骨髓单个核细胞和骨髓基质干细胞治疗股骨头坏死的疗效比较

【摘要】

目的 分别观察骨髓单个核细胞复合异种骨、骨髓基质干细胞复合异种骨以及单独植入异种骨对兔坏死股骨头的修复效果，并对其进行比较，以判定骨髓骨髓单个核细胞是否对股骨头坏死有修复作用。方法 23 只新西兰白兔，用液氮冷冻的方法，建立双侧股骨头坏死模型，取其中45 个坏死股骨头，随机分组，分别为对照组，实验1 组，实验2 组。每组15 只股骨头。对照组为髓芯减压后单独的异种骨植入，实验1 组为髓芯减压后植入复合骨髓基质干细胞的异种骨，实验2 组为髓芯减压后植入复合骨髓单个核细胞的异种骨。术后2、4、8 周，分别行x线检查、masson染色检查、及新生血管面积百分比和新生骨小梁体积百分比统计分析。结果 纳入新西兰白兔23 只，均进入结果分析。x线及masson染色检查示实验1、2 组修复效果相同，均优于对照组。术后新生血管面积百分比和股骨头新生骨体积百分比比较，同时期实验组效果好于对照组，且统计学差异明显。而实验1、2 组间除2、4 周血管面积百分比外，其余都无显著性差异。结论 骨髓单个核细胞确有修复坏死股骨头的效果，且与骨髓基质干细胞修复效果相似。

【关键词】 骨髓单个核细胞 骨髓基质干细胞 异种骨 股骨头坏死

abstract: objective to observe and compare the respective effects of bone marrow mononuclear cells composite bone xenograft, bone marrow stromal cells composite bone xenograft and bone xenograft on restoration of caput femoris necrosis. methods the caput femoris necrosis models were established in 23 rabbits with bilateral caput femoris necrosis, and 45 necrotic caput femoris were randomly divided into 3 groups with 15 necrotic caput femoris in each group. one group served as control group with implantation of bone xenograft, another group as experimental group 1 with implantation of marrow stromal cells composite bone xenograft, and the last group as experimental group 2 with implantation of bone marrow mononuclear cells composite bone xenograft. after 2, 4 and 8 weeks, x-ray examination and masson trichrome staining examination were respectively taken, and alkaline phosphatase activities was respectively analyzed, and the statistical analysis of percentage of new vein area and percentage of new bone trabecula were also respectively carried out. results all the 23 rabbits were involved in the result analysis. the results of x-ray examination and masson staining examination showed that the effects of the two experimental groups were better than those of the control group. alkaline phosphatase activities analysis, statistics of percentage of new vein area and percentage of new bone trabecula all indicated that in the same period of time, the effects of the two experimental groups were better than those of the control group, and the statistical differences were significant. but there were no significant differences between the two experimental groups in all aspects, except the percentage of new vein area after 2 and 4 weeks. conclusions bone marrow mononuclear cells composite bone xenograft can restore caput femoris necrosis, and nearly have the same effects as bone marrow stromal cells.

key words：bone marrow mononuclear cells; bone marrow stromal cells; bone xenograft; caput femoris necrosis

股骨头坏死的治疗仍是国内外的一大难题，对其的研究也是骨科研究中一个活跃的热点。近年来骨组织工程研究快速发展，其在股骨头坏死的治疗方面也有了充分的利用。全骨髓复合载体或者骨髓基质干细胞复合载体［1］等都被应用于股骨头坏死的治疗。但是全骨髓复合载体治疗股骨头坏死疗效不确切。骨髓基质干细胞复合载体，虽然疗效确切，方法却比较烦琐，容易发生污染。我们本次研究的骨髓单个核细胞，是将全骨髓离心，去除其中的血浆和红细胞后，获得的一种混合物质，其中的骨髓基质干细胞比例较全骨髓有很大提高。同时还包括了一些促进修复的因素。通过本次实验中，我们分析骨髓单个核细胞对股骨头坏死的修复作用，同时探讨单个核细胞复合异种骨治疗股骨头坏死的能力。为临床治疗股骨头坏死探索一种新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料 实验于2004年9月至2005年1月，在辽宁医学院附属第一医院外科实验室完成。实验动物为新西兰白兔23 只，雌雄不限，由锦州医学院动物实验中心提供，体重2.5～3.0 kg，建立双侧股骨头坏死模型，取其中45 只股骨头用于实验，随机分为3组，分别是对照组，实验1、2 组，每组15 只股骨头，对照组为髓芯减压后单独的异种骨植入，实验1 组为髓芯减压后植入复合骨髓基质干细胞的异种骨，实验2组为髓芯减压后植入复合骨髓单个核细胞的异种骨。

