骨髓间充质干细胞治疗视网膜疾病的实验进展

各种视网膜疾病，如视网膜色素变性(RP)、年龄相关性黄斑病变(AMD)等，视网膜光感受器的损伤可导致不可逆的视力丧失。对于此类疾病，人们尝试了很多方法来修复视网膜细胞变性，阻止视网膜光感受器的丧失，其中包括营养支持治疗、基因治疗、神经生长因子、以及人工眼等。然而，这些方法都未能取得确切的临床疗效，因此人们开始转向寻找合适的细胞源作为移植物，通过视网膜的细胞移植来代替丢失的细胞或者起到支持细胞的作用，以阻止更进一步的细胞丢失。

随着干细胞应用技术不断突破，为我们最终有效的治疗这些眼病，恢复患者的视功能提供了一个良好的契机。再加上眼睛的解剖结构明确，并具有透明的屈光介质、便于操作定位及观察的特点，使得与其他神经系统疾病相比，视网膜疾病在细胞移植方面发展得更为迅速。

1 间充质干细胞具有优势

干细胞是生物个体生长发育中具有自我更新、增殖和多向分化潜能的细胞群体，分为胚胎干细胞和成体干细胞。目前研究较多用于视网膜移植的干细胞包括胚胎干细胞(ESC)和成体干细胞中的间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)、神经干细胞(NSC)和视网膜干细胞/祖细胞(RPC)等。但由于MSCs易于获得，且无胚胎干细胞或神经干细胞的伦理障碍，同时也避免了异体移植的免疫排斥反应，在目前临床前试验和临床应用中尚未见致畸作用的发生。因此，MSCs在干细胞移植方面具有优势，也是目前研究相对深入的一群具有多向分化潜能的成体干细胞。

然而，要想实现MSCs的临床应用，就必须克服MSCs的选择、培养扩增、体外标记、植入体内及植入后的融合等一系列技术难题。目前，MSCs移植主要以大鼠骨髓间充质干细胞实验对象，已进入动物实验的阶段，虽取得了一些突破，但同时也存在不少难题。现从大鼠骨髓间充质干细胞分离培养研究近况和大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化视网膜神经样细胞的研究近况二方面进行综述。

2 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养研究近况

间充质干细胞广泛分布于人体各种器官和组织，但最易得到、最富集和研究最多的是来源于骨髓。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞。在20世纪80年代初人们通过骨髓培养发现，它是中胚层发育的早期细胞，可以分化为神经细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞等。由于其多分化潜能和强大的自我更新能力，使BMSC可以作为种子细胞用于组织工程和基因治疗的研究。

3 获取含BMSCs的骨髓

据研究，BMSCs在骨髓中的浓度不高，约占有核细胞的0.001%～0.01%，要想成功获取高质量的BMSC需要在选择大鼠并用适当的方式去获取BMSCs的骨髓液。

3.1 不同周龄大鼠骨髓MSCs的分离效果不同

大部分文献报道是以周龄作为选择大鼠的指标。Zhang等认为骨髓MSCs的增殖能力与动物年龄有关，随着年龄增加，成纤维细胞集落形成单位(CFU-F )测定显示骨髓克隆形成细胞的数量逐渐递减。谢茂松等研究发现，在相同接种密度条件下，观察到1 mo龄鼠的增殖能力较2mo和4 mo龄鼠强，2mo龄鼠的增殖能力较4mo龄鼠强。晏丹等对1mo到2mo龄鼠作了进一步的分析，结果发现：4周龄大鼠下肢骨分离所得的细胞数较少，原代培养长出的细胞克隆少，很难汇合成片；8周龄大鼠骨髓中含有较多的脂肪细胞，密度梯度离心后，在白膜层形成颗粒状聚集物，影响后续的分离与培养效果；6周龄的大鼠在细胞分离的质和量上达最佳效果。故晏丹等主张选择6周龄的大鼠作为实验动物。

