玻璃化冻存骨髓基质干细胞的实验研究

[摘要]目的：骨髓基质干细胞（BMSCs）是构建组织工程化骨主要的种子细胞，实现BMSCs的深低温保存对骨组织工程具有重要意义。目前，玻璃化冻存是最有发展前景的冻存方法，因此希望通过改进玻璃化液和预处理条件来提高BMSCs的玻璃化冻存效果。方法：采用不同组成及浓度的玻璃化液在不同的预处理条件下对第2（P2）代成骨诱导的犬骨髓基质干细胞（cBMSCs）进行玻璃化冻存实验，通过复苏后的细胞存活率来选择一种理想的玻璃化液及适合的预处理条件，并在此基础上再与常规冻存的实验结果进行比较，同时考虑冻存过程对细胞成骨活性的影响。结果：将VS226作为玻璃化液，在0℃/5min的预处理条件下玻璃化冻存P2代成骨诱导的cBMSCs，与常规冻存后的细胞存活率相比无统计学差异，且冻存过程对此细胞的成骨能力没有影响。结论：采用VS226来玻璃化冻存BMSCs，可实现为骨组织工程提供大量种子细胞的目的。

[关键词]深低温保存；玻璃化冻存；骨组织工程；骨髓基质干细胞

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）03-0318-05

Experimental study of vitrification preservation for BMSCs

YIN Hong-yu1, SUN Jian3, LIU Guang-peng3,CUI Lei2,3,CAO Yi-lin1,2,3

(1. Research Center Of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College, Beijing 100041, China; 2.Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011, China; 3.Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center, Shanghai 200234, China.)

Abstract: Objective Bone marrow stromal cells (BMSCs) have become the main cell source for tissue-engineered bone. There is of great significance for bone tissue engineering to cryopreserved BMSCs. At present, vitrification preservation is the most promising methods of cryopreservation for cells. The effect of vitrification method for BMSCs was wished to enhance by improving the vitrified solution and the pretreatment condition. Methods Using the different composition and concentration of vitrification fluid, the freezing experiments on osteogenically induced canine bone marrow stromal cells (cBMSCs) at passage 2 (P2) were performed under the different preconditioning. According to the cellular survival rate after rewarming, the ideal vitrification media and optimal pretreatments were chosen to cryopreserve the cells in order to compare with the experimental result of slow-freezing. Simultaneously, the influence of vitrification protocol on osteogenic activity of the cells needed to be considered. Results Taking the VS226 as a vitreous cryoprotectant, osteo-induced cBMSCs at P2 were banked under 0℃/5min of the pretreatment condition. There was no statistical significance of percent cell viability post-thaw between routine and vitrification method, and the cooling process did not affect osteogenic ability of the cells. Conclusions Based on these results, it can be concluded that BMSCs frozen by vitrification with VS226 can be used to provide the massive seed cell for bone tissue engineering.

Key words: cryopreservation; vitrification; bone tissue engineering; bone marrow stromal cells

组织工程学是一门以细胞生物学和材料学相结合, 进行体外和体内构建组织或器官的新兴学科[1]。构建的方法主要是在支架材料上接种高浓度的种子细胞进行复合培养。骨组织工程是组织工程的主要分支，其种子细胞以成骨诱导的BMSCs为主，因此组织工程化骨的构建迫切需要进行大量种子细胞的冷冻贮备。玻璃化冻存技术是近年来低温生物学领域发展最快的研究方向之一。本文通过采用一种新研制的玻璃化液对成骨诱导的cBMSCs进行玻璃化冻存的研究，以期能使组织工程化骨的种子细胞获得理想的玻璃化冻存效果。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1 动物：2岁龄Beagle犬3条，雌雄不限，体重约20kg，上海农学院提供。

1.1.2 试剂：Percoll原液：77237 Percoll （sigma公司，美国）；BM Purple染色剂（Boehringer Mannheim公司，德国）；茜素红染液（sigma公司，美国）。

1.2方法

1.2.1 cBMSCs的分离和体外诱导培养：将实验犬以5 %的戊巴比妥钠（0.5ml/Kg）麻醉后，抽取骨髓2.5ml。根据以前报道的方法[2]进行Percoll液的配制和犬骨髓单个核细胞的分离提纯。将原代细胞接种培养48h后开始应用含有地塞米松（10mmol/L）、β-磷酸甘油钠（2.16g/L）和2-磷酸抗坏血酸（37.5mg/L）的成骨条件培养液，置37℃、5% CO2的培养箱内进行成骨诱导培养。细胞培养至第8天，细胞克隆形成单位的中心生长达密集时用0.25 %胰蛋白酶-0.02%EDTA进行第1次传代[3]。以1.6×104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代。

