骨髓间充质干细胞对自然衰老小鼠T细胞的调节作用研究

[摘要]目的：研究探讨小鼠骨髓间充质干细胞对自然衰老小鼠T细胞的节作用影响情况。方法：通过流式细胞术研究对比衰老小鼠和年轻小鼠T细胞培养48h后CD8+CD28+的共表达率差异，根据以上研究结果分别对比隔离共培养组、混合共培养组和对照组之间T细胞上CD8+CD28+的共表达率差异。结果：实验一中衰老组培养48h后CD8+CD28+共表达率为（4.08±0.3493）%，年轻组培养48h后CD8+CD28+共表达率为（5.04±0.5741）%。两者相比有统计学差异（P

[关键词]骨髓间充质干细胞；T淋巴细胞；免疫衰老；流式细胞术

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）05-0761-04

Study on effect of bone marrou mesenchymal stem cells on aging mouse T cells regulation

ZHANG Lei1,SHI Bing-bing1,ZHOU Bi-yu2,YAN Li1,LI Yan1,CAO Yi-mei2,ZHAO Zhen-min2

(1.Research Center,2.The First Department,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College,Beijing 100144,China)

Abstract:ObjectiveThis is a study on effect of mouse BM-MSCs on aging mouse T cell regulation. Methods There were two groups in experiment one, aging group and young group ,the difference of CD8+ CD28+ expression between the two groups were detected with flow cytometry,according to the result ofexperiment one, the difference of CD8 CD28 expression of separated co-culture group, mixed co-culture group and control group,which were called experiment two,was detected with flow cytometry. ResultsIn the aging group of experiment one,the CD8+ CD28+ expression was （4.08±0.3493）%.the CD8+ CD28+ expression of young group was （5.04±0.5741）%.There was a statistical difference.In the separated co-culture group of experiment two,we co-cultured BM-MSCs and lymphocyte in accordance with the proportion of 1:1，and the CD8+ CD28+ expression was （10.26±1.0784）% after 48 hours. In the mixed co-culture,we mixed BM-MSCs with lymphocyte in 6 wells plate in accordance with the proportion of 1:1,and the CD8+ CD28+ expression was （6.42±1.5680）% after 48 hours.In control group,the lymphocyte was clutured alone,and the CD8+ CD28+ expression was （4.08±0.3493） % after 48 hours.There was a statistical difference.ConclusionThere were difference ofCD8+ CD28+ expression between aging mouse and young mouse.BM-MSCs can take aging T cells to young state.

Key words:bone marrow mesenchymal; stem cell T; lymphocytes ageing; flow cytometry

衰老对于整形外科来说，主要集中在皮肤、皱纹等，其实就机体而言衰老是随年龄的增长使生物体在细胞、组织、器官的形态结构和生理功能等方面出现的退行性变化过程，其特点是慢性和进行性。衰老是生物体代谢积累的必然阶段，最后转归无一例外都是死亡。Wolford在20世纪60年代首先提出免疫衰老的概念，并且说明免疫系统的衰老是机体衰老的关键环节，参与机体其他系统衰老的发生。虽然免疫衰老的机制到目前为止还不是特别清楚，但是大多数学者都认为免疫衰老和老化个体的胸腺退化有很大关系[1-2]。胸腺是人体内最大的免疫器官，T细胞的发育和成熟都在其内完成，胸腺的退化导致幼稚的T细胞无法补充死亡和凋亡的成熟T细胞，从而细胞免疫低下，紧接着体液免疫也会降低，在一些个体表现为容易罹患感染、肿瘤等疾病。免疫衰老是人类解决衰老问题的最大障碍，而T细胞衰老则又是免疫衰老的关键，因此对T细胞衰老的研究就显得非常重要。

对于T细胞的衰老特点目前已经进行了深入研究，除了衰老T细胞比年轻T细胞容易诱发凋亡外[3]，有学者发现T细胞表面标记更能区别衰老和年轻的状态，已经有报道的是对于衰老个体而言，CD8+CD28+T细胞比例下降[4]，CD4+CD25+的调节性T细胞比例升高[5]。这些可能是引起衰老个体免疫力低下的主要原因之一。CD28是目前比较公认的衰老标记。

