药物血清内黄芪甲苷含量测定及其抑制HSCs活化增殖的实验研究

摘 要：目的：探讨黄芪经正常、肝纤维化机体代谢后血清内黄芪甲苷含量差别，及其对肝纤维化发生中HSCs活化增殖的影响。方法：40%CCl4, 皮下注射9周制备大鼠肝纤维化模型。正常、肝纤维化大鼠分别灌服黄芪，提取正常、肝纤维大鼠药物血清，HPLC检测药物血清内黄芪甲苷含量。CCK-8法检测黄芪甲苷对HSCs增殖影响，3-Pro掺入－胶原酶消化法检测黄芪甲苷对HSCs胶原分泌的影响。结果：正常、病理药物血清内均可检出黄芪甲苷。病理药物血清内黄芪甲苷含量高于正常药物血清(0.1140 vs0.0851,P

关键词：黄芪甲苷；血清药理学；高效液相色谱法；肝纤维化；肝星状细胞

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2770-04

Content Assaying of Astragaloside IV and Its Effects on Proliferation and Activation of

HSCs in Liver Fibrosis

LU Tao1, YAO Xixian2, SUN Zeming2

(1. Dapartment of Gastroenterology, First People's Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310006, Zhejiang, China;

2. Hebei Institute of Gastroenterology, Shijiazhuang 050000, Hebei, China)

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收稿日期：2011-07-10

作者简介：吕涛（1976-），女，河北石家庄人，医师，博士，研究方向：中药防治肝纤维化作用机制及成分研究。Abstract:Objective: To detect the contents of astragaloside Ⅳ in raw astragalus mongholicus, and the corresponding drug sera (normal and fibrotic drug sera) by HPLC. To compare the astragaloside Ⅳ in astragalus mongholicus. To study the effects of astragaloside Ⅳon proliferation and activation of HSCs in hepatic fibrogenesis. Methods: Inducing liver fibrosis in rats by 40% CCl4, SC, for 9 weeks. Astragalus mongholicus. solutions were given to the normal and fibrotic rats, respectively for 5days. Normal and fibrotic drug sera from rats were extracted. The separation of astragaloside Ⅳwas performed by HPLC. The effects of astragaloside Ⅳ on the proliferation of HSCs were measured by the method of CCK-8 (Cell Counting Kit-8). The effects on synthesis of collagen I were assessed by 3H-proline incorporation assays. Results: Astragaloside Ⅳ could be found both in normal and fibrotic drug sera. The contents of astragaloside Ⅳ in fibrotic drug sera were higher than normal drug sera (0.1140 vs 0.0851,P

Key words:Astragaloside Ⅳ; Seropharmacological method; High performance liquid chromatography (HPLC); Liver fibrosis; Hepatic stellate cells (HSCs)

黄芪是中医补益补气一味重要用药，能够提高机体免疫功能，抑制脂质过氧化，稳定肝细胞膜。以黄芪为主的组方，对于慢性肝病的防治作用已在动物实验、细胞培养及临床应用中得到证实\[1\]。黄芪主要含皂苷类、多糖类和多种黄酮类成分。其中，黄芪皂苷Ⅳ又称黄芪甲苷，为黄芪内主要有效成分\[2\]。血清药理学方法采用健康及病理造模动物为药物受体，灌服中药后取其药物血清体外干预细胞，可准确反应中药经机体代谢后所产生有效成分的体内作用\[3\]。

肝纤维化是肝硬化的必经阶段\[4\]。肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）的活化增殖是肝纤维化的启动因素和细胞学基础\[5\]。本文采用HPLC检测黄芪经正常、肝纤维化机体代谢后黄芪甲苷含量差别，同时探讨黄芪甲苷对HSCs活化增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物造模 健康雄性SD大鼠20只，清洁级，购自河北医科大学实验动物中心，分为两组。A组（正常对照）：正常健康SD大鼠10只；B组（肝纤维化组）：SD大鼠10只，进行9周肝纤维化造模：大鼠皮下注射40％CCl4油溶液，首次注射剂量为每千克体重4mL；首次注射后，注射剂量改为每千克体重2mL。每周注射2次，持续注射9周。

