分析脓毒症大鼠脾组织基因表达的形式

【前言】分析脓毒症大鼠脾组织基因表达的形式由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。于术后24 h在氯胺酮腹腔麻醉下迅速剖腹、取脾,立即置入液氮中,-70 ℃保存。 1.3 基因芯片杂交及检测 基因芯片杂交和检测的方法参照文献[3-4]。 1.4 差异表达基因的比较 观察脓毒症组与对照组基因表达差异。 1.5 RT-PCR验证 根据差异表达基因,随机选取Procr、Cxcr4两个...

脓毒症及脓毒症相关的多功能器官衰竭为近年来危重病医学研究的热点与难点。脓毒症的发病率在逐年上升,病死率甚至可高达45.6%,目前已成为感染性疾病的主要死亡原因[1]。尽管在脓毒症的发病机制方面的研究取得了许多成果,但关于脓毒症脾功能障碍的基因机制仍未明确。本研究拟采用基因芯片技术从基因水平上对脓毒症脾功能障碍机制作初步分析。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备与分组

健康雄性Wistar大鼠30只[动物合格证号:SCXK(沪)2007-0005],体质量(200±20) g(购自上海斯莱克实验动物有限公司),层流室饲养。随机(随机数字法)等分成脓毒症组与对照组(n=15)。脓毒症组按Otero-Antón等[2]的CLP方法建立大鼠肠源性脓毒症模型。对照组则行开腹、关腹,但不予盲肠结扎穿孔。术毕两组大鼠均皮下注射平衡液50 ml/kg以补充术中丢失的体液并抗休克治疗,术后正常饮食、自由饮水。

1.2 脾组织标本的采集

于术后24 h在氯胺酮腹腔麻醉下迅速剖腹、取脾,立即置入液氮中,-70 ℃保存。

1.3 基因芯片杂交及检测

基因芯片杂交和检测的方法参照文献[3-4]。

1.4 差异表达基因的比较

观察脓毒症组与对照组基因表达差异。

1.5 RT-PCR验证

根据差异表达基因,随机选取Procr、Cxcr4两个基因作RT-PCR来验证数据的可靠性。

1.5.1 引物设计 利用 primer premier 3 v 0.4.0 引物设计软件设计Procr和Cxcr4的引物。并且通过NCBI中Blast功能,初步检测引物的特异性。引物由上海博星基因芯片有限责任公司合成。Cxcr4上游引物:5’CCTTATCCTGGCTTTCTTTGC 3’,Cxcr4下游引物:5’ CTCCGT GATGGAGATCCACTT 3’;Procr上游引物:5’ GAAAGGGCTGGACTGGTGG 3’,Procr下游引物:5’ CATTCTTCGTAGGCAGATGCTG 3’。

1.5.2 操作过程 把提取的总RNA逆转录成cDNA,稀释5倍, 使其质量浓度为50 ng/μl。于384孔反应板中加入如下试剂(反应体系为10 μl):Mix(2×):5 μl,Amplification primer 1 (2 μmol/L):1 μl,Amplification primer 2 (2 μmol/L):1 μl,cDNA (上面反转录得到的):1 μl,ddH2O:2 μl,抽打混匀。PCR 反应条件:Stage 1:50 ℃,2 min;Stage 2:95 ℃,10 min; Stage 3:95 ℃, 15 s (40 cycle);Stage 4:95 ℃, 15 s ;60 ℃,1 min;60 ℃, 15 s;95 ℃, 15 s。整个过程中收集荧光。温度反应结束,由熔点曲线判定 PCR 反应的特异性,根据荧光曲线的 Ct 值计算定量结果。

2 结果

2.1 差异基因表达情况

脓毒症组和对照组的总体差异基因散点分布情况如图1所示。在 22 523个基因中,与对照组比较,脓毒症组大鼠脾组织差异表达基因共205个,占基因芯片总点数的0.910%。其中表达上调者98个,表达下调者107个。表达上调基因中,已知功能基因48个,其中炎症反应相关基因10个,物质代谢相关基因8个,免疫反应、细胞生长调节相关基因各6个,信号转导相关基因5个,转录调节、酶活性调节相关基因各3个,损伤修复、物质转运、神经发育、RNA修饰、蛋白水解、细胞凋亡、DNA复制相关基因各1个。表达下调基因中,已知功能基因64个,其中物质代谢相关基因14个,细胞生长调节相关基因12个,免疫反应相关基因7个,炎症反应相关基因6个,物质转运相关基因5个,消化相关基因4个,酶活性调节相关基因3个,能量代谢相关基因2个,凝血反应、微管解聚调节、氧化还原、转录调节、细胞外形调节、信号转导、T细胞增殖调节、成骨蛋白生成调节、蛋白水解、DNA转录调节、尿钠重吸收调节相关基因各1个。见表1和表2。

2.2 RT-PCR检测结果

CXCR4,Procr基因RT-PCR检测结果见图2。实时荧光定量PCR曲线拐点清楚,扩增曲线指数期明显。溶解曲线无杂峰说明引物特异性好。最终根据扩增曲线计算出Ct值及相对比值(Fold值)。RT-PCR检测的Fold值与基因芯片检测的Ratio值比较,与对照组相比,两种方法检测出来Cxcr4与Procr表达趋势相同,都为上调。见表3。

