影响静止中心(QC)细胞分裂的EMS突变体库构建与筛选分析

【前言】影响静止中心(QC)细胞分裂的EMS突变体库构建与筛选分析由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。LIU Wen-gui，XU Jian （National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070， China） Abstract： A forward genetics approach were utilized to transgenic Arabidopsis SCRGVG UAS∶∶axr3-1 for EMS mutagen...

摘要：采用正向遗传学方法，以转基因拟南芥（Arabidopsis）SCRGVG UAS∶∶axr3-1为材料来进行EMS诱变。通过外源施加激素DEX诱导GVG/UAS系统启动axr3-1在静止中心表达，导致静止中心发生分裂。通过构建EMS突变体库，得到2 616份M2代候选突变体家系。对M2代种子进行初筛得到43个候选家系。经过复筛，获得22个具有稳定表型的突变体家系。根据表型相似性将候选家系分为 5类，共6 组。将候选家系进行组内杂交，根据 F1代植株表型是否与亲本相似，获得2对等位突变体。这些突变体将为研究干细胞小生境的调控机制研究提供新材料。

关键词：拟南芥（Arabidopsis）；根的发育；静止中心；EMS突变体库

中图分类号：Q291 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）05-1307-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.05.056

Construction and Screening of Arabidopsis EMS Mutant Library for the Effection of Divding Quiescent Center Cells

LIU Wen-gui，XU Jian

（National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070， China）

Abstract： A forward genetics approach were utilized to transgenic Arabidopsis SCRGVG UAS∶∶axr3-1 for EMS mutagenesis. The transgenic Arabidopsis SCRGVG UAS∶∶axr3-1 was expressed of axr3-1 specifically in the SCR-expressing cells in the presence of DEX， leading to cell divisions in the QC. An EMS mutant library was generated and a total of 2 616 M2 lines was obtained. Through a preliminarily screening of M2 lines，43 candidate lines were identified. A second round of screening was then performed and led to the identification of 22 candidate mutant lines that displayed stable phenotypes over generations. According to the phenotypic similarity， these candidate lines were divided into 5 categories，6 groups.And the candidate lines were hybridized in each groups. Based on the phenotypic similarity between the parental lines and F1 progeny，two pairs of allelic mutants were identified. The mutant materials would provide new materials for the study of mechanisms underlying the quiescence of the QC.

Key words： Arabidopsis； root development； quiescent center； EMS mutant library

在植物根冠与分生组织区交界处有一个根的组织中心（Organizing center），该处的细胞基本不发生分裂和分化，因此又称为静止中心（Quiescent center QC）。1954年Clowes[1]在玉米根尖中发现，顶端分生组织中最中央区域细胞分裂频率很低或不分裂。利用放射自显影技术，在玉米、蚕豆、洋葱根尖中分生组织区中，有一个区域细胞几乎没有发生DNA的合成，因而确定无细胞的分裂，被命名为静止中心。

拟南芥（Arabidopsis）的静止中心可以追溯到第一次合子分裂后所产生的基细胞。经过数次分裂后产生一长列细胞胚柄的最上端的子细胞即为胚根原细胞（Hypophysis）。而胚根是16细胞时期下侧的8细胞产生的。在静止中心的周围是根的各类干细胞（Stem cell），它们通过不对称分裂进行更新并产生可以分化为不同类型根细胞的子细胞来维持根的生长。静止中心能够产生一个小范围的信号来调控其周围干细胞的分裂与分化[2，3]，其覆盖的区域通常称为干细胞小生境（Stem cell niche），而干细胞分裂产生的一些子细胞正是由于超出了信号控制范围才开始分裂和分化[4，5]。

植物根系是由根分生组织连续的细胞分裂和持续发育来维持的，其调控中心为静止中心（QC），由WOX5的表达保持周围干细胞的特性[6]。SCR（SCARECROW）由在中柱的SHR mRNA翻译的蛋白激活而与中柱启动子SHR结合形成复合物，对皮层内皮层起始区（Cortex/endodermis initials CEI）、相关组织及内皮层分化进行核定位。同时，SHR：SCR复合物在QC位置进行表达，调控QC的维持和分化；另一方面，WOX5（WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5）是WUSCHEL（WUS）的同源基因。它是根尖特异表达的启动子，维持根部分生组织区干细胞的功能。WOX5功能缺失突变体表现为干细胞终止分化，静止中心细胞的形状发生改变，并且比正常的QC细胞大一些。

