改善液体辅助表面解吸常压化学电离质谱成像空间分辨率的研究

摘 要 液体辅助表面解吸常压化学电离源（LA-DAPCI）通过电晕放电产生的初级离子和高密度带电液滴，能够对样品表面的中性待测物进行解吸电离，该离子源具有较高的离子化效率，适合复杂基体样品的质谱成像研究。为了满足质谱成像对空间分辨率的要求，本实验通过优化离子源结构、萃取剂组成、萃取剂流量、载气流速、离子源的几何位置参数等实验条件，有效提高了LA-DAPCI源的空间分辨率（从（441±14） μm提高到（58±7） μm）。应用LA-DAPCI-MS/MS方法对罗丹明6G进行测定，检测限为0.01 ng/cm2，实验结果令人满意，为其应用于复杂基体样品的质谱成像研究提供科学依据。

关键词 表面解吸常压化学电离； 空间分辨率； 质谱成像

1 引 言

表面解吸常压化学电离源（Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization， DAPCI）是一种直接离子化技术。DAPCI源通过电晕放电产生初级离子，通过分子离子反应传递电荷和能量，使样品中的待测物电离[1～3]。DAPCI与低温等离子体（Low-temperature plasma， LTP）探针[4，5]、空气动力辅助离子化技术（Air flow assisted ionization， AFAI）[6]等技术类似，也可用于表面质谱成像研究[7～10]。前期研究获得的DAPCI质谱成像的空间分辨率分别为250 μm×250 μm[7]，450 μm×450 μm[8]，140 μm×140 μm[9]和500 μm×500 μm[10]。

液体辅助表面解吸常压化学电离源（Liquid assisted-surface desorption atmospheric pressure chemical ionization， LA-DAPCI）是一种改进型的DAPCI离子源[11]。LA-DAPCI一方面通过电晕放电的形式产生高密度试剂离子，用于对样品的电离和使喷雾雾滴带电；另一方面通过喷雾液滴对待测表面的碰撞、萃取等作用，增加DAPCI解吸能力，适用于对大分子[12]和基体吸附强度较高的待测物[13]的解吸电离，尤为适合组织切片等复杂基体样品的质谱成像研究。离子源的空间分辨率直接关系到质谱成像的质量和图像清晰度[14，15]。因此LA-DAPCI源用于质谱成像实验，需要满足一定的空间分辨率要求。

本研究通过观察并测量离子源作用于样品表面的解吸电离区域，优化毛细管直径、喷口处两层毛细管和放电针的相对位置、萃取剂组成和流速、载气流速、离子源的几何位置等参数，达到提高LA-DAPCI源的空间分辨率和解吸能力的目的，旨在满足质谱成像研究对离子源空间分辨率的要求。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

LTQ-XL增强型离子阱质谱仪（美国Finnigan公司），配有Xcalibur 数据处理系统；电移台及SC系列步进电机控制器（北光世纪仪器有限公司），配有绝缘样品承载台；中空纤维过滤器（美国Thermo Scientific公司）；LA-DAPCI离子源（东华理工大学自主研制[16]）。

罗丹明6G（含量>95%，SIGMA公司）；超纯水（Barnstead Nanopure，18.2 MΩ・cm， Thermo Scientific公司）；甲醇（HPLC级，ROE Scientific Inc公司）。pH试纸（B-广泛试纸， 上海三爱思试剂有限公司）； 定性滤纸（抚顺市民政滤纸厂）。

2.2 实验条件

离子源：载气（N2）压力0.8～1.6 MPa、萃取剂为甲醇/水溶液，萃取剂流速1～5 μL/min，离子源放电针与水平面夹角为30°～65°，放电针针尖到质谱进样口的距离为3～8 mm，放电针针尖到待测样品表面距离0.5～3.0 mm。

正离子扫描模式，离子源电压4.5 kV，质量扫描范围m/z 120～500，离子传输管温度为150℃，其它参数由系统自动优化。在LA-DAPCI-MSn扫描时，母离子选择宽度为1.0 Da，碰撞能量为20%。

2.3 实验方法

用罗丹明6G溶液（1 μg/mL）浸湿滤纸条，让滤纸自然晾干，用双面胶粘在载玻片上，保持平整。将载玻片固定在三维移动平台上，置于离子源下，沿三维移动平台的x方向（垂直于罗丹明6G带状区域边界的方向）移动进样，移动速率1.492 mm/min，并记录特征碎片离子m/z 415的离子流图。