1.2.2 冻存液的制备：常规冻存液由体积比为10%二甲基亚砜（DMSO）、50%胎牛血清（FBS）和40%细胞培养液（DMEM）组成；根据文献[4]制备玻璃化液VS55；其它玻璃化液参见表1（根据文献[4]制备EC液）。

1.2.3细胞的深低温保存方法：①常规冻存：将P2代成骨诱导的cBMSCs消化离心后倒除上清液，用0.5ml常规冻存液重悬并置入2ml冻存管中，先在4℃预冷30min，再置于-20℃ 2h，经过24h的-80℃保存后投入液氮（-196℃）；②玻璃化冻存：将同样方法获得的细胞用同体积的玻璃化液重悬于冻存管中，经过不同的预处理方案，包括将冻存管放入冰水混合物(0℃)中或置于室温（25℃）下分别保持5min或15min后再直接投入液氮，或立即投入液氮（0min）。

1.2.4 深低温保存细胞的复苏方法：从液氮中取出冷冻保存1天的冻存管，在37℃ 水浴中快速摇晃进行复温，将复温后的细胞溶液迅速转移到离心管中并加入成骨条件培养液进行稀释，离心（1 500 转/min，5 min）后去上清液，共洗涤2次。

1.2.5 深低温保存细胞复苏后的细胞存活率[5]：将3×105个P2代成骨诱导的cBMSCs连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式：增殖率=细胞总数÷(3×105)，来获得未冻存细胞的增殖率。然后深低温保存3×105个此细胞，冻存1天后复苏，继续成骨诱导培养6天，同样获取培养后的细胞总数，利用公式：细胞存活率=培养后细胞总数÷(3×105×增殖率)，以得出冻存细胞的存活率。

1.2.6 生化检测：根据以前报道的方法[2]分别将P2代成骨诱导的cBMSCs进行冻存前后的碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色。。

1.2.7 统计学分析：数据采用EXCEL软件处理，行t检验。每个检测样本重复3次，数据以均数±标准差表示,P

2结果

2.1 不同玻璃化液在不同的预处理条件下进行玻璃化冻存对细胞存活率的影响：如图1所示，用不同的玻璃化液对P2代成骨诱导的cBMSCs进行玻璃化冻存，不论预处理时间是0min、5min，还是15min，预处理温度为0℃时的细胞存活率明显高于25℃（P0min（P

2.2 玻璃化冻存与常规冻存对细胞存活率的影响：同样对P2代成骨诱导的cBMSCs进行深低温保存，玻璃化冻存用VS226作为冻存液，预处理条件选择在冰水混合物中预冷5min，从图2可见，玻璃化冻存后的细胞存活率为75.0%±3.5%，而常规冻存是77.0%±2.4%，二者并无统计学差异，由此可见玻璃化冻存细胞达到了与常规冻存同样的效果。

2.3 冻存对细胞成骨活性的影响：不论是玻璃化冻存还是常规冻存，经体外成骨诱导培养的P2代cBMSCs的ALP染色和茜素红染色在冻存前后均为阳性。ALP染色的细胞胞浆呈蓝、绿色（图3A）。茜素红染色的细胞外基质中可出现散在的结节状红染，在钙化沉积区为深红色，中心呈黑色（图3B）。

3讨论

冻存主要用于对细胞和组织的保存，随着组织工程的发展使冻存的作用显得尤为重要[6]。常规冻存[7]是通过添加冷冻保护剂、采用一定降温程序缓慢降温的一种方法。由于这种慢速冷冻方法比较成熟, 在许多研究领域已经得到广泛的使用。玻璃化冻存是用高浓度且低毒的多种冷冻保护剂的协同效应使细胞脱水到合适程度，然后通过快速降温（常常会超过1 500℃/min），使含高含量防冻剂的液体粘滞度升高，液体分子的弥散运动被抑制，液体固化为一种类似于玻璃的非晶体状态[8]。该方法是深低温保存的新技术，不仅操作方法简便、快速, 不需昂贵的降温设备，而且在快速降温和复温过程中迅速通过-5℃～-15℃的冷冻危险区，从而防止了冰晶的产生，或虽有冰晶形成但没有长大到足以使细胞的超微结构发生变化的程度，进而避免或减轻了细胞内外冰晶和溶质效应对胞膜和细胞骨架等的损伤。因此与常规冻存相比，玻璃化冻存可以达到更好的深低温保存效果。1985年，Rall 等[9]首先使用玻璃化法成功地进行了小鼠胚胎的冷冻保存。现在，此冷冻方法已成功地冻存了人类胚胎[10]、卵子[11]和人类干细胞[12]等生物材料。

