整体柱在线固相萃取液相色谱联用系统测定

水中苯胺类污染物

液相色谱联机分析中的萃取柱及阀体系与液相色谱兼容的问题进行研究， 构建了与液相色谱进样量相兼容的大内径整体萃取柱及相关阀、泵送系统。采用四甲氧基硅烷（TMOS）和甲基三甲氧基硅烷（MTMS）作为混合前驱体， 制备了大内径（530 μm）、柱床均一、稳定的毛细管硅胶整体柱。经C18基团修饰后， 前沿分析表明该整体柱具有大的吸附容量， 其中N甲基苯胺约为214 mg/g， N，N二甲基苯胺约为388 mg/g。柱通透性好， 在线固相萃取时仅需注射泵即可完成。将该整体柱应用于本实验室自主研发的样品前处理仪上并与液相色谱联机后， 采用85%甲醇水作为流动相， 在0.5 mL/min的流速和254 nm紫外检测波长下对水中痕量苯胺类化合物进行在线富集与分离分析。在0.1， 1和10 mg/mL添加水平下， 湘江水中苯胺类化合物的回收率为81.9%-91.3%；日内与日间相对标准偏差均低于7.6%。

1引言

在线固相萃取液相色谱法是一种新的全自动分析技术， 集样品净化、富集及分离分析于一体， 已在环境、生物等样品分析中得到广泛应用[1-3]。该系统的关键部分为萃取柱和切换系统， 常常存在成本高（需使用另外的高压液相色谱泵完成固相萃取）、与液相色谱兼容性差（柱容量、进样量等）等问题[4]。因此， 研究兼容性好、成本低廉的在线固相萃取系统对于此新技术的发展有重要意义。

整体柱是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相[5，6]， 与常规装填的色谱柱相比， 具有更好的多孔性和渗透性[7]。此特性使得整体柱的阻力小， 用于在线固相萃取柱时可有效降低对输液泵的压力要求， 在在线预浓缩及固相萃取方面已有所应用[8]。

本研究采用四甲氧基硅烷和甲基三甲氧基硅烷混合单体， 利用溶胶凝胶法[9]在530 μm内径的毛细管中制备了柱床结构均匀良好、溶剂耐用性好、与液相色谱分离容量相匹配的整体C18硅胶基整体柱， 通过自制的全自动样品前处理仪与液相色谱仪联机， 建立了操作简便、设备成本低的在线固相萃取液相色谱分析系统， 并在该系统上通过在线富集方式检测了环境水样中痕量苯胺类污染物。在分析环境水样中的痕量污染物时， 常规高效液相色谱最低检出限相对较高， 对进样量有一定要求， 小内径的整体柱在作为萃取柱使用时， 常因为其柱容量较小， 萃取量有限而只能与微型液相色谱仪器在线联用[10]。大内径硅胶整体柱相比小内径整体柱具有较大的柱容量， 其作为萃取柱使用时在进样量和流动相流速方面能够与高效液相色谱相匹配， 提高了仪器兼容性。与将萃取柱和分离柱连接到在同一个六通阀的双阀装置[11]相比， 本装置采用的双阀结构将萃取柱和分离柱分别连接在两个六通阀上， 在阀切换过程中不需要改变流动相流速， 流动相通过液相色谱泵可直接将洗脱液送入检测器中进行分析检测， 大大降低了色谱图基线的波动， 提高了实验重现性。

2实验部分

2.1仪器与试剂

UB100i光学显微镜（重庆澳浦光电技术有限公司）；JSM6490LV型扫描电镜（日本JEOL公司）；DZKW型电热恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂）；KQ3200E型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；DF101S型集热式磁力搅拌器（金坛市医疗仪器厂）；LSP021B型注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）；HP5890Ⅱ型气相色谱仪（HP， Palo Alto， CA，USA）；7K82B型真空干燥箱（上海市实验仪器厂）；彩陆牌紫外检测器（北京彩陆科学仪器有限公司）；超高压液相色谱（UPLC， Waters公司）， AS63六路三切换全自动样品前处理仪（本实验室生产）。石英毛细管（530 μm i.d.， 690 μm o.d.， 河北永年锐泽色谱器件有限公司）。

HPLC分析条件：色谱柱为SpherigelC18柱（200 mm×4.6 mm， 5 μm， 大连江申公司）；流动相为85%甲醇水；流速为0.5 mL/min；紫外检测器波长选用254 nm。

甲基三甲氧基硅烷（MTMS， SigmaAldrich公司）；四甲氧基硅烷（TMOS， 北京百灵威科技有限公司）；十八烷基三甲氧基硅烷（日本东京化成工业株式会社）；尿素（Urea， 长沙市有机试剂厂）；聚乙二醇（PEG， Mr=10000， 成都金山化学试剂有限公司）；冰醋酸、甲苯、硫脲、N甲基苯胺、N，N二甲基苯胺（分析纯）；甲醇（色谱纯）；实验用水由MilliQ超纯水系统提供。