3 结果与讨论

3.1 解吸电离区域的观察

LA-DAPCI源产生的喷雾液滴直接作用于样品表面，解吸电离区域可以较为直观地观察到。在正离子模式下，LA-DAPCI源解吸电离pH试纸表面一段时间，观察pH试纸表面的变化并用相机记录，变色结果如图1所示。

在载气的作用下，电晕放电产生高密度的带电液滴从放电针针尖呈圆锥状喷射在pH试纸表面，形成近似圆形的斑点，解吸电离时间约1 min。由图1可见，只有斑点的中心区域有颜色变化，是pH试纸上的有色物质被甲醇-水溶解、萃取，并从试纸表面解吸电离，变成气相离子，离开滤纸表面，导致颜色变浅； 而斑点只是滤纸被喷雾打湿或喷雾从斑点中心向外扩散的结果，并没有将试纸上的有色物质解吸出去，故未见颜色变化。此现象表明， LA-DAPCI源作用于样品表面的圆形喷雾斑点中只有中心部分为有效解吸电离区域。

由于带电液滴喷射到样品表面后，会在表面上发生扩散，萃取周围的有色物质，故解吸pH试纸实验直接观察到的斑点褪色区域应大于样品表面待测物被有效解吸电离的区域。因此，需要设计更精细的实验对解吸电离区域的直径进行测定。

3.2 LA-DAPCI离子源空间分辨率测定

3.2.1 罗丹明6G标准溶液的定性分析 罗丹明6G作为生物染料，常用在解吸电喷雾电离源（Desorption electrospray ionization， DESI）分辨率实验中作为标志物。在正离子模式下，罗丹明6G分子易质子化形成[M+H]+准分子离子，得到质谱峰m/z 443。采用串联质谱对罗丹明6G进行定性分析，母离子m/z 443在二级质谱中丢失C2H4，产生特征碎片离子m/z 415（图2），碎片离子m/z 415在三级质谱中丢失CH3， C2H5和HCOOC2H5，产生碎片离子m/z 400， 386和341（图2插图），与文献[17]结果一致。

3.2.2 LA-DAPCI离子源空间分辨率测定

依据图1实验结果，纸片表面能够被解吸电离的区域为圆形区域。图3中圆形斑点代表LA-DAPCI源作用于样品表面，使待测物有效解析电离的区域。质谱沿X方向以约20 μm步距扫描滤纸条带，当有效解吸电离区域刚接触到待测物时，信号m/z 415在谱图中出现，此位置记录为零点；扫描到有效解吸电离区域刚好离开分析物时，信号m/z 415消失的位置记录为进样终点；

零点和终点间的移动的距离定义为L。圆形解吸区域的直径（r1+r2）等于距离L减去罗丹明6G滤纸条带宽度w，即r1+r2=L-w。其中，L可通过质谱检测到罗丹明6G信号的时间乘以样品台移动速率计算得到， w可用游标卡尺直接测得。从扫描结果还可看出，随着扫描次数增多，被解吸的罗丹明6G增多，滤纸上罗丹明6G剩余量减少，离子强度递减。

在本实验中， w测量3次，分别为2700， 2720和2700 μm，平均值为2707 μm；L测量5次，分别为3133， 3148， 3163， 3148和3148 μm，平均值为3148 μm，因此r1+r2=L-w=441 μm。结果表明，在本实验条件下测量滤纸条带表面，LA-DAPCI源有效解吸电离区域直径约为（441±14） μm（置信度95%），LA-DAPCI离子源的空间分辨能力尚不及常规DESI源（200 μm[18]），不能满足对复杂基体样品进行质谱成像研究的空间分辨率要求，需要对实验条件进行改进。

3.3 LA-DAPCI离子源空间分辨率的优化

3.3.1 LA-DAPCI离子源尺寸优化 减小放电针针尖直径、载气和通液毛细管直径可显著提高LA-DAPCI离子源的空间分辨率，且不会导致灵敏度下降[13]。因此，实验使用直径为0.04 mm放电针（放电针外绝缘层厚约0.01 mm），内径0.10 mm、外径0.20 mm的通液毛细管，内径0.25 mm、外径0.40 mm的载气毛细管，制作LA-DAPCI离子源，如图4所示。使用3.2.2节的方法测定离子源空间分辨率，结果见表1。改进离子源尺寸后，空间分辨率从（441±14） μm提高到（137±13） μm（置信度95%）。