间充质干细胞（MSCs）是一类成体干细胞，几乎在所有的组织中例如骨髓、肌肉、脂肪、真皮、肝脏甚至牙髓中都发现了这种干细胞的存在[6]，研究最多的是骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）。

目前人们对骨髓间充质干细胞的生物学特性和作用的研究逐步深入。它不仅具有强大的自我更新能力，同时它还具有成骨、成软骨、成脂肪[7-8]、成肌[9]等向中胚层组织细胞分化的潜能，甚至具有向神经样细胞[10-11]等跨胚层分化能力。本实验拟在研究小鼠骨髓间充质干细胞对正常衰老小鼠的T细胞的调节作用，为下一步深入探讨骨髓间充质干细胞对衰老的调节作用奠定基础。

1材料和方法

1.1实验动物：C57BL/6N小鼠12月龄15只，雌性，体重约30g。C57BL/6N小鼠6～8周龄5只，雌性，体重约20g。以上动物均为SPF级动物。

1.2仪器、试剂：CO2细胞培养孵箱（日本Hirasawa Works 公司）、Biofuge离心机（德国Heraeus公司）、Transwell培养皿（美国corning公司）、FACS Aria流式细胞仪（美国BD公司）、RPMI1640培养基（美国Hyclone公司）、DMEM/F12培养基（美国Hyclone公司）、特级胎牛血清（美国Gibco公司）、PE-anti-mouse CD8（美国biolegend公司）、FITC-anti-mouse CD28（美国biolegend公司）、小鼠淋巴分离液（中国医学科学院生物工程研究所）、200目细胞筛、10ml玻璃注射器。

1.3方法

1.3.1BM-MSCs细胞培养和传代：BM-MSCs购自于广州Cyagen公司，取自6～8周C57BL/6N雌性小鼠第六代细胞，先将BM-MSCs复苏，移入10cm培养皿中，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基10ml，细胞融合70%～80%后传代，取出第九代细胞计数后，分成每106一份，10份备用。

1.3.2小鼠淋巴细胞悬浮液制备：麻醉小鼠，用碘汀消毒酒精脱碘后，断颈处死小鼠左下腹部剪开皮肤进入腹腔，分离出脾脏，PBS冲洗两遍，放到200目细胞筛上用10ml玻璃注射器内芯进行研磨，研磨后用RPMI1640培养基冲洗两边，放入5ml小鼠淋巴细胞分离液中，2 500rpm、20min慢加速慢减速离心，吸取第二层白色浑浊层，加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基10ml，1 500rpm、10min离心，移去上清，用15%胎牛血清的RPMI1640培养基10ml重新悬置，细胞计数后备用。

1.3.3分组和处理

1.3.3.1 实验一：①衰老组：五只12月龄的不同小鼠的106淋巴细胞放入培养皿加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基培养；②年轻组：五只6～8周龄的不同小鼠的106淋巴细胞放入培养皿加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。

1.3.3.2 实验二：①隔离共培养组：BM-MSCs与淋巴细胞以1:1比例放入Transwell系统，淋巴细胞取自不同的五只小鼠，加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基共培养；②混合共培养组：BM-MSCs与淋巴细胞以1:1比例放入六孔板中，淋巴细胞取自不同的五只小鼠，加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基共培养；③对照组：五只不同小鼠的106淋巴细胞放入培养皿加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。

1.3.4检测：以上实验组和对照组在37℃、5% CO2细胞培养孵箱里培养48h后，吸出淋巴细胞，离心后加入100μl细胞染色缓冲液，隔离共培养组、混合共培养和对照组加入PE-anti-mouse CD8、FITC-anti-mouse CD28。4℃孵育40min，细胞染色缓冲液冲洗两遍，用流式细胞仪检测。

1.3.5 统计学方法：采用SPSS 13.0统计软件，所有数据用(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验。P

2结果

2.1 培养48h后衰老小鼠CD8+ CD28+ T细胞比例为（4.08±0.3493）%，低于年轻小鼠CD8+ CD28+ T细胞比例为（5.04±0.5741）% ，两者相比P