3.2 不同体重大鼠骨髓MSCs的分离效果不同

也有文献报道是以体重作为选择大鼠的指标。Zhang等[1]认为动物体重对骨髓MSCs的分离有影响：体重≥250g的大鼠骨髓中含有较多的脂肪细胞，密度梯度离心后，在白膜层形成颗粒状聚集物，影响分离效果；体重

3.3 获得含BMSC骨髓液的方法

3.3.1冲洗法

骨髓冲洗法的剪断股骨、胫骨的方法有二种，即干骺端和骨干中间剪断法二种。谢茂松等[2] 研究发现，剪去干骺端法和骨干间剪断法在细胞纯度差异无统计学意义，但获取的MMSC细胞上，剪去干骺端法比骨干间剪断法数量少，这可能与BMSCs主要在干骺端有关。

3.3.2夹碎震荡法

余劲明等用将大鼠的股骨、胫骨完全剥离，清除肌肉组织后，直接用止血钳将骨完全夹碎，尤其是干骺端，后充分暴露骨髓腔，通过震荡尽可能使造血干细胞置于缓冲液中。再用筛网过滤去除碎骨，离心后获取细胞。改良操作后，与传统的冲洗法相比，操作时间缩短，获取的P0细胞活性冲洗好，更有利于细胞的扩增和纯化。余劲明等[3]认为原因是由于实验动物的骨头较细，传统的冲洗法使用注射器冲出骨髓细胞的操作时间长，使获得的BMSCs细胞活性下降。

4 分离纯化BMSCs

4.1 分离法的种类

BMSCs最初的分离培养方法由Friedenstein于1976年建立，主要通过贴壁培养进行细胞分离。近年来国内外实验中对MSCs的提取和扩增方法有如下几种：单纯贴壁筛选法、免疫磁珠分离法、流式细胞仪分离法及密度梯度离心法。

4.1.1流式细胞仪分离法。流式细胞仪分离法是根据不同细胞具有不同的表面标志，以荧光抗体与细胞表面标志结合，然后用流式细胞仪进行分选，该方法的优点是分离迅速、纯度高，但仪器昂贵，费用较高，对含量太低的细胞难以分离，而且不能处理大量的样品。

4.1.2免疫磁珠分选法。免疫磁珠分选法是根据磁珠具有既能结合蛋白质又可被磁铁所吸附的特性进行分选的。经过一定处理将抗体或抗原结合在磁珠上，使之成为抗体或抗原的载体，磁珠上抗体或抗原与特异性抗原或抗体结合后，形成抗原抗体磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力作用下，发生力学移动，使复合物与其他物质分离，从而达到分离特异性抗原或抗体的目的。该方法的优点是避免了免疫毒素和补体裂解带来的非特异性杀伤作用，且可以处理大量的细胞样品，因此在临床和基础研究中具有很诱人的应用前景，但价格昂贵、操作复杂。

4.1.3单纯贴壁筛选法。贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同，逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的方法，实验表明贴壁法分离大鼠BMSCs传10多代仍能保持旺盛的生长和增殖能力。

4.1.4密度梯度离心法。密度梯度离心法是利用MSCs与其他细胞密度的不同，用特定密度的淋巴细胞分离液将MSCs分离出来。常用分离液有密度可调的Percoll分离液和密度固定的聚蔗糖-泛影葡胺分层液Ficoll-Hypaque (商品名Fi-coll )分离液二种。有研究表明，在MSCs的分离中，Percoll较Fi-coll能得到更纯的细胞群体，并认为Percol与Fi-coll相比，Percoll具有无毒、无刺激性，能较好地保持细胞活性，并且可用于分离不同密度的细胞或颗粒等优点。余劲明等[3]认为不同密度Percoll的分离效果不同，他们采用70%的Percoll液(密度1.087g/mL，大鼠单个核细胞密度m)和57%的Percoll液(密度为1.073g/mL)进行密度梯度离心，结果显示，70%Percoll分离效果欠佳，红细胞沉降不良；而57%Percoll分离效果较好，白膜层未见红细胞掺杂。

