示踪法自体骨髓干细胞移植实验研究

[摘要] 目的:研究大鼠骨髓干细胞移植后的定位与分化状态。方法:以荧光染料DiI为示踪剂对移植的骨髓干细胞进行标记,并通过门静脉移植入大鼠肝脏,分别于7、14、21、28 d采集移植鼠的肝组织进行荧光检测。结果:荧光剂DiI标记的干细胞在移植鼠肝组织中定位,并且分化增殖。其亮红色荧光随时间的推移略有减弱,但并不消失。结论:DiI荧光剂为可靠的干细胞示踪剂,可应用于移植细胞的标记,骨髓干细胞可在受损肝组织中定位并分化增殖。

[关键词] 示踪法;骨髓干细胞;移植;实验研究

[中图分类号] R-332 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2010)05(c)-013-02

Experimental research on autologous bone marrow stem cell transplantation with tracer method

JIN Chunying,QU Naifang,ZHANG Pu

(Infectious Disease Hospital of Harbin City,Heilongjiang Province, Harbin 150030, China)

[Abstract] Objective: To research the location and differentiation of rats bone marrow stem cells after transplantation. Methods: Labeled rats bone marrow stem cells with fluorochrome DiI, transplanted the labeled cells into the rat livers via portal vein, collected and detected the hepatic tissues from the transplantation rats after 7,14,21,28 days respectively. Results: The stem cells labeled by fluorochrome DiI located, proliferated and differentiated in the livers of the transplantation rats. The red fluorescence declined over time, but it didn't disappear. Conclusion: DiI is a reliable stem cell tracer and can be used to label transplanted cells. Bone marrow cells can be located proliferated and differentiated in damaged hepatic tissue.

[Key words] Tracer method; Bone marrow cells; Transplant; Experimental research

目前,骨髓干细胞移植作为一种新的治疗手段,在各系统疾病中有被广泛应用的趋势,但其效果也只能从各项生化、生理指标的变化来判定,很难做到直观判别移植的干细胞是否定位于靶位,分化与增殖而发挥作用。为探求了解移植干细胞在病变部位的状态,笔者用荧光剂DiI作为示踪剂对移植的骨髓干细胞进行标记、检测分析,现将结果报道如下:

1材料与方法

1.1实验动物

雄性SD大鼠10只,体重(200±20) g,清洁级,购自哈尔滨兽医研究所动物室。

1.2试剂与仪器

D-氨基半乳糖购自重庆医科大学试剂中心,亚硫酸钠、内毒素、DiI购自Sigma公司,淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物有限公司,rhG-CSF为山东齐鲁制药有限公司生产,荧光显微镜为德国莱卡480型,温控离心机为美国贝克曼产品。

1.3实验方法

1.3.1动物模型制备与干细胞标记10%D-氨基半乳糖溶液(以0.9%NaCl溶液配制,以0.1 mol/L NaOH调PH至7.4)按10 mg/kg体重,内毒素20 μg/kg体重一次性对模型鼠进行腹腔注射制备大鼠肝衰竭模型。对照组以0.9%NaCl溶液用同样方法制备。诱导肝衰竭后正常饮食,并于次日起以10 μg/kg体重rhG-CSF对模型鼠行皮下注射,每天1次,共计4次,于第5天从模型鼠舌下以肝素抗凝采血1 ml,给予混后的等量磷酸盐缓冲液(PBS)混匀,轻轻叠于1.083Ficoll-Hypaque上(比例为3∶2),25℃ 2 000 r/min离心20 min,吸出单个核细胞层,加入2 ml PBS(PH7.4,0.01 mol/L)中洗涤3次,每次以1 500 r/min离心5 min,弃上清后取少量细胞进行曲利苯兰活性率检测,确定细胞活率。再以1 ml PBS对细胞进行悬浮混匀。在悬浮细胞中加入以无水乙醇配制的(浓度为1 mmol/L)CM-DiI荧光剂5 ml,混匀后避光放入37℃水溶液20 min进行标记,再以PBS洗涤3次,每次以2 000 r/min离心10 min,弃上清,在荧光镜550 nm光片下判读标记率,并调细胞数为1.0×108/ml,吸出0.2 ml标记好的干细胞悬液放暗盒37℃ 5%CO2培养箱中待用。

