中药清除自由基的ESR分析研究概况

摘要：综述了近年来自由基生物学中有关中药应用顺磁共振波谱（ESR）法清除自由基的研究概况，对自由基与生命有机体、与中医药、与慢性肾衰的关系及esr对自由基的分析发展研究和发展方向进行了概述。

关键词：中药；自由基；ESR分析

中图分类号：R284文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2007)04-0675-03

自由基生物学是一门发展十分迅速的新的边缘学科，其理论与技术已应用于基础医学与临床医学，并渗入到生物化学、细胞学、动物学、植物学、药物学等多门学科领域。目前，在生物、物理、化学、生命科学等领域内，有关自由基的研究相当活跃，自由基生物学在中医药领域的应用研究也愈来愈引起人们的关注。

1自由基与生命有机体

自由基（free radical）或称游离基通常是指在原子的外层轨道上具有未配对电子的原子、原子团或特殊状态的分子或离子的总称，通常在原子符号的后面或前面加一个小圆点，以表示非配对电子。自由基学说是英国学者Denham Harman于1956年首先提出来的，其中心内容是“自由基反应普遍存在于生命有机体中，而且自由基是具有高度化学活性的中间体，在正常的生命过程中为维持生命所必需的，但自由基也是生物大分子、细胞和生物组织的危险的杀手”［1］。在生物体内常见的自由基种类很多，而超氧阴离子自由基是其中很重要的一种，它会诱发其它自由基的生成。超氧阴离子自由基（O.2-•）、羟自由基（•OH）、氢过氧基（HO.2•）、烷氧基（RO•）、烷过氧自由基（ROO•）、酰氧自由基（RCOO•）、脂质氢过氧化物（ROOH）等含氧的活性物质都具有较氧活泼的化学活性，统称为活性氧，其中O.2-•、•OH、HO.2•、RO•、ROO•属氧自由基。大多数自由基是不稳定的，存在的时间很短，但由于其化学性质极其活泼，所以作为反应中间体在生物体内起着重要作用，可直接或间接的发挥其强氧化剂作用，从而损伤生物体的大分子和多种细胞成分。在机体正常的代谢过程中，例如细胞呼吸作用和线粒体内的氧化过程均能产生超氧阴离子自由基、H.2O.2、羟自由基、单线态氧（1O.2）等许多自由基。机体内清除自由基的途径有两条：一条是通过天然抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等一系列以不同基质特异性组成的一个多水平的还原自由基及氢过氧化物系统，它们的活性随着年龄的增长而下降，其活性可以比较全面的反映机体抗氧化能力；另一条是通过天然抗氧化剂途径，如维生素E、维生素C、辅酶Q等，使自由基变成不活泼的分子，而自身比较稳定。在正常生理情况下，机体自由基的产生与清除维持在一个正常的生理水平上，处于动态平衡之中，不会造成危害。由于某些生理作用或生化反应中需要O.2-•和•OH等参与，机体还要通过自由基的产生与消除来维持有利无害的稳定平衡的自由基浓度。但在病理情况下，自由基的产生与清除失去了平衡，不论其原因是自由基的产生增加，还是机体清除自由基的能力减弱，或者两者兼而有之，其后果是大量自由基不能完全被防御系统所清除，就会在体内积累，引起生物大分子如脂质、蛋白质、核酸的损伤，导致细胞结构的破坏。O.2-•不仅本身是性质活泼的自由基，而且是导致自由基连锁反应的启动者，促使其它类型自由基的生成。越来越多的实验和临床观察表明，自由基是许多生理和病理过程的参与者，许多疾病的发生及转归直接或间接与自由基有关［2-4］。