1.2 方法 依照赵宝全的方法［2］。

骨髓基质干细胞的培养及复合载体：参考赵子义等［3］的方法，采用全骨髓培养法分离和培养骨髓基质干细胞。制成细胞悬液，按1∶3 传代。之后仍每3 天换液1 次，待细胞再次长满瓶底，收集骨髓基质干细胞悬液，并离心后，将其配成6×106 个/ml的细胞悬液，无菌条件下，将其逐滴滴至松质骨上，使之充分渗入孔隙,等待植入。

单个核细胞的提取及复合载体：速眠新肌注麻醉实验用兔后，消毒，在股骨大转子、胫骨结节等处用穿刺针及肝素化的注射器抽取骨髓，共8 ml。混合等体积的dmem培养基后，吹打成细胞悬液，用密度为1.073 g／l percoll分离液提取单个核细胞，要求将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含有提取液的离心管，使悬液置于提取液上层，于离心机1 500 r／min离心20 min，取云雾状中层即骨髓单个核细胞,约1 ml，无菌条件下，将离心所得单个核细胞逐滴滴至松质骨上，使之充分渗入孔隙。等待植入。

股骨头坏死模型的制备及修复实验：新西兰白兔术区备皮，手术台俯卧位固定，速眠新肌注麻醉下，取髋关节外侧斜形切口，长约4 cm，切开皮肤、皮下、深筋膜，分开臀中肌，显露髋关节囊，t型切开关节囊，可见股骨头外上部分。不切断圆韧带，内收下肢，增加股骨头暴露部分。后在保护股骨头周围组织的情况下，用棉棒反复沾取液氮，持续紧贴股骨头3 min。再用温生理盐水复温1 分钟。随后从股骨头基底向液氮冷冻部钻孔，直达软骨下2 mm，形成一直径3.5 mm的腔隙。对照组将单独的异种骨植入，实验1 组植入复合骨髓基质干细胞的异种骨，实验2组植入复合骨髓单个核细胞的异种骨。完成处理后，逐层关闭切口。术毕分笼饲养，肌注青霉素40 万u／d，持续5 天。所有实验用兔，统筹安排，选取适当手术和处死时间，处死后，先行影像学检查，再取股骨头做其他检查。

1.3 主要观察指标

x射线检查：术后2，4，8 周，处死实验用兔取俯卧位摄髋关节正位片。观察股骨头密度变化，判断修复效果。

masson染色：术后2，4，8 周取股骨头，冠状切开，10％福尔马林固定1 周、5 ％硝酸脱钙3 天，石蜡切片，7 μm厚度，后按说明逐步完成masson染色。最后光镜下观察坏死股骨头修复情况。

新生血管面积百分比：取实验组织块，连续切片，从第10 张开始选片，每隔50 张选1 张，每个组织选5 张。在每张切片的原冷冻坏死修复区域，随机选取5 个100倍视野，用计算机图像分析系统进行分析，计算各个平面，新生血管占修复区面积的百分比。