2.2整体柱的制备

称取适量聚乙二醇和尿素， 用0.01 mol/L醋酸溶液充分溶解后，缓慢滴加适量四甲氧基硅烷和甲基三甲氧基硅烷。混合物在冰浴下剧烈搅拌40 min， 并超声10 min， 充入内壁经预处理的毛细管内， 在35 ℃恒温水浴锅中反应24 h， 120 ℃干燥3 h， 依次用水、甲醇冲洗。将柱子放入真空干燥箱50 ℃下干燥12 h， 再从50 ℃升温到330 ℃（1 ℃/min）， 330 ℃保持20 h。利用十八烷基三甲氧基硅烷对制备的整体柱进行表面修饰， 制得C18整体柱。将做好的C18整体柱按要求截成适宜长度， 作为富集柱。

2.3在线固相萃取液相色谱联用装置分析过程

采用实验室自制的全自动样品前处理仪将整体萃取柱与高效液相色谱系统连接， 用于在线固相萃取的系统流路见图1， 实验所制整体柱作为富集柱放置于阀1定量环处。阀2首先处于装样（LOAD）状态， 流动相85%（V/V）甲醇水， 以0.5 mL/min的流速通过色谱泵直接进入分离色谱柱， 使基线保持稳定。

在富集过程开始前， 阀1处于Load状态， 先分别用甲醇和去离子水冲洗和活化富集柱， 将萃取装置内气泡赶走；然后用注射器A以10 μL/min将300 μL待富集液注入定量环处的萃取小柱进行富 集，持续30 min， 富集后的残留液通过废液口排出装置外。将阀1切换至进样（Inject）状态， 用注射器B以10 μL/min将洗脱液甲醇注入萃取小柱， 洗脱下来的溶液通过管路进入阀2定量环（100 μL）处。将阀2切换至进样状态， 85%（V/V）甲醇水通过定量环将洗脱液带入分离柱进行分析，

在254 nm波长下得到由紫外检测器记录的色谱图。用去离子水冲洗整个萃取装置， 准备下一次富集分析过程。

3结果与讨论

3.1大内径整体柱的制备条件优化及其富集性能考察

3.1.1制备条件优化为了使得萃取整体柱的吸附容量与液相色谱的检测容量相匹配， 并能耐受高含量有机溶剂， 宜采用大内径、无机整体柱。目前制备内径较大的毛细管整体柱， 多以3.1.2对苯胺类物质的富集性能将注射泵和紫外检测器联用， 在线检测整体柱对苯胺类物质的萃取效果。采用去离子水冲洗整个管路， 用注射泵以5 μL/min的流速将10 mg/L硫脲溶液、N甲基苯胺溶液和N，N二甲基苯胺溶液分别注入5 cm经C18修饰的整体柱， 尾端与紫外检测器连接， 在254 nm

下检测各物质的突破曲线。从图3可见， 以突破曲线上升部分中段为标准， 硫脲、 N甲基苯胺和N，N二甲基苯胺的突破时间分别约为8.1， 29.5和46.9 min。由此可得出整体柱对N甲基苯胺的富集量约为1070 ng， 对N，N二甲基苯胺的富集量约为1940 ng， 具有较好的富集效果。

3.2整体柱在线固相萃取洗脱条件考察

富集过程完成后， 在接下来的洗脱过程中， 洗脱液的量对富集效果有很大影响。洗脱液量太少， 则富集柱内有残余；洗脱液量太多， 则洗脱下来的物质会通过定量环从废液口排出。考察了洗脱液体积对富集效果的影响（图4）， 当洗脱液体积小于40 μL时， 富集柱内有较多残余未洗下来；当洗脱液体积大于80 μL时， 洗脱体积太大， 洗脱下的物质部分从废液口流走， 严重影响富集效率。综合考虑， 选用60 μL甲醇作为洗脱液。富集流速也对富集效果有影响， 当流速增大时， 待富集物与固定相作用时间短， 会造成部分流失。对比了不同流速

3.3江水中痕量苯胺污染物在线固相萃取液相色谱分析

在优化条件下取过膜后的湘江水300 μL（添加N甲基苯胺和N，N二甲基苯胺标准品的质量浓度为0.1 mg/L）， 分别采用富集后进样与直接进样（添加N甲基苯胺和N，N二甲基苯胺标准品的质量浓度为10 mg/L， 进样1 μL）进行分析（图5）。经富集后， 两种样品的峰高明显高于直接进样时的峰高， 说明该整体柱微萃取和高效液相色谱在线联用富集分析方法可降低分析检出限， 提高分析灵敏度。

4结论

利用溶胶凝胶法制备了大内径的毛细管硅胶整体柱。整体柱经C18基团修饰后， 具有较大的富集量。将C18修饰的整体柱与在线固相萃取液相色谱分离系统连接， 建立了在线富集和检测水环境中苯胺类污染物含量的分析方法。 本方法简单、灵敏度高， 适用于水中痕量苯胺类污染物的在线分析检测。

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