稳定同位素iTRAQ标记/高效液相色谱-串联质谱法同时定量分析人体中42种氨基酸及典型病例

摘 要 [HTSS]建立稳定同位素itraq标记/高效液相色谱串联质谱法同时定量分析人体中42种氨基酸的方法。人生物样本经磺基水杨酸沉淀蛋白，稳定同位素iTRAQ115衍生化后，加入iTRAQ114同位素标记的氨基酸内标液进样，选用AAAC18色谱柱，以水乙腈（含有0.01%七氟丁酸、0.省略[HT]

1 引 言

氨基酸是生命的基石，是人体基本营养物质，也是蛋白质的组成单位。自然界中已发现的氨基酸有180多种，人体内重要的氨基酸有40多种，包含10种必需氨基酸、20多种蛋白氨基酸和一些有重要生理意义的氨基酸，统称为“全谱氨基酸”（见表1）。全谱氨基酸的失衡是众多疾病的诱因或表现形式，涉及代谢、肿瘤、免疫、病毒感染、心脑血管、神经系统、肾病、糖尿病、亚健康、老年病等各类疾病和儿童生长发育、营养健康、肌肉骨骼生长、激素分泌、解毒功能等人体各种健康环节。因此，检测全谱氨基酸对于人体健康和疾病的诊断筛查及研究等具有重要意义\[1\]。

目前，氨基酸检测技术繁多，1958年Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化。其后，新的氨基酸分析方法不断涌现，柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱积分脉冲安培检测法、毛细管电泳法、质谱法等相继应用于氨基酸分析\[2～10\]。

采用液相色谱串联质谱法（LCMS/MS）测定体内化合物，具有选择性好、灵敏度高、分析时间短等优点，已普遍应用于生物体内研究。稳定同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术，具有较好的定量效果、较高的重复性，并可对多达4种不同蛋白质样本同时进行定量分析，iTRAQ已成功应用于小分子氨基酸LCMS/MS和GCMS的定量检测\[11～13\]。本实验室在文献基础上探索全谱氨基酸iTRAQ试剂稳定同位素标记的准确定量方法，精确度和重复性都有很好的保证，与传统的毛细管电泳法、HPLC法、氨基酸分析仪比较，无论是精度、还是检测的范围和检测结果的准确度都有很大的提高和改善。2 实验部分

2.1 仪器与试药

3200QTRAP型液相色谱串联质谱仪（美国Applied Biosystem公司），配有电喷雾离子化源（ESI）以及Analyst 1.4.2 数据处理软件；UltiMate3000标准型液相色谱仪（美国戴安公司），包括双三元梯度泵，自动进样器，柱温箱，切换阀；氮吹浓缩仪（日本东京理化器械株式会社）。

iTRAQTM试剂盒（200人份），批号：0709002（美国Applied Biosystem公司），包括：400

SymbolmA@ mol/L正异亮氨酸的10%磺基水杨酸溶液、标记缓冲液（0.45 mol/L硼酸盐缓冲液，pH 8.5, 含有20

SymbolmA@ mol/L正缬氨酸）、115iTRAQ衍生化试剂（15人份/瓶，每瓶用70

SymbolmA@ L异丙醇稀释后使用）、1.2% 羟胺水溶液、iTRAQ114同位素标记的44种氨基酸内标（用0.5%甲酸标准稀释液溶解后使用），氨基酸信息见表1。

分 析 化 学第40卷

第5期飞等： 稳定同位素iTRAQ标记/高效液相色谱串联质谱法同时定量分析人体中42种氨基酸及典型病例

注：m/z 114.11为同位素内标iTRAQ114衍生化后子离子，m/z 115.11为生物样本中氨基酸iTRAQ115衍生化后子离子。

（m/z 114.11: ionpairs of iTRAQ reagent 114labeled amino acid isotope internal standard; m/z 115.11: ionpairs of iTRAQ reagent 115labeled amino acid in biological samples）.[BG）W][HT][]

2.2 溶液的配制

稀释的iTRAQ115衍生化试剂：将每瓶所需的115iTRAQ试剂放至室温，涡流并旋转离心，使溶液滑至底部，加入70

SymbolmA@ L异丙醇，涡流混匀并旋转离心，在瓶上记录当前时间，稀释的iTRAQ试剂冷藏保存，有效期1个月。

iTRAQ114同位素标记的44种氨基酸内标液：加入要求体积的0.5%甲酸水标准稀释液，涡流混匀1 min，旋转离心，iTRAQ试剂114标记氨基酸的最终浓度均为5