新生骨体积百分比：取上述切片，在每张切片的原冷冻坏死修复区域，随机选取5 个100 倍视野，根据weibel点计数法及立体学公式，vv=∑po/∑pα，以骨组织为参照空间，对各实验组和对照组坏死修复区进行定量，每个视野通过对点的计数来统计修复比例。计算公式中∑po为落在修复区的点数，∑pα为镜下的总点数。

1.4 统计学分析

应用spss11.0软件进行统计学分析，数据全部以均数±标准差（±s）表示。各个时间段，3 组间的数据分别进行两两比较，又称多重比较，故使用多样本的单因素方差分析，p＜0.05认为有统计学差异。

2 实验结果

2.1 x线检查

术后2 周，关节间隙正常，股骨头外形正常，对照组股骨头内局部可见囊性改变，边缘少量密度增高影。实验组可见斑片样或云絮样密度增高影，且实验1 组密度增高影又多于实验2 组。术后4 周，对照组股骨头局部刚可见云絮样密度增高影，而实验组密度整体呈均匀增高，两实验组间无明显差异。术后8 周实验组股骨头密度增高显著，且两实验组x片无明显差别(图1)，对照组密度增高不如实验组增高明显，且不完全均匀（图2）。

2.2 masson染色

新生骨小梁呈蓝色，红细胞及成熟骨小梁呈红色，细胞核呈蓝褐色。

术后2 周，对照组可见少量新生血管和细小新生骨小梁。骨小梁蓝染为主，且不均匀，骨陷窝周围蓝染较深，骨小梁局部点缀红染。骨小梁间为纤维结缔组织充填，可见少量新生血管。实验1 组骨小梁染色蓝色为主，但处处可见红染，骨小梁间可见大量活跃的成骨细胞。实验2 组骨小梁染色蓝色为主， 但红染较对照组多，骨小梁间为纤维结缔组织充填，数条血管也见于骨小梁间。

术后4 周，对照组骨小梁较细小且数量少，骨小梁蓝染仍不均匀，局部可见少量红染部分，骨小梁边缘可见少量成骨细胞。实验1 组，骨小梁局部蓝染均匀，出现片状红染，骨小梁边缘骨髓基质干细胞活跃，骨小梁间纤维组织为主，血管丰富，有少量新生骨髓组织。实验2 组骨小梁可见条状蓝染，片状红染，骨小梁间血运丰富，可见新生骨髓组织。

术后 8 周，对照组（图3）骨小梁红染增多，但仍以蓝染为主。骨小梁边缘可见部分静止成骨细胞，小梁间可见丰富骨髓组织。实验1、2 组（图4、5）可见成熟骨小梁，整个骨小梁多数红染，骨小梁排列有序。小梁间可见丰富骨髓组织。两实验组间未见明显差别。

2.3 新生血管面积百分比统计分析

术后2、4、8 周计算机图像采集，并计算不同时期各个冠状切面新生血管占坏死区面积百分比。后行统计学分析。不同时间，各组间两两进行比较，使用单因素方差分析比较差异大小。术后2、4、8 周，实验1、2 组的新生血管面积均明显高于对照组，且均有显著差异（p<0.05）。术后2、4 周，实验1、2 组间比较，新生血管面积也有显著差异（p<0.05），术后8 周，实验1、2 组间比较，新生血管面积无显著差异（p>0.05）。结果如下（见表1）。

表1 不同时期新生血管占修复区平面的面积百分比（略）

注：同时间，组间比较用单因素方差分析，*表示与对照组比较p<0.05

2.4 新生骨体积百分比统计分析

术后2、4、8 周显微镜下，计算机图像采集并计算不同时期各例股骨头内，新生骨占坏死修复区的体积百分比。后行统计学分析。不同时间段，各组间两两进行比较，使用单因素方差分析比较差异大小。术后2、4、8 周，实验1、2 组的新生骨体积比均明显高于对照组，且均有显著差异（p<0.05），而术后2、4、8 周，实验1、2 组间比较，新生骨体积比无显著差异（p>0.05）。结果如下（见表2）。