3.3.2 两层毛细管和放电针针尖相对位置优化 文献[17]报道，LA-DAPCI源喷口处设计为放电针针尖伸出内层毛细管，内层毛细管伸出外层毛细管的形状可以在形成良好喷雾的同时，能够较好的发生电晕放电，具有最好的离子化效率。本实验对两层毛细管前端距离d1与内层毛细管前端和针尖的距离d2进行优化。如图5a所示，固定d2=0.5 mm，当d1在0～1.0 mm范围内变化时，空间分辨率随d1先升高后降低，当d1=0.5 mm时达到最优值138 μm。如图5b所示，固定d1=0.5 mm，当d2在0～0.7 mm范围内变化时，空间分辨率随d2先升高后降低；当d2>0.8 mm时，测得斑点直径

3.3.3 甲醇/水萃取剂中甲醇比例优化 使用不同比例的甲醇/水溶液（0～100%）作为萃取剂，按3.2.2节的方法测定离子源分辨率，每个条件测定5次，结果如图6所示。当甲醇比例在0～75%范围内，空间分辨率随甲醇比例升高而提高；当甲醇比例高于75%后，分辨率不再随甲醇比例升高而发生明显变化，其中甲醇比例为75%时，测得空间分辨率最高，为（59±10） μm （置信度95%）。因为使用高比例甲醇作为萃取剂，大部分萃取剂在喷雾过程中蒸发成为气相带电离子，在样品表面几乎观察不到解吸斑点，此时LA-DAPCI源的空间分辨率类似于仅有气体辅助的DAPCI源空间分辨率。因此在75%～100%范围内，即使提高甲醇比例，也不会提高空间分辨率，而是保持在一定水平。

3.3.4 萃取剂流速和载气压力优化 适当降低萃取剂和载气流速可以提高离子源的空间分辨率，但必须保证在此条件下可以获得稳定而细密的喷雾，并且有足够的萃取剂喷射到样品表面来解吸/萃取待测物，以保证灵敏度。本实验对萃取剂流速为1～5 μL/min、氮气压力为0.8～1.6 MPa时的LA-DAPCI源的空间分辨率进行测定，每个条件测定5次。

萃取剂流速为1 μL/min和2 μL/min时，改变氮气压力0.8～1.6 MPa，二级质谱无持续的m/z 415进样峰，因喷射到样品表面的萃取剂量少，不能在样本表面形成液膜。萃取剂流速为3～5 μL/min，氮气压力为0.8～0.9 MPa时，二级质谱无持续m/z 415进样峰，因为氮气压力过小，载气对喷雾的干燥作用弱。在以上条件下，目标物离子强度太低，无法观察到完整进样过程，未在曲线图中标出。

萃取剂流速分别为3，4和5 μL/min时，LA-DAPCI源的空间分辨率随氮气压力变化曲线如图7所示，3条曲线的变化趋势相同，在1.0～1.6 MPa范围内，空间分辨率随氮气压力增加先升高后降低。氮气压力较小，形成的喷雾液滴较大，湿润样品表面的同时不能及时蒸发；氮气压力较大，会将喷雾吹得太散。氮气压力相同，萃取剂流速不同时，萃取剂流速小的空间分辨率更高，因为在相同的载气流速下，喷雾量小，形成的解吸斑点小。故萃取剂流速为3 μL/min，氮气压力为1.2 MPa时分辨率达到最优值，为（59±10） μm（置信度95%）。

3.3.5 离子源空间参数优化离子源的空间参数（放电针与水平面夹角、放电针针尖到质谱口距离、放电针尖到样品表面距离）直接影响离子源作用于样品表面的喷雾量以及质谱能检测到的响应信号。采用单因素条件优化方法，按3.2.2节方法测定离子源空间分辨率，实验结果如图8所示。