生长素通过对AUX/IAA蛋白水平生物调节快速诱导一系列生长素响应基因的表达，完成生长素的信号转导。Aux/IAA是一类稳定性低的转录蛋白，外源生长素处理促进Aux/IAA蛋白的降解。这一特征暗示着Aux/IAA基因的高度表达能补充Aux/IAA蛋白总量。拟南芥基因编码的Aux/IAA蛋白有29个，其结构保守，序列由4个高度保守域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ）构成[7-10]。域Ⅲ内部的两个区域具有同源性，形成βα1α2二聚体[9]，是DNA的结合位点。两者主要的区别就是在区域Ⅱ中的一个脯氨酸突变成了亮氨酸。发生在功能区域Ⅱ的突变会造成显性或半显性的aux/iaa突变，而这段序列是生长素介导AUX/IAA降解所必需的，因此，这段序列发生突变会导致aux/iaa的蛋白趋于稳定，减少生长素响应基因的转录，进而抑制生长素反应。经过遗传筛选，目前已知的Aux/IAA突变体都是显性突变，突变位点都在结构区域Ⅱ中，iaa17/axr3-1是其中的一个突变体[11]。

本试验通过构建SCRGVG UAS∶∶axr3-1 EMS 突变体库，筛选与根尖静止中心（QC）细胞分裂有关的突变体。GVG/UAS（GAL4-VP16-GR/upstream active sequence）GAL4/UAS系统是果蝇遗传学中一种常用的异位表达系统。axr3-1是AXR3的一个突变体，属于Aux/IAA中的一种。通过EMS处理SCRGVG UAS∶∶axr3-1获得特异影响生长素信号转导进而影响拟南芥根系QC分裂的突变体，将为研究干细胞小生境的调控机制研究提供新材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

诱变材料是华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室须健课题组保存的Columbia-0（Col-0）背景下的SCRGVG UAS∶∶axr3-1拟南芥种子。突变体库初筛材料是诱变材料经过EMS诱变之后自交繁种获得的M2代种子。突变体库复筛材料是具有表型的M2代植株自交繁种获得的M3代种子。

1.2 试验方法

1.2.1 EMS诱变方法 称取 0.1 g约5 000粒M0 代种子作为诱变材料，将种子浸泡在磷酸缓冲液中 4 ℃过夜，再加入EMS至终浓度0.4%，室温下微动孵育8 h。之后用水将 EMS 洗掉，接触过 EMS的试剂或耗材都需经过特殊处理之后分类处理。用0.1%琼脂糖悬浮 M1代种子点种在营养土中，22 ℃ 16/8 h光/暗培养。最终收获约 2 616个可用于筛选的M2代家系[12]。

1.2.2 种子灭菌及幼苗生长培养条件 0.5×MS培养基配制：2.15 g/L MS 粉末，添加 10 g/L 蔗糖、0.5 g/L MES、1%琼脂，pH为5.8，高压灭菌备用。拟南芥种子去除果荚之后晾干。取适量种子装在1.5 mL 离心管中，加入1 mL 15%次氯酸钠，振动筛上摇晃，消毒10 min后快速离心，用灭过菌的去离子水清洗3遍，然后用0.1%的琼脂悬浮。将灭过菌的拟南芥种子点种在含有0.5×MS和肾上腺皮质类激素地塞米松（DEX）的培养基方皿上，封口置于4 ℃冰箱春化2 d，再在培养架上培养5 d，培养条件均为 22 ℃ 16/8 h光/暗培养。

1.2.3 DEX 处理方法及筛选 用DEX处理的种子在培养基中加入终浓度为5 μmol/L的DEX，处理7 d 后观察野生型与候选突变体的主根长的表型差异，用相机（Canon EOS 40D）拍照，用荧光体式显微镜（Leica MZ 16F）观察其荧光表达模式及强度并拍照，并用激光共聚焦显微镜（LEICA SP2）观察QC位置细胞分裂及GFP的情况。培养生长条件为22 ℃ 16/8 h光/暗培养。