1.3.2标记干细胞的移植以3%戊巴比妥钠按25 mg/kg对采血后的模型鼠进行腹腔注射,麻醉后固定于操作台,以0.8%亚硫酸钠对大鼠上腹部进行脱毛处理,再以75%乙醇,碘酒大面积消毒铺孔中,在无菌条件下于大鼠上腹部剑突下顺切一9 cm长切口,止血后拨开网膜找出门静脉,注入200 μl标记好的骨髓干细胞,以棉签压迫止血,确定不出血后,分层缝合关闭腹腔外涂碘伏,并注射青霉素0.2 MU预防感染。

1.3.3移植鼠干细胞检测于干细胞移植后的7、14、21、28 d不同时段取移植鼠肝组织冰冻切片,甘油封片后,用荧光显微镜进行标志物检测,观察DiI标记细胞在肝细胞中的分布(图1)。判定标准:DiI标记阳性细胞在550 nm荧光镜下显亮红色为(+)。

2结果

在荧光镜下,以0.4%曲利苯兰检测悬浮细胞DiI标记率为98%以上。活性细胞显强亮红色,死细胞光亮变弱,差异明显。移植鼠在移植后7 d时肝组织片中显示亮红色颗粒较多且密集,第14天开始减少,至第28天肝组织中能见到亮红色细胞,并有细胞呈团样,表现为中心明亮向外周辐射减弱。

3讨论

1,1′-双十八烷-3、3、3′-四甲基吲哚羰花青-高氯酸盐(DiI)是一种亲脂性羰花青染料,能在荧光镜550 nm滤光片下发出亮红色荧光,它可进行单层细胞和悬浮细胞的染色,不溶于水,易嵌入生物使膜内做侧向扩散,从而标记整个细胞膜,并能通过活体细胞的吞饮作用标记整个细胞浆。有实验证实DiI具有低细胞毒性,但不影响细胞活力与细胞的分化与增殖[1]。本实验标记的骨髓干细胞荧光镜下观察其悬浮细胞的标记率在98%以上,移植后28 d在移植组织中仍见标记细胞显亮红色,证实其半衰期长,且有操作简便、用时较短、可读性强等优势[2-3],证实DiI是一种非常好的骨髓干细胞标记染料[4]。本实验依据DiI的生物学特性将其应用于自体骨髓干细胞的移植,研究发现,被标记的骨髓干细胞在肝组织中于7、14、21、28 d均显示亮红色颗粒,证实骨髓干细胞在肝组织中定位。同时随时间的推移,显示出由强到弱不同强度的荧光颗粒,这种由强到弱的趋势可能是由于移植后骨髓干细胞在肝脏微环境中不但定位且分化为肝细胞,从亮红色细胞团的辐射从中心到边缘减弱的趋势,能证实此推论。其次也不除外细胞的自然凋亡和DiI本身就存在的半衰期影响了它的荧光程度。总之,本实验证实了用DiI这种荧光染料,跟踪移植物的存在和态势为一种最佳选择。

[参考文献]

[1]Ponticiello MS,SchiNagl RM,Kadiyala S,et al. Gelatin basedresorbable sponge as a carriermatrix for human mesenchymal stemcells in cartilage regeneration therapy[J].J Biomed M ater Res,2000,52(2):246-255.

[2]孔国英,刘忠浩,帅建中,等.DiI在已固定脑组织中的示踪研究[J].湖南医科大学学报,1994,19(1):70-72.

[3]尹学亮,赵一俏,李志染,等.应用DiI标记氧化低密度脂蛋白观察人单核细胞源性树突状细胞成熟研究[J].广东医学,2007,28(7):1047-1050.

[4]Soriano HE,Lewis D,Legner M.The use of DiI-marked Hepato-cytes to demonstrate or orthotopic intrahepaticeng raftment following hepatocellular transplantation[J].Transplantation,1992,54(4):717-723.

(收稿日期:2010-02-09)

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