他克莫司预防兔耳瘢痕增生的实验研究

[摘要]目的：研究他克莫司对兔耳瘢痕增生的影响。方法：选10只新西兰白兔雌雄各半，按本研究组建立的改良方法制作兔耳瘢痕模型，左耳为空白对照组涂凡士林软膏，右耳为实验组涂他克莫司软膏。伤后14天、21天、28天、35天及49天采集标本，行苏木精-伊红（HE）及Masson三色法染色，统计成纤维细胞密度，实时定量PCR（Real-time PCR）检测细胞外基质成分I型胶原（collagen I；Col I）和纤维连接蛋白（fibronectin；Fn），CD4+ 辅T细胞-2（Th2）产生的重要纤维化基因IL-4及参与T细胞早期活化的重要基因巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor；M-CSF）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα；TNF-α）的表达。结果：HE及Masson三色法染色可见实验组较对照组胶原沉积明显减少，PCR结果可见ColI、Fn、IL-4、M-CSF和TNF-α在实验组中的表达较对照组在各时间点均减少。结论：应用他克莫司可通过下调IL-4、M-CSF和TNF-α的表达来抑制兔耳瘢痕增生。

[关键词]瘢痕；免疫；他克莫司

[中图分类号]R619+.6[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）05-0756-04

Preventive effects of Tacrolimus on the rabbit ear hypertrophic scar model

HAN Xiao-xia,ZENG Hai-feng,DIAO Jian-sheng,GUO Shu-zhong,XIA Wei

(Institute of Plastic Surgery,Xijing Hospital,The Fourth Military Medical University, Xi'an710032，Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the preventive effect of tacrolimus on rabbit ear hypertrophic scar formation.MethodsTen New Zealand White rabbits were employed in this study. Ventral ear hypertrophic scar model was created according to our previous report. Experimental group contains all the right ear wounds and treated with tacrolimus ointment. The control group contains all the left ear wounds and treated with vaseline ointment. Both the groups were harvested on days 14, 21, 28, 35 and 49 post wounding. Hematoxylin-eosin staining and Masson trichrome staining were performed to reveal differences in scar morphology. Real-time PCR was adopted to evaluate the expression of ColI, Fn, IL-4, M-CSF and TNF-α.ResultsThe morphology had a large difference in the two groups. Compared with the control group, the fibroblast number in the treated group was significantly reduced (P

Key words:Scar; immune; Tacrolimus

瘢痕是皮肤全层受损后机体自身修复过程中的一种自然产物，人的大多数组织损伤均通过形成瘢痕来修复。任何类型的生物、化学或物理损伤诱发了体内连锁性的体液-细胞反应，从而导致一个以纤维蛋白起主要作用的纤维增生性炎症过程，瘢痕组织就是这种炎症过程的最终产物。瘢痕在形成过程中，出现炎症反应加重、上皮化时间延长、细胞外基质过度沉积等则容易形成增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩，往往给患者带来多种不便，严重时会引起器官及肢体功能障碍，甚至毁容[1]。瘢痕已成为整形外科领域最常见疾病。

瘢痕形成受多种因素影响，包括体外及体内因素。体外因素包括种族、部位、年龄、家族、受损伤程度等；体内因素包括内分泌、生物化学因素及免疫因素等。而我们推测，免疫因素可作为体内因素中最重要的因素之一。已证实瘢痕的形成与免疫因素密切相关[2-3]，瘢痕患者外周血中T细胞增多，局部组织中T细胞的亚群构成变化，CD4+T细胞(Th)增多，CD8+T细胞(Ti)减少。为进一步研究其免疫作用发生机制，我们检测细胞外基质成分I型胶原（ColI）和纤维连接蛋白（Fn），CD4+辅T细胞-2（Th2）产生的重要纤维化基因IL-4及参与T细胞早期活化的最要基因巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的表达，探讨T细胞在增生性瘢痕形成中所发挥的作用。

1实验材料和方法

1.1 实验动物：健康新西兰大耳白兔10只，由第四军医大学实验动物中心提供，体重2.5～2.8kg，雌雄各半。

1.2 实验材料：0.1%他克莫司软膏（普特彼，FK506）购自藤泽药品有限公司（Astellas Pharma Manufacturing,Inc.）。Masson三色染色试剂购自珠海贝索生物技术有限公司（BA-4079A）。ColI、Fn、IL-4、M-CSF及TNF-α引物由上海生工生物工程有限公司合成。RNA提取试剂盒购自AnMei Biotechnology公司（AMR1001）。反转录试剂盒、纯化扩增试剂盒及荧光定量试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司（TaKaRa Code: DRR037A,DRR025A,DRR081A）。

1.3 实验方法

1.3.1 根据Morris[4]和李荟元[5]报道的兔耳增生性瘢痕模型创建方法建立并加以改良。3%戊巴比妥钠1.5mg/kg耳缘静脉麻醉后，在无菌条件下，双侧兔耳腹侧各做4个直径1cm、间距约2cm的圆形全层皮肤缺损创面，位置对称，去除软骨膜，电凝止血。术后创面暴露，待其自行愈合。14天后开始加药，每只兔的右耳为实验组，创面表面涂他克莫司软膏，每日两次；左耳为空白对照组涂等量凡士林软膏。

1.3.2 术后第14、21、28、35及49天取材，随机处死2只兔子，沿创面边缘扩大0.5cm环行切取瘢痕组织。每个标本沿垂直于瘢痕最凸起点处纵行切开，分为两半，其中一半即刻以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，行苏木素-伊红（HE）染色，在400倍光镜下观察HE 染色切片，每张切片于真皮层随机选取5个视野，统计单位面积内成纤维细胞的密度；另一半提取mRNA行PCR检测。