3 讨论

目前研究认为, 脓毒症早期机体免疫系统被过度激活引起的细胞因子风暴和感染后期机体免疫系统麻痹是脓毒症的重要发病机制,其中免疫细胞的异常凋亡是导致脓毒症晚期免疫麻痹和多器官功能衰竭的重要原因[5]。近年来关于脓毒症诱导免疫细胞凋亡的研究颇多。有观点认为脓毒症所致的T及B淋巴细胞凋亡对脓毒症患者免疫功能的抑制起重要作用[6]。同样抗淋巴细胞凋亡治疗对延缓病情及降低患者病死率有一定作用[7-8]。脾脏作为人体最大的淋巴器官,由于其结构的特异性即有着规则且密度高的血窦是B(占全身60%)及T(占全身40%)淋巴细胞重要的寄居场所,有着重要的抗菌(细菌及真菌)作用。因此,脾功能的好坏直接关系到T细胞及B细胞的生存环境。Leavy[9]在Nature研究焦点一栏中提出观点认为脓毒症时,T细胞可提供重要的反馈信号到因有免疫系统进而对机体免疫力提高起重要作用,同样脓毒症时B细胞的活化有助于清除血液中的细菌从而提高脓毒症患者生存率。有研究还发现脓毒症时,脾脏中T细胞及B细胞由于非正常死亡而急剧减少,可能是造成脓毒症患者免疫功能抑制的原因[6]。然而关于脓毒症时脾组织基因表达变化的特点鲜见报道。因此,本实验采用基因芯片技术对脓毒症脾功能障碍的基因机制作初步探讨。

其次,在方法上,本实验采用盲肠穿孔结扎术(CLP)来建模,可信度高。因为CLP是人为腹腔内多细菌感染引起全身性炎症反应综合征的一种造模方法,这种实验操作具有可重复性高,在脓毒症研究中常被认为造模的金标准[10]。在脓毒症引起的心肌收缩力降低,能量代谢障碍及细胞凋亡等研究中得以广泛的应用。

再者,在数据处理上,本实验采用随机抽取两个差异基因来做RT-PCR检测mRNA表达水平,也发现其表达趋势跟基因芯片的数据一致。这进一步验证本实验数据的可靠性。

本实验脓毒症组与对照组比较,脾组织基因差异表达具有显着的脾功能障碍的特点,即脾组织细胞生长、炎症反应、物质及能量代谢及免疫反应等相关基因的紊乱,具有鲜明的脾功能障碍的特点。就脓毒症时脾组织细胞凋亡、促炎反应及物质能量代谢障碍作进一步分析发现:①本实验数据显示,与对照组相比,细胞生长调节相关基因表达紊乱明显,即上调者6个,下调者12个。且很大部分是促进脾组织细胞凋亡相关基因。如正调节凋亡相关基因上调者有Tgfb3[11]和Eaf2;抗凋亡相关基因表达下调者有Snca和Cryab。此外,炎症反应相关基因Tnfrsf8,Cxcr4也具有促凋亡作用也表现为上调。这些基因表达趋势都是促进细胞凋亡的是脓毒症脾组织细胞死亡的重要原因。②炎症反应相关基因Ace表现为上调,在本课题组前期实验中也发现Ace在脓毒症大鼠心组织中表现为上调[12]。研究表明Ace所表达的血管紧张素Ⅰ转换酶的产物为血管紧张素Ⅱ,它可诱导单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达,进而促进炎症因子“风暴”的发生从而对炎症反应起重要的促进作用[13]。其次α趋化因子 受体Cxcr4在淋巴细胞浸润和SIRS发生中也起着重要的作用,阻止Cxcr4-Cxcl12相互作用也许可成为脓毒症患者的新疗法[14]。Lbp的上调在脓毒症发生发展过程中也起重要作用,它在内毒素转运到效应细胞过程中起重要作用,而且观察还发现血清中Lbp水平与脓毒症患者严重程度呈正相关。第三,多效性作用的钙离子结合蛋白a8(S100a8)在脾组织上调度低(Ratio值:2.139 709)。Van den Bos等[15]研究证明S100a8低水平的升高对中性粒细胞及单核细胞的激活具有重要的作用。这可能对脓毒症时全身性炎症反应有促进作用。最后,抗炎相关基因Pparg(PPARγ)在脓毒症组表现为下调可能对炎症也起到一定的作用。③物质及能量代谢方面,本实验也有一些阳性的发现,如:ATP激酶活性相关基因Aldob表现为下调,负调控能量代谢相关基因Pdk4的上调[16],可能对脓毒症晚期脾组织能量代谢障碍有促进作用。

综上所述,脓毒症时脾功能障碍可能是由多种基因表达失调引起的。这些基因主要涉及细胞凋亡、炎症反应及能量代谢等方面;它们可能是脓毒症晚期引起脾淋巴细胞减少的主要原因进而对晚期免疫抑制起到了重要的促进作用。