玻璃化冷冻在避免冰晶形成的同时，有潜在增强化学毒性的趋势。这主要是由于高含量冷冻保护剂具有毒性作用。因此低毒性的，高渗透性的冷冻保护剂组合是其关键。冷冻保护剂可分成两大类，即渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。大量的资料[13-15]表明联合运用这两种作用机制不同的冻存保护剂进行玻璃化冻存，可以加强冷冻效果和减轻毒性。

DMSO是最常见的渗透性冷冻保护剂，它的高度水溶性使其易于透过细胞膜，并在细胞内外形成高渗透压，补偿了胞内、胞外存在的盐梯度，因此可防止细胞内的冰晶形成和细胞膜的破坏[16]。EC液是器官保存灌洗液的金标准[17]。作为模拟细胞内电解质成分和浓度的EC液可具有磷酸盐缓冲作用，并拥有着可保持高渗透压的葡萄糖（一种非渗透性冷冻保护剂）[18]，实验结果也证明了加入EC液成分的玻璃化液具有很好的细胞冻存效果。众所周知，细胞培养液包含着细胞生长所必需的各种营养物质，而其中的血清成分已被研究证明有利于细胞冻存[19]。本实验所用的玻璃化液就是由此配制而成，结果显示用VS226进行细胞的玻璃化冻存明显优于其他的玻璃化液。这是因为30%和40%的DMSO浓度较高，对细胞伤害较大，而20%的浓度则是细胞保护和细胞毒性之间一个最佳点。同时此三种成分的合理配比使玻璃化冻存后的细胞存活率超过了VS55，并达到了常规冻存的效果。由此可见，VS226是一种理想的玻璃化冻存液。

为将玻璃化冻存中的细胞毒性损伤减小到最低限度,当然还需要严格控制细胞与冷冻保护剂溶液接触的温度和时间，加快降温和复温的速率。实验结果指出预处理温度为0℃的玻璃化冻存效果好于25℃，这是因为低温环境可减少DMSO的细胞毒性[20]。而预处理时间以5min为最佳，这是由于将细胞与冷冻保护剂预先接触可降低冻存过程中的渗透压突变对细胞的打击，而过长的接触时间又会增加冻存液对细胞的毒性损伤。

自从Vajta[21]发明了开放型拉细冻存麦管(open pulled straw, OPS)，冷冻速率增至20000℃/min，大大加快了降温复温速率和提高了细胞存活率。但因吸入管内液体仅为2μl，极大的限制了冻存细胞的数量，然而组织工程所需的细胞数量又较大，可见OPS法是很难满足的。但常规的2ml冻存管却可实现此要求，因此实验选用冻存管成装细胞悬液。同时为增加热交换率，实验仅用0.5ml的冻存液来混合细胞，以希望获得更大的降温和复温的速率。但毕竟此方法无法达到OPS法的冷冻速率，这也说明了本实验的细胞存活率不是非常高的原因。

由于在液氮（-196℃）温度下，细胞、组织内各种酶的活力及代谢很低，几乎为零，生命处于所谓的“停滞”状态。在此温度下冻存的细胞，理论上可无限期保存[22]。鉴于深低温保存的时间并不是问题，因此本实验选用1天作为冻存的时间。

Kadiyala等[3]研究指出cBMSCs从P2代以后的细胞活性即开始降低，这也就是为什么选用P2的cBMSCs进行本实验的原因。目前，成骨诱导的BMSCs是骨组织工程重要的种子细胞，冻存细胞不但要保证高的细胞存活率，而且还要保持细胞的成骨活性。本实验经过生化检测验证了冻存过程并未影响成骨诱导cBMSCs的成骨能力。因此玻璃化冻存完全可以满足骨组织工程中对细胞冷冻保存的要求。

总之，用VS226作为玻璃化液，经0℃/5min的预处理后对P2代成骨诱导的cBMSCs进行玻璃化冻存，复苏后的细胞存活率达到了与常规冻存相同的效果。

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[收稿日期]2008-11-12[修回日期]2009-02-08