2自由基与中医药研究

中医药学经过长期的实践，几千年的发展，蕴藏着丰富的科学内涵。中医药理论的精髓――辨证论治，就是在中医药基本理论的指导下，根据病人的临床表现辨别其疾病的病机，并依据辨别出来的病症而确立治疗疾病的方法。每一种疾病在其发展的每一个阶段，都有自己的特点，而许多疾病在其发展的过程中，时常又都有同样的病理机制。因此，在临床上，对于一个疾病发展的全过程不能限于采用某一步引起人们的重视，在确定中药临床疗效的同时，对其作用机理进行了广泛的药理学研究，并逐步弄清了部分中药的有效成分，发现中药含有许多的生物活性物质，其活性成分包括蒽醌、皂苷、生物碱、黄酮等，但仍有许多中药的有效成分不明。自由基生物医学理论的兴起，赋予了中药研究新的内容。目前已发现，中药的有效成分既可以发挥对超氧阴离子自由基的直接清除作用，即让其成为稳定的基团，又可以通过调节机体内部的氧化-抗氧化系统，增强机体的抗氧化能力，提高在氧化应激状态下保护机体的作用，达到防病治病的目的，并且对机体内产生超氧阴离子的系统具有抑制作用。因此，中药对氧化-抗氧化系统的双向调节作用，使中药在自由基生物医学研究领域中充满魅力。随着自由基生物医学的兴起，运用自由基理论对中医药理论进行现代化研究，为中医药的现代化提供了新的理论手段。

3电子顺磁共振波谱与自由基

电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance,EPR）也称电子自旋共振（electron spinresonance,ESR），简称为顺磁。ESR与核磁共振NMR同属于磁共振波谱学范畴，它们的不同之处在于，ESR是利用具有未偶电子的物质，具有带电、自旋及磁偶极距特点，在静磁场作用下吸收微波的能量完成电子能级跃迁的特性，对该顺磁性物质进行检测与分析，研究物质的结构和功能，是一种值得应用的现代分析方法。在外加磁场中，电子的自旋磁矩对外加磁场表现出两种取向：一种是电子磁矩方向与外磁场方向相同，它的能量值较原平均值减少；另一种是电子磁矩方向与外磁场方向相反，能量较高。其相应能量分别为-1/2g βH和1/2g βH。其中，g一般称为g因子，也称光谱分裂因子，表征电子的自旋角动量与其轨道角动量对分子磁矩的相对贡献； β是电子的波尔磁子；H为外加磁场。在垂直H的方向，再加一高频磁场，使其频率为v，此时，低能级的未配对电子则从高频磁场吸收能量跃迁至高能级，这就产生电子能与辐射场共振。将这种能量吸收转变为电信号，进行检测、放大，则得到ESR波谱信号。ESR波谱仪所能检出的自由基的绝对浓度约在10-8mol/L数量级左右。ESR比NMR具有更高的灵敏度；与NMR类似，样品一般不需要进行复杂的处理，可拿来直接测定，检测后样品不被破坏，对样品自身反应无干扰；对同一样品可以反复测量，可以追踪反应过程中顺磁粒子的形成、消失、再生和转移，阐明反应机制和动态过程。不论是直接检测或通过自旋捕集间接检测都是特异性的［4-5］。

自由基的测定方法有电子顺磁共振波谱法、高效液相电化学检测法、化学发光法和分光光度法等。ESR法是检测未偶电子的直接方法，在这一点上其它方法无法与之比拟，是更为简便的测量自由基的方法。当然，并非所有的物质都有顺磁粒子。不过，由于自旋标记（spin label）技术的发展，使ESR可以借助于自旋标记化合物，观察和研究大量非顺磁性材料，包括药物、生物膜，以至完整的活细胞等，从而大大扩展了ESR的应用范围［5］。

4中药清除自由基与ESR在中医药领域的应用

近年来，探索自由基的代谢规律，筛选适宜的天然药物，已逐渐成为当前医药学界研究的热点之一。中医药的抗氧化作用虽然可分为清除自由基及抑制氧自由基产生两个方面，但是，由于中药复方制剂甚至单味中药，其有效成分具有多样性的特点，因此，其抗氧化作用机制常常是两方面同时具备。目前，有关O.2-•的产生及其分析检测方法的研究基本上都是通过对超氧化物歧化酶活性的测定，间接的推论O.2-•的存在。采用电子自旋共振（ESR）法直接观察O.2-•产生的动力学过程的工作已见报道［4，6］