4.2 各种分离法的比较

因为骨髓间充质干细胞目前还没有公认的独特抗原表型，再加上免疫磁珠分离法和流式细胞仪分离法分离出的细胞数量少，活性低，加之技术难、成本高，所以较少采用。目前大部分实验室分离使用的仍是单纯贴壁筛选法或密度梯度离心法，免疫磁珠分离法和流式细胞仪分离法则用在鉴定上。

密度梯度离心法和单纯贴壁筛选法两种方法均可分离培养出较纯化的BMSCs。杨丽等[4]研究发现：与密度梯度离心法相比，全骨髓贴壁法操作步骤简单，既降低了离心对细胞的损害，又减少了污染机会，节省经费，且分离的骨髓间充质干细胞贴壁时间短，增殖快，细胞数量多，经传代后能够纯化，这与以往的文献报道一致。李爽等则认为：密度梯度离心、贴壁培养和消化控制相结合，是一种比较理想的分离纯化方法。赵瑛等[5]采用Percoll(1. 073 g/mL)密度梯度分离和贴壁培养法相结合的方法能够成功分离纯化。

4.3 分离法的改良

由于单纯贴壁筛选法的纯度不如密度梯度离心法，有学者对分离方法进行改良。

刘东宁等采用0.85% NH4Cl溶液分离培养Long-Evans大鼠股的BMSCs，其原理为0.85% NH4Cl溶液可降低环境渗透压，选择性快速裂解红细胞，所余细胞成分即主要为白细胞和有核骨髓细胞，通过定期更换培养液，剔除不贴壁生长的白细胞和造血干细胞，所余贴壁生长细胞即主要为BMSCs。细胞传P3代后纯度高达94%以上，与密度梯度离心法相近。

谢茂松等[2]在换液时运用化学螯合剂EDTA吸收Ca2+、Mg2+，使未贴壁能力弱或粘附而未贴壁的造血系细胞等细胞分离，而对于贴壁能力较强的BMSCs细胞影响极少，从而提高MMSC细胞的纯度，使提纯的纯度与密度梯度离心法比较无显著差异。

5 鉴定BMSCs

骨髓间充质干细胞目前还没有公认的独特抗原表型。所以大多数的实验室都采取从细胞形态、细胞周期以及表面标志物表达三方面来鉴定BMSCs。

5.1 细胞形态：细胞形态用的标准一致，都为长梭形细胞。

5.2细胞周期测定：都是以BMSCs绝大多数处于静止期，只有极少量细胞处于增殖期为测定标准。

5.3表面标志物：由于骨髓间充质干细胞的表面抗原不是独特的，所以目前鉴定培养细胞的方法只能用说明培养细胞既非造血干细胞，也非成纤维细胞，以推测分离培养最大可能是间充质干细胞。国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出了鉴定人来源MSC的3条最低标准：①在标准培养条件下，MSC必须具备对塑料底物的贴附性；②通过FCM检测，MSC群体表达CD105、CD73及CD 90阳性率≥95%，CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19，HLA-DR阳性率≤2%；③经体外诱导，MSC必须能向少成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞等分化。该标准特别指出，对于动物来源的MSC，除第2条标准不具有普遍意义的适用性外，第1条、第3条描述的生物学特征同样适用于动物来源的MSC。

大部分的实验室用骨髓间充质干细胞表达阳性的指标CD29、 CD44以及表达阴性的指标CD34作为鉴定参考指标。也有实验室用CD14、CD44表达阴性，CD90、CD45表达阳性，来说明已形成了纯化的BMSCs细胞群。李爽等选取CD29，CD45，CD105和CD166作为其鉴定标记。