1.1.2 细胞培养 肝星状细胞株CFSC由美国Greenwel教授建株并惠赠，其表型为活化的HSCs，从CCl4诱发的肝硬化大鼠中分离并在体外培养中使细胞自发获得永生性。

1.1.3 仪器 高效液相色谱仪（美国Waters公司），810型控制器，486型紫外检测器，色谱工作站（大连依利特）。微孔滤膜（美国 Millipore Corporation，孔径0.45μm）。Sep-Park C18净化柱（美国Waters Millipore）。AUTOSCIENCE超声发生器。Ultrafree-MC Filters (Millipore，10,000 NMWL Filter Unit)。中药自动煎药机（韩国东华）。

1.1.4 试药 黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）；黄芪产地山西，由河北省乐仁堂医药有限公司提供，经河北医科大学姚希贤教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪的干燥根。

1.2 供试品溶液制备

1.2.1 黄芪灌服煎液 黄芪生药浸30min后，采用自动煎药机煎制黄芪灌服液，并将其浓缩至所需浓度（含黄芪生药0.05 g·mL-1）。

1.2.2 黄芪药物血清HPLC供试品 SD大鼠正常对照组（A组），备提取正常药物血清用；肝纤维化组（B组），进行肝纤维化造模，9周后B组可见肝组织明显的坏死，炎细胞浸润，脂肪变性。A组大鼠无明显变化见图1。9周后黄芪煎液同时灌服正常、肝纤维化大鼠（灌服量为大鼠体重每千克6.25g生药，为成人千克体重用量约15倍）。连续灌服5天。于第5天灌服后2h，大鼠下腔静脉取血5mL，离心分离药物血清。药物血清加入等体积乙腈，离心2次去蛋白。取第2次离心上清，微孔滤膜过滤，Sep-Park C18小柱净化，超滤试管过滤，取续滤液作为黄芪药物血清HPLC供试品溶液，4℃避光保存。

1.2.3 黄芪生药HPLC供试品制备 精密称取黄芪粉末5.0g，放入100mL容量瓶中，加甲醇定容至100mL，充分混匀，4℃避光12h过夜。次晨溶液经微孔滤膜过滤，Sep-Park C18小柱净化，超滤试管再次过滤后，取续滤液上清为黄芪生药HPLC供试品溶液（含黄芪生药0.05g.mL-1），4℃避光保存。

1.3 色谱条件

色谱柱：Nucleasil 100-5 C18色谱柱(250mm×46mm, 5μm)；流速：0.8mL·min-1；检测波长：200nm；柱温：25℃；流动相∶ 乙腈-水(1∶ 2)；AUFS：0.1\[6\]。

1.4 HPLC方法与结果

1.4.1 线性关系考察 配制浓度为0.5mg·mL-1的黄芪甲苷标准品溶液，按不同梯度体积进样(2、5、8、10、12、15、18、20 μL,每个进样体积重复3次)，在上述黄芪甲苷检测色谱条件下进行测定。依黄芪甲苷进样量X(μg)和相应峰面积Y(mv.min)绘制标准曲线(n=13)。

1.4.2 精密度试验 黄芪甲苷对照品溶液重复进样6次，计算黄芪甲苷峰面积间RSD (n=6)，评价黄芪甲苷色谱条件精密度。

1.4.3 稳定性试验 黄芪甲苷标准品溶液避光保存条件下，每日进样6次计算每日黄芪甲苷峰面积RSD (n=6)，评价黄芪甲苷标准品溶液稳定性。

1.4.4 加样回收率试验 将黄芪甲苷标准品分别加入黄芪生药及黄芪药物血清，上述色谱条件下检测黄芪甲苷加样回收率(n=6)。

1.4.5 重复性试验 上述色谱条件下分别检测黄芪生药提取物、黄芪药物血清中黄芪甲苷含量(n=6)，计算6次重复实验结果间RSD，评价检测结果重复性。

1.4.6 样品含量测定 在本文仪器及色谱条件下，外标法测定黄芪生药、正常、病理药物血清内黄芪甲苷含量测定结果(n=6)。

1.5 CCK-8法检测黄芪甲苷对HSCs增殖影响

采用2% 1640培养液将黄芪甲苷溶解并配制为2μg.mL-1溶液,过滤除菌，-20℃保存备用。

CCK-8检测法检测黄芪甲苷对HSCs增殖的影响：96孔板内培养HSCs同步化于G0期后，换用黄芪甲苷细胞培养液50μL＋2% 1640培养液50μL，37℃、5% CO2培养箱共同培养细胞；同时设对照组，单纯2% 1640培养液100μL培养。各干预组均设6个复孔，干预24h后，每孔加入CCK-8试剂10μL，细胞培养箱内继续培养3h。酶标仪450nm波长处检测各孔吸光度(A)值\[7\]。