调节放电针与水平角度为30°～65°，当角度为50°时达到最优值59 μm（图8a）。调节放电针针尖到质谱口距离为3～8 mm，当距离为5 mm时达到最优值60 μm（图8b）。调节放电针针尖到样品表面距离为0.5～3.0 mm，在2.0 mm处到达最优值57 μm（图8c）。当针尖与样品表面的距离为3 mm时，大部分喷雾在到达样品表面前已蒸发，不足以在样本表面形成液膜，解吸/萃取能力弱，故目标物离子强度太低，在曲线图中未标出。当放电针针尖距离样品表面过近时，喷雾来不及干燥，大量液滴将样品表面打湿，不但不利于待测物的解吸电离，反而导致表面的分析物移位，解吸斑点较大，分辨率较低。

3.3.6 LA-DAPCI源和DESI源空间分辨率对比 LA-DAPCI源与Cooks 等[19]提出的DESI源 （Desorption electrospray inonization）不同，DESI源直接通过电喷雾产生带电的试剂液滴，而LA-DAPCI源主要是通过内置的放电针尖端电晕放电产生初级离子和带电的试剂液滴。相同条件下，LA-DAPCI源比DESI源具有更强的解吸电离作用。因此，本实验在相同条件下对LA-DAPCI源和DESI源的空间分辨率进行了对比研究。使用优化过的离子源和实验条件，对LA-DAPCI源和DESI源（Ion source peak series R1.0通用喷头[20]，通液毛细管内径0.10 mm，外径0.20 mm，载气管内径0.254 mm）的空间分辨率进行测定。各使用两张罗丹明6G滤纸条带按3.2.2节方法测定两种离子源空间分辨率10次（每张纸带测定5次），实验结果见表2。

两张纸条的测量结果显示，不同纸条测定分辨率不会引入较大误差。置信度95%时，LA-DAPCI源在本实验条件下测量表面的解吸电离区域直径为（58±7）μm，DESI源的空间分辨率为（191±16）μm。本实验测得DESI源的空间分辨率结果与文献报道的常规DESI离子源（通液毛细管内径0.05 mm，外径0.15 mm，载气管内径0.25 mm）[21]得到的空间分辨率结果（150～250 μm）[18，21，22]相似。在此条件下，LA-DAPCI源具有较好的空间分辨能力，能够胜任复杂基体表面样品的质谱成像研究。

LA-DAPCI源或DESI源的分辨率的提高与多项实验参数（毛细管内径、气体流速、萃取剂、空间距离等）相关，例如，减小载气管和通液毛细管的内径，可以在一定程度上提高分辨率。Vilmos等[23]通过精细调节DESI源（通液毛细管内径0.05 mm，外径0.36 mm，载气管内径0.5 mm）的各项实验参数获得的最佳分辨率达到40 μm。与文献[23]中DESI源使用的通液毛细管相比，本实验采用的通液毛细管内径较大（通液毛细管内径0.1 mm）。如果进一步减小通液毛细管的内径，LA-DAPCI源的空间分辨率还有提高的空间。

3.4 方法的线性范围和检出限 配制系列浓度罗丹明6G标准溶液（0.1， 0.5， 1， 5， 10， 50， 100， 500和1000 μg/L），移取0.8 mL标准溶液浸湿相同大小的滤纸片（3.7 cm×2.1 cm），

干燥后在最优工作条件下进行质谱分析，以m/z 415作为定量碎片离子，使用LA-DAPCI-MS/MS方法定量，罗丹明6G在浓度范围0.01～102.96 ng/cm2内具有良好线性，标准曲线见图9。信号强度与浓度的回归方程为y=1.6508x+0.2957，R2=0.9994，RSD为2.0%～8.3%。 当S/N=3 时，根据公式 LOD=3σ/S计算，得出本方法的LOD为0.01 ng/cm2。

4 结 论

本研究对LA-DAPCI离子源的解吸区域进行观察，并测定离子源的空间分辨率。通过减小毛细管直径，更改萃取剂组成，调整萃取剂流速和载气流速，优化离子源的几何位置，获得LA-DAPCI源的最佳空间分辨率为（58±7）μm（置信度95%）。LA-DAPCI-MS/MS方法检测罗丹明6G的检测限为0.01 ng/cm2。较高的空间分辨率和较低的检测限赋予了LA-DAPCI源应用于研究复杂基体样品质谱成像的潜能。

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