非小细胞肺癌患者外周血Survivin mRNA的表达及临床意义

【摘要】 目的 通过对非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）患者外周血生存素（Survivin）mRNA的检测；探讨其对NSCLC诊断的临床价值和意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测55例非小细胞肺癌患者、60例对照组的外周血Survivin mRNA的表达情况。结果 Survivin mRNA在NSCLC组的阳性率显著高于对照组（P

【关键词】 Survivin mRNA；外周血；RT-PCR；非小细胞肺癌

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.053 文章编号：1004-7484（2013）-06-2913-01

肺癌目前是全世界发病率、死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌占80-85%[1]，但目前缺乏特异且敏感的早期病变的诊断指标。外周血中肿瘤标志物的检测有助于发现常规方法不能发现的存活于血循环中的微小肿瘤细胞灶。本研究旨在通过RT-PCR方法检测NSCLC患者外周血中survivin mRNA的表达情况，探求NSCLC早期诊断、早期血道微转移检测的特异、敏感指标，为临床应用提供理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验对象 选择2010年4月至2011年2月大连医科大学附属第一医院收治的相关患者。恶性肿瘤组55例：男性31例，女性24例，年龄30-77岁；其中腺癌40例，鳞癌14例，大细胞癌1例。所有病例均经病理检查证实。患者采血前均未行化疗或放疗。对照组包括肺部良性病变组30例：男性18例，女性12例，年龄23-74岁；其中肺炎19例，肺结核球4例，炎性假瘤7例。正常健康对照组30例：男性15例，女性15例，年龄21-69岁，均无心、肝、肺等器质性疾病史。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 在Gene Bank查找Survivin mRNA、β-actin mRN（内参）基因序列，引物由大连宝生物公司合成。

1.2.2 标本采集及Total RNA的提取 用枸橼酸钠抗凝经去酶处理的采血管，取患者晨空腹肘静脉血2.0ml。

淋巴细胞分层液分离核细胞，RNAiso Plus细胞裂解液裂解，氯仿，异丙醇进一步抽提总RNA。总RNA用紫外分光光度计定量，并行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，加入适量RNase-free灭菌水分装-80℃保存备用。

1.2.3 RT-PCR 逆转录反应条件42℃30min、95℃5min、5℃5min。在PCR反应仪中进行。反应产物-20℃保存备用。PCR扩增反应条件94℃5min，变性94℃30s，72℃延伸1min，共进行30个循环，最后72℃延伸5min.，Survivin mRNA复性62℃30s，β-actin mRNA56℃30s

1.3 统计学处理 应用SPSSV17.0统计软件包处理，用X2检验分析计数资料之间的比较，以P

2 结 果

2.1 总RNA鉴定 实验中所抽提取的总RNA，其检测的OD260/OD280值为1.8-2.2之间。用1.0%琼脂糖凝胶电泳及EB染色分析可见28s、18s、5s三条带，表明完整性良好。

2.2 RT-PCR扩增图 用大连宝生物公司的DNA MarkerD（100bp-2000bp）作为相对分子量的质量标准，电泳结果可显示5条带（100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp）。指标Survivin mRNA的扩增产物为439bp；以β-actin mRNA268bp作为内参照，其在本实验所有标本中均稳定表达。阳性表达电泳图表现为439bp出现亮带。1%琼脂糖凝胶电泳，见图1。

2.3 3组外周血Survivin mRNA 的表达情况比较 在55例非小细胞肺癌组中Survivin mRNA表达率为61.82%；肺良性病变组表达率6.7%；健康对照组无阳性表达。非小细胞肺癌组较肺良性病变组及健康对照组差异有统计学意义（P=0.00）。Survivin mRNA在不同TNM分期、不同差异具有统计学意义（P=0.004）。不同病理类型组、不同年龄组、不同性别组的非小细胞肺癌患者，Survivin mRNA差异无统计学意义（P=0.446 、P=0.701和P=0.446），见表1。

3 讨 论

多数非小细胞肺癌患者在确诊时已有远处转移。早发现、早诊断、早治疗是提高非小细胞肺癌患者生存率和治愈率的关键。相对于传统方法，外周血肿瘤标志物检测是一个合理、安全、花费较小的选择。非小细胞肺癌患者血循环中微转移阳性的，生存期明显缩短，预后差[2]。因此选择适宜的方法，并在外周血中找到有助于非小细胞肺癌早发现、早诊断的肿瘤标志物具有重要的临床意义。RT-PCR是具有高度敏感性及异性的检测外周血肿瘤细胞的方法，目前得到了广泛应用，其检测的是基因在mRNA水平表达的情况，能在106-107个正常的细胞中检出1个肿瘤细胞，优于传统检测技术，适于用来检测外周血循环中存在的微量肿瘤细胞。Survivin是一种凋亡抑制蛋白，是目前发现的最具特异性的凋亡抑制因子之一。其特异性高表达于肿瘤组织，正常分化的组织则不表达。该特性决定了其可能为理想的肿瘤标记物，并成为肿瘤鉴别诊断以及判断预后等研究的新热点。Yie等研究发现，Survivin表达阳性者具有较高的复发率，生存期较短；通过多因素分析，Survivin是癌症复发的独立预测因子。Chen P的研究发现Survivin和临床分期是对无进展生存期和总生存期的独立预测因子。本实验发现外周血survivin mRNA的检测有助于早期血道微转移的发现，且随着TNM分期的增高，Survivin mRNA阳性表达率也显著增加，其在外周血中的表达可能是肺癌恶化发生复发转移所伴随的分子生物学变化，进一步提示其与患者预后息息相关。本研究认为采集外周血的方法，简便、安全易于临床应用。

参考文献

[1] Manegold C.Thatcher N.Survival improvement in thoracic cancerl progress from the last decade and beyond[J].Lung Cancer，2007，57 SuppI 2：S3-S5.

[2] Yamashita JI，Kurusu Y，Fujino N，et al.Detection of circulating tumor cells in patients with non-small cell lung cancer undergoing lobectomy by video-assisted thoracic surgery：a potential hazard for intraoperative hematogenous tumor cell dissemination[J].Thorac Cardiovasc Surg，2000，119（5）：899-905.