冬、淡竹叶，均为块根，每份样本100～200 g，按产地混合后四分法取100 g打粉。实验材料样本数及产地见表1。样品经贵阳中医学院生药教研室江维克教授鉴定。

琼脂糖（西班牙Biowestagarose）；D2 000，10 000× SYBR Green I核酸染料（北京索莱宝科技有限公司）；2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技术有限公司）；EB，2×Taq PCR MasterMix（北京天根生化科技有限公司）；Premix Ex TaqTM Version 2.0（宝生物工程大连有限公司）；其他试剂均为分析纯。

PCR仪（Mastercycler，德国Eppendof）；核酸定量分析仪（NANODROP 2000，美国Thermo）；凝胶成像系统（GGM/D2，英国SYNGENE）；电脑三恒多用电泳仪（DYY-12，北京六一仪器厂）；自动蒸汽灭菌锅（ES-315，日本Tomy）；低温高速冷冻离心机（Centrifuge 5810R，德国Eppendof）；三用紫外仪（ZF-2，上海市安亭电子仪器厂）。

2 方法

2.1 基因组DNA的提取及检测 采用碱裂解法提取各药材样品基因组DNA[8-9]，核酸定量分析仪检测DNA的浓度及纯度。用通用引物ITS2F/ITS3R[10]扩增样品DNA以验证模板DNA的质量。引物序列及PCR扩增方法见表2。DNA样品保存于-20 ℃冰箱。

2.2 PCR引物设计与特异性筛选 在NCBI（National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心）下载到太子参及其伪品物种的rDNA-ITS序列，ClustalX2.1软件进行排序、比对、分析，找出具有稳定差异的特异性片段。运用Premier Primer 5.0软件针对太子参的特异性片段设计了3对鉴别引物，分别命名为Tzs-1F/Tzs-1R，Tzs-2F/Tzs-2R，Tzs-3F/Tzs-3R，序列见表2。各引物由上海生工生物科技有限公司合成。

本实验根据引物和扩增产物的Tm及长度设置PCR扩增反应体系与扩增程序，分别用引物Tzs-1F/Tzs-1R，Tzs-2F/Tzs-2R，Tzs-3F/Tzs-3R对太子参和易混品种进行特异性扩增验证，见表2。取6 μL PCR扩增产物加入含EB的1.2%琼脂糖凝胶中，80 V稳定电压电泳1 h，紫外凝胶成像系统观察。

2.3 PCR扩增反应条件优化 利用太子参特异性引物Tzs-2F/Tzs-2R进行PCR扩增反应，方法见表2。取6 μL PCR扩增产物加入含EB的1.2%琼脂糖凝胶中，80 V稳定电压电泳1 h，紫外凝胶成像系统观察。在剩余扩增产物中加入1 μL 100×SYBR Green I，混匀后于365 nm紫外光下观察。为获取最佳扩增条件，分别对PCR扩增程序和反应体系进行优化①退火延伸温度：48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68 ℃；②退火延伸时间：5，10，15，20 s；③循环次数：25，30，35，40次；④引物用量：5，10，15 pmol；⑤DNA Taq聚合酶预混液的用量：3.5，4.5，5.5，6.5，7.5 μL；⑥太子参模板DNA用量：20，40，60，80 ng。

2.4 重复性考察 ①分别使用Mastercycler（德国Eppendof），VeritiTM 96（美国Applied Biosystems），GeneAmp9700（美国Applied Biosystems）PCR仪考察分子鉴定方法的稳定性；②分别运用2×Power Taq PCR MasterMix，2×Taq PCR Master Mix，Premix Ex TaqTM Version 2.0 3种DNA Taq聚合酶预混液考察该方法的重复性；③分别使用上海生工、北京博迈德生物有限公司合成的引物考察鉴定方法的准确性。

3 结果与分析

3.1 使用通用引物ITS2F/ITS3R对样品模板DNA进行扩增 所有样品均能有效扩增出目的条带，表明模板DNA的质量满足后续实验研究。3对太子参鉴定引物中，Tzs-2F/Tzs-2R的PCR扩增特异性较另外2对引物要好，故本文选取该引物作为太子参与伪品药材的鉴定引物，以之开展2.3项下扩增反应条件的优化，见图1。

3.2 PCR扩增反应条件优化 ①各温度下太子参样品均能有效扩增，条带的亮度随着退火延伸温度的升高先增强而后又减弱，在56～62 ℃，目的条带亮度最强，混伪品均未检测出，荧光反应结果与电泳结果一致。本文选择退火延伸温度56 ℃。②当退火延伸时间t≥10 s时，电泳检测仅太子参样品有明亮清晰的目的条带，但10 s时条带亮度稍暗，荧光反应在t≥10 s时有绿色荧光。为了保证PCR扩增效果，本文选择PCR退火延伸时间为15 s。③当循环次数在n≥30时，太子参样品扩增产物电泳有清晰的目的条带，荧光反应结果与电泳结果相似。兼顾扩增产量与时间，本文选择循环次数为30次。④当引物用量在10，15 pmol时，仅太子参样品有目的条带，荧光反应结果与电泳检测结果一致。从节约引物用量考虑，本文选择其用量为10 pmol。⑤当DNA Taq聚合酶预混液用量≥4.5 μL时，只有太子参样品扩增产物中加入1 μL 100×SYBR Green I后紫外光下呈现绿色荧光，电泳也显示有目的条带，但4.5 μL时条带亮度稍暗。本文选择PCR反应体系中DNA Taq聚合酶预混液的用量为5.5 μL；⑥20～80 ng的DNA模板用量均只有太子参样品扩增出单一的目的条带，荧光检测与电泳检测结果一致。兼顾扩增产物产量与模板DNA扩增效果的选择性，确定模板DNA用量在20～80 ng，见图2。