为了确定诱导激素DEX的最佳浓度，分别用2.5、5.0、10.0 μmol/L DEX培养基处理突变体SCRGVG UAS∶∶axr3-1，以加入二甲基亚砜（DMSO）的1/2 MS培养基作为对照，以拟南芥突变体主根的生长情况、静止中心位置GFP荧光分布及强度为指标，连续观察第5、6、7、8天幼苗的生长情况。用Image J软件分别测出每天的主根长度，得到根长平均值。重复4次。

1.2.4 杂交和等位突变体判断 将表型一致或相似的突变体分成小组，各小组样本相互杂交获得 F1代种子。杂交方法参照吴晓丹等[12]的方法。将F1代种子点种在终浓度为5 μmol/L的DEX 培养基上。分析F1代植株及亲本表型，若F1代植株具有和亲本相似的表型，则这两个亲本为等位突变体，反之则不是等位突变体。

2 结果与分析

2.1 DEX浓度筛选结果

不同浓度DEX处理下拟南芥突变体主根根长在7 d之后均不再增长，第7天和第8天的幼苗根长长度较长。第7天和第8天，5 μmol/L DEX处理下主根根长略长于其他浓度下的根长（图1）。初步确定选用7、8 d为处理天数。

通过观察静止中心及根尖干细胞位置的GFP分布及强弱情况，发现7 d时，5.0 μmol/L的DEX处理拟南芥突变体主根静止中心位置GFP强度较强，GFP表达更为均匀，且可以初略看到静止中心位置细胞发生了分裂（图2）。所以最终确定以5 μmol/L的DEX处理7 d的幼苗为筛选的适合条件。

2.2 转基因材料SCRGVG UAS∶∶axr3-1在DEX处理下的表型观察

由于axr3-1是组织性表达的生长素抑制子，表现为抑制根的生长，在胚根发育生长时就开始表达，从而会影响根部的发育萌芽。采用诱导系统GVG/UAS，用外源皮质类激素DEX诱导后才能进行表达，从而有利于根部的生长。将生长5 d的种子移入含5.0 μmol/L DEX的0.5×MS培养基处理，观察8、24、36、48 h，3 d时分生区及qc位置细胞的变化，在激光共聚焦显微镜（LEICA SP2）和荧光体式显微镜（（Leica MZ 16F）下拍照，观察到DEX促进了转基因材料QC位置细胞的分裂，说明 DEX诱导了系统表达，使QC位置细胞分裂（图3）。

2.3 候选家系分组及等位突变体获得

将获得的M3代进行复筛，得到表型稳定的相关候选家系43个。在对候选家系复筛时，以候选家系在1/2 MS上培养为对照组，用以确定筛选到的候选家系中的DEX诱导体系没有发生突变，DEX处理后可以诱导GFP表达及产生静止中心区域表型。经过2次复筛，最终获得具有稳定表型候选家系22个（表1）。依据其表型的类似度将其分为5类，共6组，具体分组依据及每一组突变体编号如表1所示，通过组内的两两杂交试验，最后得到2对等位突变体，分别为第二类中的19-15-3与4-112-1，第四类中的20-7-1与21-2-1。

3 讨论

本试验构建了SCRGVG UAS∶∶axr3-1拟南芥转基因体系，诱导系统GVG/UAS的存在而进行异位表达。

由于植物细胞的不可移动性，植物干细胞小生境又是植物生长发育的源泉和信号调控中心，所以根尖分生区细胞的活性对植物整个根系的发育具有重要意义。近年来，通过对拟南芥根尖干细胞小生境的研究，发现通过激素和转录因子的协调作用，灵活地调控干细胞小生境的特化与维持。面对不同环境，植物干细胞小生境会做出复杂的应答机制，但目前研究者对这个机制了解不多。

根尖静止中心的生长素浓度是最高的[11]，由此可见，此处的生长素信号可能具有重要作用。目前，发现了静止中心和柱干细胞之间WOX5/ACR4/CLE的反馈调节途径。现在的研究结果主要集中于静止中心上方细胞的分裂分化行为，与已有的途径不能整合，根尖干细胞调控网络还需大量补充。通过对相关转基因材料的突变体的分析，研究根尖表型并找出相关基因，可以进一步阐明静止中心生长素信号网络，明确QC及周围干细胞调控的分子机制。

参考文献：

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