2.2隔离共培养组的CD8+ CD28+ T细胞比例为（10.26±1.0784）%，与对照组（4.08±0.3493）% 相比有显著提高，P

3讨论

3.1 骨髓间充质干细胞具有的免疫调节的作用目前备受关注。通过在体外的共培养，现在已经发现骨髓间充质干细胞可以将DC细胞转化成一种全新的DC细胞[12]，还有学者发现BM-MSCs对巨噬细胞也有强大的调理作用[13]，甚至还有学者将骨髓间充质干细胞与各种免疫细胞共培养，骨髓间充质干细胞都可以发挥其自身的免疫调节作用[14]。

3.2 对于本实验我们首先要说明的是：①12月龄的小鼠相当于人年龄的40～50岁，6～8周龄相当于人15～20岁；②实验所用的脾细胞为混合的淋巴细胞，脾细胞主要由B细胞和T细胞组成，其中T细胞大概有40%，CD8和CD28仅在T细胞上共表达，我们并没有将T细胞从这种混合淋巴细胞中独立分离研究主要是因为在体内T、B细胞是混合在一起的，虽然我们是在体外研究BM-MSCs对衰老的影响，但是我们还是想尽量模仿体内的环境状态，了解在其他细胞的参与下BM-MSCs是否可以发挥对衰老T细胞的影响作用；③整个实验并没有加入有利于促进T细胞生长增殖的IL-2、anti-CD3、anti-CD28，因为这些因素可能会引起实验误差；④ T细胞的活化必须由两个信号的传入完成，第一个是T细胞表面的CD3-TCR与抗原递呈细胞的MHC分子结合，此为第一信号；第二个是T细胞表面的CD28与抗原递呈细胞表面的B7分子结合，此为第二信号，这两个信号缺一不可，来自CD28第二信号的缺乏将导致免疫无能[15]；⑤实验一仅仅是为实验二提供可靠的实验依据，经过研究发现培养48h后衰老小鼠的CD8+CD28+共表达率低于年轻小鼠，这表明CD8+CD28+的共表达是可以作为小鼠衰老的指标的，这也和其他学者的研究基本相符。在此仍需说明的是衰老小鼠和年轻小鼠的这种差异并没有直接检测而是在48h后进行检测的，这是因为没有IL-2、anti-CD3、anti-CD28 T细胞在培养中必然会发生凋亡，为了实验的准确性，我们选择和实验二同样条件下对这些指标进行检测。实验二的目的就是想通过研究骨髓间充质干细胞对衰老T细胞表面标记CD8+CD28+共表达的影响作用，为下一步对免疫老化的研究打下基础。结果表明，BM-MSCs可以有效的提高衰老T细胞表面的CD8+CD28+的共表达率。换句话说，骨髓间充质干细胞让衰老的T细胞变“年轻”了，至少可以说骨髓间充质干细胞使得T细胞的CD8+CD28+的共表达变得类似于“年轻态”，虽然机制不明，但是通过隔离共培养组的研究发现，骨髓间充质干细胞的某些细胞因子可能起了至关重要的作用。

3.3 众所周知，细胞和细胞之间的直接作用有时候会很重要，但实验中我们发现，当把骨髓间充质干细胞和淋巴细胞混合培养的时候，并没有出现比隔离共培养组更显著的增加，恰恰相反的是，虽然混合共培养组T细胞比对照组的T细胞CD8+CD28+的共表达率有所增加，但是与隔离共培养组比较CD8+CD28+的共表达率却有所下降，笔者认为可能有两个原因，第一：有研究报道BM-MSCs表面表达MHCI类分子，不表达MHCⅡ类分子，这也说明BM-MSCs的低免疫原性[16]；而本实验检测的T细胞表面的CD8在抗原递呈中识别的就是MHCI类分子，所以有可能在混合共培养组中，CD8提前被“封闭”，由此导致的检测CD8+CD28+共表达率下降；第二：可能BM-MSCs的这种低免疫原性还远没到可以忽略的地步，因此当同种异基因的BM-MSCs和T细胞混合共培养的时候，可能会激活细胞免疫，引起T细胞的破坏，从而导致检测率降低。那么，BM-MSCs是否可以使单独的衰老的T细胞的CD8+CD28+共表达升高，同时在体内是否也具有使衰老T细胞年轻的作用，这还有待于进一步研究。

综上所述，骨髓间充质干细胞可以使衰老T细胞变“年轻”。虽然机制还不清楚，但是在抗衰老方面必将拥有广泛的研究前景。

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[收稿日期]2011-03-11 [修回日期]2011-04-26

注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”