SymbolmA@ mol/L。

[FQ（1２２\.22,Y－ＷＺ][HT5”SS][*4]表2 梯度洗脱条件

Table 2 Conditions of gradient elution

[HT6SS][BG（][BHDFG4,WK６\.２，ＷＫ８。２W]时间

Time

（min）流速

Flow rate

（

SymbolmA@ L/min）

流动相Ⅰ

Mobile phase Ⅰ

（%）

流动相Ⅱ

Mobile phaseⅡ

（%）

0.0085098210.00850722810.10850010016.00850010016.1085098225.00850982[BHDFG５*2,WKZQ0W] 流动相（Mobile phase） Ⅰ：水（0.01%七氟丁酸和0.1%甲酸）（0.01% Heptafluorobutyric acid and 0.1% formic acid in water）；流动相（Mobile phase）Ⅱ：乙腈（0.01%七氟丁酸和0.1%甲酸）（0.01% Heptafluorobutyric acid and 0.1% formic acid in acetonitrile）。[BG）W][HT][]

2.3 色谱条件

色谱柱：AAAC18柱（150 mm×4.6 mm I.D.，5

SymbolmA@ m，AB SCIEX公司）；流动相：水（含有0.01%七氟丁酸、0.1%甲酸）乙腈（含有0.01%七氟丁酸、0.1%甲酸）, 梯度洗脱条件见表2；柱温：50 ℃；进样量：2

SymbolmA@ L。

2.4 质谱条件

离子源：离子喷雾离子化源正离子化模式；离子喷射电压：3000 V；离子源温度：580

SymbolpB@ C；源内气体1（GS1，N2）压力：345 kPa；气体2（GS2，N2）压力：414 kPa；气帘气体（N2）压力：138 kPa；扫描方式为多重反应监测（MRM）；碰撞气（N2）压力：Medium；解簇电压（DP）为：35 V；碰撞能量（CE）为：30 eV；全谱氨基酸用于定量分析的离子对见表1。

2.5 生物样品处理

移取40

SymbolmA@ L样品（血浆/尿液/脑脊液）置于1.5 mL EP管中，加入10

SymbolmA@ L 10%磺基水杨酸（含有400

SymbolmA@ mol/L正异亮氨酸），漩涡混匀30 s，10000 r/min离心2 min沉淀蛋白。移取10

SymbolmA@ L上层液体置另一个1.5 mL EP管中，加入40

SymbolmA@ L标记缓冲液（含有20

SymbolmA@ mol/L正缬氨酸），漩涡混匀，瞬时离心。移取10

SymbolmA@ L上层液体置于另一个1.5 mL EP管中，加入5

SymbolmA@ L稀释的iTRAQ115衍生化试剂，漩涡混匀，瞬时离心，室温下孵化至少30 min。加入5

SymbolmA@ L 1.2%羟胺，漩涡混匀，瞬时离心，终止衍生化反应。样品在氮吹仪上45

SymbolpB@ C氮气吹干。加入32

SymbolmA@ L含iTRAQ114同位素标记的内标液，漩涡混匀，旋转离心。进样2

SymbolmA@ L进行LCMS/MS分析。

2.6 定量分析及数据处理

样本处理后经LCMS/MS平台上特定的采集方法运行，得到总离子流图（图1），提取44种氨基酸对应的iTRAQ115和iTRAQ114的MRM离子流图， 进行积分处理。每2

SymbolmA@ L进样中，含有10 pmol从内标溶液中带入的每种iTRAQ114试剂标记的氨基酸，根据特定的校正系数计算样[TS（][HT5”SS] 图1 全谱氨基酸总离子流图

Fig．1 TIC of full spectrum of amino acid[HT][TS）]本中氨基酸含量。正异亮氨酸和正缬氨酸属于非人体内氨基酸，样品测试中同时含有10 pmol正异亮氨酸和正缬氨酸。正异亮氨酸在样品预处理步骤引入，用于检验经过沉淀后氨基酸的回收率，通过正异亮氨酸回收率校准每种氨基酸的测定结果。正缬氨酸在标记步骤引入，用于检验标记反应的效率，反应效率在80%～120%为合格，超过此范围则此例分析数据作废。

3 结果与讨论

3.1 全谱氨基酸高通量检测的基本情况

样本采集前禁食12 h，采血时注意空腹，不能饮用饮料或服用药品。血样采集使用肝素抗凝管，采集全血样本大于0.5 mL，采血后立即颠倒混匀5～6次，于30 min以内离心分离血浆，