，用ESR法直接观察O.2-•信号的变化，并以此评估中药对O.2-•的增抑作用近年来亦有所报道［7-17］。但从中药或复方中药制剂提取活性成分有效部位化学成分进行ESR研究，以观察其清除O.2-•能力的研究文献相对较少。从目前中药抗氧化的研究报道来看，尽管不乏高水平、高难度的研究，但仍存在着低水平、同一水平重复研究的问题。因此，加强中医药理论指导下的中药量效关系的研究，从简单的粗提物的研究或纯化学成分的研究，向分离中药有效部位群的研究过渡；从单味药的研究向复方中药制剂的研究过渡，采用ESR法观察中药清除O.2-•作用，从中药材中提取其活性成分进行实验，其结果就是希望能比较客观、准确地反映其清除自由基的作用及其作用机理，探讨中药在体内外的作用，提出合理的给药方法，既保留中医药辨证论治特色，又提高中药整体研究水平，获得高效低毒质优的中药制剂，从而使中医药抗氧化研究跨上一个新台阶。

5慢性肾功能衰竭与自由基

慢性肾功能衰竭（Chronic Renal Failure,CRF）是各种病因引起的肾脏损害，及肾脏系统性疾病所引起的慢性肾功能减退，以及由此产生的各种症状和代谢紊乱所组成的综合症和进行性恶化的结果。由于肾脏调节和排泄功能失常，临床上出现累及多系统的严重综合症群，尤其表现在血中氮质潴留、酸中毒、电解质紊乱、贫血和代谢障碍等。近年来，由于人们生活方式的改变，人口寿命的延长和糖尿病发病率的升高，CRF的发病率也在逐渐增长，严重危害着人类的健康。目前，对于该病的治疗主要以透析和肾移植为主的肾脏替代治疗。但是由于受到肾源的限制，透析疗法是目前治疗CRF的主要方法，这包括血液透析和腹膜透析两种。但肾脏衰竭和透析患者，常常伴随多种并发症的发生，例如，白内障、动脉粥样硬化、血小板功能障碍等。这是因为透析时，许多小分子抗氧化物质丢失，导致机体抗氧化防御功能下降，使正常组织细胞易受自由基攻击，表现为患者血液脂类过氧化产物明显增加。除前述的抗氧化酶化学的改变外，许多血清成分与承担着一定的抗氧化功效，透析过程会导致许多小分子物质的丢失，因此也可能导致一些物质代偿性生成增加，例如尿酸可能代偿性增高。另有研究证实，在慢性肾功能不全中，在肾功能衰竭进展时，肾毒素甲基胍大量产生，致使甲基胍蓄积，加重尿毒症病情，形成恶性循环。甲基胍的大量产生，与体内缺氧、瘀血的状态下产生过量的氧自由基有关。活性氧及自由基在肾炎、肾病综合症、肾功能不全等疾病中的重要性已逐渐被明确，有关肾脏疾病与自由基损害的关系也已逐渐为人们所关注。药理实验研究表明，治疗肾脏病方药在临床取得较好疗效的作用机理之一，与清除自由基或减轻自由基引起的损害有关；治疗慢性肾衰时广泛应用的中药大黄等单味药提取液或其中所含有效成分具有清除自由基作用，能降低肾功能不全实验大鼠血中尿毒症物质尿素氮、肌酐、甲基胍、胍基琥珀酸，改善高磷低钙血症，促进尿中甲基胍的排泄，延长存活时间，全面改善尿毒症状况［15-22］。

肾脏疾病临床治疗目前昂贵的医疗费用给社会带来沉重的负担，从天然植物尤其是从中药中寻找低毒、高效的药物是国内外有关学者关注的重要课题。自由基学说的介入，有助于深化对传统中药治疗CRF的认识，为开发新的治疗肾脏疾病的方法和在众多的中药中寻找低毒、高效的药物提供新的理论指导。

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