3.3 重复性考察 通过对不同厂家型号的3台PCR仪及3种不同厂家的DNA Taq聚合酶预混液进行扩增，结果显示样品太子参均能有效扩增出目的片段，见图2。而不同批次的引物对PCR扩增结果也无明显差异，说明本文建立的太子参特异性PCR扩增方法稳定，重复性较好，可用于太子参药材的快速鉴定。

3.4 PCR鉴别方法的建立 结合上述实验结果，确定太子参的特异性鉴定方法为：PCR扩增反应体系为25 μL，包括DNA Taq聚合酶预混液5.5 μL，Tzs-2F/Tzs-2R引物各10 pmol，DNA模板20～80 ng，双重灭菌蒸馏水补足。PCR扩增程序为：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性5 s，56 ℃退火延伸15 s，30个循环；72 ℃后延伸30 s，4 ℃保存。在PCR扩增产物内加入1 μL 100×SYBR Green I，混匀后于紫外光下检测荧光。采用该鉴别方法对不同产地的太子参药材及混伪品药材进行快速鉴定验证，太子参样品均能有效扩增，结果见图3。

4 讨论

本文采用碱提法提取各样品的基因组DNA，样品与试剂用量少，操作简便，5 min内就能完成提取过程。但由于碱提法获取的样品DNA未经洗涤、纯化等操作，为避免DNA降解，所得DNA的存放时间不宜过长。

通过比对分析太子参及其混伪品阔叶山麦冬、百部、淡竹叶等物种的rDNA-ITS序列，结果与秦民坚[11]等的研究结果一致，rDNA-ITS序列能较好地反映出太子参及其混伪品的种间差异。基于该差异，本文设计了太子参的专属引物，通过体外扩增实验验证了该引物的特异性。然后采用二温度点法进行高特异性PCR扩增，即把常规PCR的三温度点法合并为变性-退火延伸，并通过优选扩增条件，使得整个PCR过程最长不过35 min，较常规PCR扩增方法节约1～3 h。

中药材的鉴定为定性分析实验。SYBR Green I核酸染料本身在荧光下不发光，但能插入核酸内部选择性的与双链DNA的小沟结合，改变核酸的荧光特性，使其在紫外光下发出绿色荧光。因此，只要通过观察荧光反应能否发生，就可判断特异性PCR的成功与否，进而鉴定药材的真伪，省去了繁琐的电泳过程，节约成本和时间。再者，SYBR Green I的诱变性相对较低[12]，保障了实验操作人员的安全与健康。经SYBR Green I染色后的扩增产物最好在2 h内观察，避免SYBR Green I从其与DNA的复合物中分离出来，导致假阴性结果的出现。

中药材的真伪一直是生药鉴定研究重点，本文建立了一种快速鉴定太子参药材的特异性PCR方法，无需电泳过程，扩增产物经核酸荧光染料SYBR Green I染色后即可在紫外光下快速判断药材的真伪，简化了分子鉴定的操作流程，40 min内即可完成整个鉴定过程。该方法对仪器要求不高，不需电泳仪、凝胶成像系统等仪器，操作快捷易行，实用性强，可用于太子参药材快速分子鉴定的推广与应用。

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Rapid molecular identification of Pseudostellariae Radix

ZHAO Dan1， ZHOU Tao1*， JIANG Wei-ke1， YUAN Yuan2， XIAO Cheng-hong1， ZHENG Wei1

（1.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550002， China；

2.State Key Laboratory of Dao-di Herbs， Chinese Materia Medica Resource Center， China Academy of

Chinese Medicinal Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] To establish a convenient and rapid method for identification of Pseudostellariae Radix by molecular identification， the rDNA-ITS sequences of Pseudostella riaheterophylla and its adulterants had been aligned to find out specific fragment. The specific primers against the fragment were designed and the PCR amplification conditions were optimized. The fluorescence reaction of the PCR products colored by 100×SYBR Green I was observed under UV. The concentration of reaction buffer included 5.5 μL DNA Taq polymerase premix， 10 pmol Tzs-2F and 10 pmol Tzs-2R， 20-80 ng template DNA， and plus double sterile distilled water to 25 μL. The PCR thermal profile was as follows： predenaturation at 95 ℃ for 1 min， followed by 30 cycles of denaturation at 95 ℃ for 5 seconds， primer annealing and extension at 56 ℃ for 15 seconds， then it was extension at 72 ℃ for 30 seconds. The fluorescence reaction of Pseudostellariae Radix showed green fluorescence， while adulterants had not. Extraction， amplification DNA and all steps of molecular identification could be completed successfully in 40 minutes. The approach could amplify DNA template of Pseudostellariae Radix specificity， and its product with 1 μL 100×SYBR Green I could engender green fluorescence under UV. The method was simple and accurate， so it could be used for identification of Chinese traditional medicine.

[Key words] Pseudostellariae Radix； molecular identification； specific PCR； SYBR Green I

doi：10.4268/cjcmm20141906