Symbolm@@ 20

SymbolpB@ C冰冻保存待测。同时填写调查问卷，主要包括基本资料（姓名、性别、年龄、籍贯、民族、职业等）、健康状况（作息、吸烟、饮酒、睡眠、运动、压力、近期饮食、营养补充等）、疾病状况（现病史（接触史）、既往史、家族史、初步诊断、用药/保健品情况）等。

3.2 典型病例

3.2.1 病例1含硫氨基酸代谢通路异常所致的视力下降 患者，男，66岁，既往高血压史，突发视力下降，左眼0.1，怀疑遗传型鸟氨酸血症所致。经全谱氨基酸质谱检测与分析，蛋氨酸、谷氨酰胺偏高，苏氨酸、胱硫醚、同型半胱氨酸偏低。综合分析：蛋氨酸升高，其它含硫氨基酸降低，怀疑含硫氨基酸代谢通路异常，否定遗传型鸟氨酸血症所致。可能是蛋氨酸酸腺苷转移酶（MAT） 和/或胱硫醚合成酶有异常，从而导致蛋氨酸和同型半胱氨酸结缔组织堆积，致晶体异位（Ectopia lentis）或半脱位（Subluxation）。属遗传性疾病。建议：用高剂量Vb6 100～1200 mg/d，同时补充叶酸。若还未控制，应进一步限制蛋氨酸摄入（肉类含较多蛋氨酸），补充胱氨酸、甜菜碱和叶酸。

3.2.2 病例2 急性四氯乙烯中毒及其所致氨基酸代谢紊乱 患者，女，46岁，因职业经常接触洗衣液（主要成分为四氯乙烯），且房间属新装修，未充分通风散味。就诊后查心电图、TCD（经颅多普勒超声）、血常规、肝肾功、雌激素、甲状腺功能及毒物检测，均未发现明确异常。全谱氨基酸检测结果显示,鸟氨酸、天门冬氨酸、甲硫氨酸和3甲基组氨酸含量分别偏高56.1%, 98.5%, 80.3%和75.5%。根据患者接触四氯乙烯职业史以及神经系统、呼吸系统为主的临床表现，结合全谱氨基酸检测结果，排除其它疾病，诊断为急性四氯乙烯中毒及其所致氨基酸代谢紊乱。患者经吸氧、服用乳果糖口服液、绿豆解毒后症状消失，目前状态平稳。

3.2.3 病例3 色氨酸缺乏导致强迫症 患者， 女， 21岁，3年前曾突发精神类疾病，多方诊断为精神病并采用药物治疗，未有明显进展。全谱氨基酸检测结果表明，组氨酸、亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、天门冬酰胺及胱氨酸多个氨基酸偏低；氨基酸代谢组学分析认为， 精神状态及神经系统异常，如抑郁、失眠、精神分裂等； 另外，肌肉和骨骼肌生长代谢、骨骼重吸收、肌肉损伤、剧烈运动等均有异常。色氨酸是5羟色胺前体，色氨酸缺乏导致的神经元外周组织的5羟色胺降低，5羟色胺有中和肾上腺素与去甲肾上腺素的作用，并可改善睡眠的持续时间。初步诊断为色氨酸缺乏导致强迫症。分析认为天门冬氨酸和谷氨酰胺偏高是由于补充色氨酸代谢通路影响所至，色氨酸总体浓度偏大。患者降低色氨酸剂量为原剂量2/3后，症状控制良好，并无其它明显不适。

3.3 LCMS/MS全谱氨基酸高通量检测方法讨论

氨基酸和氨基酸衍生物分子量均较小，宜选用较小的离子喷射电压，本实验的流速为850

SymbolmA@ L/min，离子喷射电压不宜太低，离子喷射电压在1500～5500 V信号均较高且变化不大。因此，设定离子喷射电压为3000 V。离子源温度650 ℃离子化温度过高，易造成离子化过程中部分中性基质碳化或焦化，污染离子源，实验中液相流速为850

SymbolmA@ L/min，过低的离子化温度易造成离子化程度不充分，从而影响氨基酸检测响应值和定量结果。经优化，离子源温度设置580 ℃后，离子化效果影响较小且不易焦化。

使用含有0.01%七氟丁酸和0.1%甲酸的乙腈和水为流动相，在本实验梯度条件下，采用高保留色谱柱进行分离，在15 min可以同时检测88种离子对，涉及44种氨基酸及对应的同位素内标、同分异构体（肌氨酸、丙氨酸、β丙氨酸，γ氨基丁酸、β氨基异丁酸、α氨基正丁酸，缬氨酸、正缬氨酸，亮氨酸、异亮氨酸、正异亮氨酸，1甲组氨酸、3甲组氨酸等）均能够基线分离，见图2。极少量七氟丁酸可以促进氨基酸在色谱柱上的保留，当七氟丁酸含量升高时反而会抑制质谱信号，三氟乙酸促保留能力不及七氟丁酸， 且离子化抑制高于七氟丁酸，加入甲酸可以提供质子，增强正离子化信号，并提高氨基酸色谱峰信噪比。