1.3.2.1 Masson三色染色，在40倍光镜下观察Masson三色染色切片。

1.3.2.2 Real-time PCR检测细胞外基质成分ColI和Fn，Th2产生的重要纤维化基因IL-4及参与T细胞早期活化的重要基因M-CSF和TNF-α的表达。引物由上海生工合成，设计如表1所示，Tm值设定为60℃。将各时间点瘢痕标本，提取RNA，反转录为cDNA，进行Real-time PCR的检测。采用SYBR GreenⅡ染料在MJ Research Option 2荧光定量PCR仪上检测目的基因的表达。Real-time PCR反应体系20μL。PCR反应条件：激活95℃，10min；40循环，变性95 ℃，30 s；退火55℃，30 s，延伸72℃，60 s。扩增完毕后，进行熔解曲线分析，95℃，1 min，50℃，1 min，以0.10℃/s的速度升温到95 ℃，连续监测荧光。扩增结束后分析熔解曲线，在熔解曲线上以具有单峰判断PCR扩增的单一性。同时设无模板对照，每份标本行2次Real-time PCR检测，取平均值。对cDNA模板进行倍比稀释，以2X,1X,0.5X,0.25X四个浓度梯度的cDNA模板进行Real-time PCR扩增。将不同浓度模板的对数和相应到达阈值的循环数（Ct）值作图，做标准曲线。基因mRNA表达采用直线相关回归分析，GAPDH的表达量作为内参照，分析目的基因的相对表达量。

1.3.3 实验结果均以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS11.5软件进行t检验处理数据，P

2实验结果

2.1 成功复制兔耳增生性瘢痕模型：上皮化的时间为（14±1.25）天，无创面感染、分泌物增多等现象，实验动物饮食生活正常。伤后（21±1.96）天，可见他克莫司软膏组实验组较凡士林软膏空白对照组瘢痕增生程度明显减轻，空白组瘢痕明显突出，色红，质硬，创面中心处为增生最严重处，伤后（28±1.83）天达到高峰。

2.2 HE染色：可见伤后第28天、35天及49天实验组较空白组成纤维细胞密度明显减少（如表2、图1）。

2.3 Masson三色染色：Masson三色染色则可见空白组胶原纤维结构较实验组致密，粗大，且异常沉积，颜色呈深蓝色（如图2）。

2.4 Real-time PCR检测：Real-time PCR分析可见他克莫司对细胞外基质成分ColI和Fn，Th2产生的重要纤维化基因IL-4及参与T细胞早期活化的最要基因M-CSF和TNF-α的表达均有明显抑制作用，两组中空白组ColI的表达在伤后21天达到高峰，Fn的表达在伤后第28天达到高峰，IL-4、M-CSF和TNF-α表达均在伤后第35天达到高峰，但实验组表达明显较低，其差异P

3讨论

3.1 在创面愈合过程中，早期大量单核细胞浸润，包括巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞、淋巴细胞及浆细胞聚集，形成增生性瘢痕的分子机制十分复杂。这些细胞在形成增生性瘢痕过程中发挥的作用并不十分明确，但无疑免疫细胞在其中发挥了十分重要的作用。免疫细胞以T淋巴细胞为主，其中创伤愈合早期淋巴细胞以CD4+Th2细胞为主[6]，在抗原刺激下，分泌细胞因子激活巨噬细胞，同时巨噬细胞分泌细胞因子可作用于淋巴细胞，刺激其分泌。其中IL-4、IL-5及IL-13等因子分泌大量增加，TGF-β分泌亦显著增加，由CD4+ Th1细胞分泌为主的IL-12和IFN-γ表达量则很低。CD4+Th2及其分泌的IL-4、IL-5和IL-13与纤维增生过程则有着紧密联系[7]。晚期CD4+ Th2细胞逐渐减少，CD4+ Th1细胞逐渐增加，CD4+ Th2和CD4+ Th1在胶原合成中作用相反[8]。也有学者研究发现局部应用环孢菌素A治疗瘢痕疙瘩时，瘢痕组织中T淋巴细胞明显减少，并显著抑制了成纤维细胞的活性，从而抑制了瘢痕疙瘩的生长[9]。

3.2 已有研究发现，他克莫司软膏作为临床上常用的免疫抑制剂应用于创面早期，可有效预防兔耳瘢痕增生[10]。但是其机制尚不明确，为进一步了解增生性瘢痕形成的机制，我们选择他克莫司软膏进行伤后创面早期干预。他克莫司为免疫抑制性大环内酯类药物，在皮肤科应用广泛，已被证实可以抑制T淋巴细胞活化，临床上可以用来治疗激素效果不佳的特应性皮炎。亦有文献报道，他克莫司软膏用于瘢痕疙瘩治疗，可以显著减轻其症状[11]。

3.3 本实验通过形态学观察，成纤维细胞密度统计及Real-time PCR检测结果发现，实验组瘢痕增生明显减轻，证实了伤后早期给予免疫抑制剂，可以有效预防瘢痕增生。但是其何时开始用药，仍未十分明确。过早使用可抑制创面愈合，过晚使用则无法有效阻止CD4+ Th2过度聚集。我们推测，如应用于人体，可在缝合拆线后开始使用，在瘢痕好发部位使用效果更佳。同时，用药疗程也值得进一步研究。本实验提出早期创面使用免疫抑制剂可以抑制瘢痕增生，并给予证实，有助于瘢痕增生机制的阐明，是增生性瘢痕预防及治疗的一种全新思路，具有非常良好的应用前景，很值得做更广泛和更深入的研究。

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[收稿日期]2011-03-10 [修回日期]2011-04-21

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