6 体外扩增

6.1 培养基选择

P0 MSCs生长状况与使用不同血清浓度密切相关，10%血清足够细胞的生长需要，血清浓度过高则会加速细胞的分化及衰老。研究发现，对于P0细胞而言，含15%FBS培养基中细胞生长明显快于5%、10%和20%FBS培养基，而无血清培养基中细胞无法生长。而在P3以后的细胞，含5%FBS培养基中细胞生长好，细胞形态大部分为长梭形，15%、20%FBS培养基中细胞生长良好，但出现细胞分化现象，形态改变。因此，建议在原代培养中使用15%FBS，而在BMSCs纯化阶段，使用5%FBS有利于获取大量高纯度的细胞。

6.2 接种密度

传统的接种密度为8×103/cm2。但晏丹等[6]通过比较BMSCs传代时的不同接种密度，认为5×103/cm2接种密度最佳，5×103/cm2接种密度有利于维持BMSCs的多向分化潜能。

6.3 选择代次

选择生长状况良好，增殖能力活跃，形态均一，纯度高， 尚未出现退化现象，具有良好生物学特性的一代。研究发现，P0细胞增殖较慢，但是在传代纯化细胞后，由于BMSCs所占的比例增加，细胞增殖逐渐加快，P3~P9细胞按1∶3传代后，均可在一周内再次传代。P10大鼠BMSCs出现细胞生长变慢，老化现象。李爽等[7]研究发现，P1-P5代最快，以后生长速度减慢。这与以往的有些文献报道不同。杨晋等研究结果表明，培养的骨髓间充质干细胞从第2代开始到第5代细胞生长周期稳定，从第5代以后，细胞生长逐渐减慢，传代周期延长，约需要10d左右。目前国内外大部分实验中使用的均为P3~P10。

稳定、有效的MSCs分离、体外培养与扩增的方法为今后骨髓BMSCs的较为深入的研究奠定了基础。

7 MSC在眼科的应用挑战

MSC作为一种成体干细胞，除具有干细胞的共性外，还具有如下优势：取材方便且对机体无害；由间充质干细胞诱导来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥问题；间充质干细胞在理论上可以向任何组织分化。尽管近年来对MSC的研究取得了很大进展，但仍然存在以下问题尚待解决：(1)成体干细胞含量极微，每10万个骨髓有核细胞中约含有1个MSC，并且随着年龄的增加或体质的衰弱，细胞的数量逐渐减少；(2)目前尚未能建立鉴定MSC的统一标准，至今还未能筛选到MSC特异性的标记分子；(3)MSC具有多系分化潜能，但向多系分化的效率尚不太理想，尤其是在体外的分化是否会引起MSC遗传特性的改变还有待进一步证实；(4)是何种信号诱导了骨髓MSC向多系分化，其诱导分化的分子机制尚不明了。综上所述，虽然理论上干细胞研究为眼科学者展示了美好的前景。然而，只有在具有巨大挑战性的屏障问题获得解决，人类疾病的治疗才能迈入“干细胞”时代。

参考文献：

[1] Zhang H, Fazel S, Tian H, et al. Increasing donor age adversely impacts eneficial effects of bone marrow but not smooth muscle myocordial cell therapy [J]. Am 1 Physiol Heart Circ Physiol, 2005,289: 2089-2096.

[2] 谢茂松,徐国兴,李琼,等.大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的比较[J].国际眼科杂志,2007,7(5) : 1285-1287.

[3] 余劲明,蔡德鸿,张桦,等.改良法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究[J].西医科大学学报,2008 ,25 (6):825.

[4] 杨丽，张荣华，谢厚杰,等.建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复, 2009,13(5):6.

[5] 赵瑛. SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定[J].重庆师范大学学报(自然科学版), 2008,25(1):75-77.

[6] 晏丹，舒赛.大鼠骨髓间充质干细胞分离与培养条件的优化研究[J].现代生物医学进展, 2008, 8(1):37.

[7] 李爽,朱家源,朱斌,等.大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养及其生长特性和表型[J].中华实验外科杂志,2007 , 24(12):1601-1602.