[TS（][HT5”SS]图2 氨基酸同分异构体基线分离

Fig．2 Chromatographic baseline separation of isomeride amino acids[HT][TS）]

iTRAQ试剂标记的过程比较复杂，若样本批量较大时，可以采用96孔板处理，提高工作效率。运用iTRAQ试剂标记氨基酸可以将氨基酸碎片离子从低分辨率的背景中脱离出来，提高检测的灵敏度。每个氨基酸都有自己的独立同位素内标，色谱行为、质谱的离子化效率和基质效应均能完全一致，可以通过质谱准确定量，灵敏度（pmol级）和精确性均较高，线性范围宽不受柱效降低影响检测结果。

由于氨基酸检测受影响因素较多，生理样品采集一定要保证采集前禁食12 h，采血时注意空腹，不应服用饮料、药品。本研究结果表明，全血中氨基酸浓度明显高于血浆氨基酸浓度，全血中由于活细胞的存在，放置过程对氨基酸有所消耗，且复杂基质不利于检测，因此，选择血浆进行体内氨基酸浓度测定，且应于采样后快速分离血浆（30 min内）。尿液和脑脊液采集后需高速离心后进行样品前处理。

本方法结合氨基酸代谢组学研究已成功用运于临床诊疗和营养评估。检测的氨基酸涉及尿素循环、鸟氨酸循环、神经内分泌代谢、氨能量代谢、硫代谢、运动代谢组学等多个代谢组学系统，可为氨基酸代谢组学分析研究提供技术支持和参考。

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Simultaneous Determination of 42 Amino Acids in Human Body by

Stable Isotope Isobaric Tage for Relative and Absolute

Quantitation LabeledLCMS/MS with Typical Example Cases

LI PengFei1, WANG Yan1, TAO BeiBei2, WANG Jing1,

LUO Jing1, ZHANG XuDe2, AN ZhuoLing1, LIU LiHong*1

1（Pharmacy Department of the Second Artillery General Hospital, Beijing 100088, China）

2（Beijing Amino Medical Research CO., LTD, Beijing 100088, China）

Abstract To develop a LCMS/MS method for the simultaneous determination of 42 amino acids in human body by stable isotope isobaric tage for relative and absolute quantitation （iTRAQ） labeled. After preciptitated by sulfosalicylic acid and labeled by iTRAQ reagent 115, the biological samples were added iTRAQ reagent 114labeled amino acid as isotope internal standard, and separated on an AAAC18 column using water and acetonitrile （both containning 0.01% heptafluorobutyric acid and 0.1% formic acid） as mobile phase by gradient elution. Detection was carried out by multiple reaction monitoring （MRM） on a 3200QTRAP LCMS/MS system. Quantitation was completed by isotope internal standard which also could remove the systematic error. 42 amino acids and isomers were chromatographic baseline separated. The assay was successful applied to clinical diagnose and treat. The method is a rapid, sensitive, selective and highflux for the determination of amino acids metabolism disease and nutritional evaluation.

Keywords Liquid chromatographytandem mass spectrometry; Full spectrum of amino acid; Highflux quantitating; Isobaric tage for relative and absolute quantitation

（Received 16 August 2011; accepted 27 October 2011）

庆祝《分析试验室》创刊30周年暨分析测试技术学术交流会

为庆祝《分析试验室》创刊30周年，回报长期以来关心、支持《分析试验室》杂志的广大分析测试工作者，发挥《分析试验室》期刊作为专业媒体的作用，拓宽和强化学术交流平台，促进分析测试工作的交流与发展，北京有色金属研究总院、中国分析测试协会联合《分析试验室》期刊，定于2012年联合举办“分析测试技术学术交流会”。

会议时间：2012年10月

会议地点：北京

会议将邀请专家针对分析测试技术在矿物、新型材料、环境保护、食品与药物、生物分析等领域的应用及最新进展作大会专题报告，并以"《分析试验室》创刊30周年纪念专辑"的形式隆重出版大会论文集。现开始向全国各行业分析测试专业人士征稿，并欢迎各界人士前往参加会议进行交流。

征文范围：1. 矿物与金属材料分析测试研究论文；2. 环境保护分析测试研究论文；3. 有机物与药物、生化分析研究论文；4.省略

中国分析测试协会 北京有色金属研究总院