表2 不同时期新生骨占坏死修复区的体积百分比（略）

注：同时间，组间比较用单因素方差分析，*表示与对照组比较p<0.05

3 讨论

本实验中所用骨髓单个核细胞是一种混合物质。是将所抽取的完整骨髓，通过1 500 r／min的转速离心20 min后，取云雾状中层所得。与完整的骨髓相比较，我们去除骨髓中的血浆成份和红细胞，得到的是包括造血干细胞、骨髓基质干细胞、多能前体细胞、以及各类有核的血细胞等在内的混合物质。在本次实验研究中，我们观察到骨髓单个核细胞确有修复股骨头坏死的作用，通过查阅文献及相关分析，我们主要考虑两方面的生物学效应起作用。

骨髓单个核细胞的成骨作用，骨髓单个核细胞中含有一定数量的骨髓基质干细胞，虽然尚不能达到组织工程所需最低细胞数量，但dumas等［4］通过实验发现不同的离心方法以及复合载体等措施可以明显提高骨髓基质干细胞克隆形成能力，使骨髓基质干细胞成骨能力最大化。国内李亚非等［5］的研究成果也表明骨髓内基质干细胞在周围存在骨坏死、骨修复的条件，以及适宜的体内理化、营养环境诱导作用下可以分化、增殖，明显提高单位体积内基质干细胞、成骨细胞的数量和活性，增强成骨活性，促进新骨的生长，从而获得肯定的成骨效果。所以将骨髓单个核细胞应用到股骨头坏死的治疗，可以增加股骨头坏死修复过程中成骨的因素，促进股骨头坏死的修复。

骨髓单个核细胞的促进血管生成作用，骨髓单个核细胞中的造血干细胞和骨髓基质干细胞都是其能促进血管生成的关键。实验研究［6，7］证实，造血干细胞、骨髓基质干细胞在体内缺血的环境刺激下，都可以向血管内皮细胞方向分化，促进血管生成。该生物学效应，已经通过实验研究得到证实。并且在临床方面，也应用到了心肌梗死和糖尿病性下肢缺血［8］等疾病的治疗，且收到了良好效果。而在本次实验中，我们对坏死修复区，新生血管面积百分比的统计，也证明骨髓单个核细胞组成血管作用较其他两组强。同时股骨头坏死往往与股骨头内进行性血运障碍有关，所以考虑，骨髓单个核细胞能够促进血管生成，也是其修复股骨头坏死的作用机理之一。

股骨头坏死修复过程中，骨细胞坏死本身并不引起任何症状和可见的x线表现异常.只有当坏死后引起修复反应达到一定程度时，才可以引起x线片上骨密度的改变［9］。对于何时出现x线表现的变化，目前研究尚不统一，可能与是否脱位股骨头、是否切断圆韧带、是否切断股骨颈有关。本实验未脱位股骨头，未截断圆韧带和股骨颈，故修复开始较早。2周即可见修复局部云絮样密度增高影，同时实验各组修复因素多于对照组，故各时间段x片可见实验组修复效果好于对照组。而实验组间比较，并无明显差异，可见仅从x线看，骨髓单个核细胞和骨髓基质干细胞无明显差异。

依照上述分析，自术后2 周开始，各实验组和对照组坏死股骨头已经开始修复，且有新生骨小梁形成，但各实验组在骨髓基质干细胞作用，以及骨髓基质干细胞和成血管因素共同作用下，成骨效果以及修复坏死股骨头效果明显好于对照组，在4周、8周时，效果差异也同样显著，该分析符合本次实验2、4、8 周新生骨小梁统计分析结果。同时两个实验组间，各种成骨修复因素相互作用，可导致成骨差异不大，故统计学分析未见明显差异。

综上所述，骨髓单个核细胞作为骨髓离心提取物，去除了骨髓中对组织修复意义不大的成份，保留了关键成份。其复合异种骨是一种新的修复股骨头坏死的有效方法。

【参考文献】

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