1.6 3H-Pro掺入－胶原酶消化法检测黄芪甲苷对HSCs I型胶原分泌影响

24孔板内培养HSCs同步化于G0期后，换用黄芪甲苷细胞干预液250μL＋20ng·mL-1 TGF-β1溶液250μL，37℃、5% CO2培养箱共同培养细胞；同时设对照组。各组均设6个复孔，培养6 h后，每孔加入3H-Pro 1.5μL，继续培养18h，收集培养上清，等分后分别置于2mL Eppendorf管中。其中一份加入Ⅰ型胶原酶100μL (30IU·mL-1)（胶原酶管），另一份不处理（空白管）。再置于培养箱内37℃孵育4h。每个EP管内加入10% TCA 100μL，离心去除上清中的游离同位素。向离心沉淀中加入1.8mL闪烁液，常温放置12h过夜，于液体闪烁计数仪上测定样品Dpm值。每孔500μL培养上清Ⅰ型胶原分泌量=(Dpm空白管- Dpm胶原酶管)×2.5\[8\]。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。A值及Dpm值以均数±标准差 (±s) 表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用q检验。P＜0.05认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠造模病理结果

见图1～2。

图1 N组大鼠正常肝组织肝小叶结构清晰可见 (HE染色,100×)图2 A组大鼠肝纤维化肝组织肝小叶结构消失，可见明显炎症、坏死及气球样变改变 (HE染色, 100×)2.2 不同状态机体代谢对黄芪甲苷含量影响

2.2.1 黄芪甲苷标准品线性关系曲线 黄芪甲苷含量在1～16.6μg范围内呈现良好线性关系。黄芪甲苷保留时间在20.37～22.30min之间。峰面积Y(min.mv)与黄芪甲苷进样量(μg)间回归方程为：Y=0.075×104X-456.76,r=0.9991 (n=13)。

2.2.2 精密度试验 黄芪甲苷对照品溶液重复进样6次，黄芪甲苷峰面积间RSD=1.65%(n=6)，表明黄芪甲苷色谱条件精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 黄芪甲苷标准品溶液避光保存条件下，前7天峰面积基本不变，黄芪甲苷峰面积RSD=3.27%(n=6)。表明黄芪甲苷标准品溶液在7天内可保持稳定。

2.2.4 加样回收率试验 黄芪生药回收率为(108.41±131)%，RSD=1.21%(n=6)。黄芪药物血清回收率为：正常药物血清(102.33±2.50)%，RSD=2.44%；病理药物血清(103.66±3.92)%，RSD=3.78%(n=6)。黄芪甲苷加样回收率良好。

2.2.5 样品测定结果及重复性实验 黄芪生药、正常、病理药物血清内黄芪甲苷含量测定结果(n=6)：黄芪生药提取物中黄芪甲苷含量(n=6)为0.3144μg·μL-1，6次重复实验结果间RSD为2.06%。黄芪药物血清中黄芪甲苷含量(n=6)：正常药物血清0.0851μg·μL-1，RSD=2.11%。病理药物血清0.1140μg·μL-1，RSD=2.61%。测定结果重复性良好。见图3。

A：黄芪甲苷标准曲线（2号峰：黄芪甲苷）；B：黄芪生药提取物（2号峰：黄芪甲苷）；C：黄芪甲苷药物血清（3号峰：黄芪甲苷）

图3HPLC检测黄芪甲苷色谱图2.3 黄芪甲苷对HSCs活化增殖影响

2.3.1 黄芪甲苷对HSCs增殖影响 与对照组相比，黄芪甲苷可明显抑制HSCs增殖(P

2.3.2 黄芪甲苷对HSCs I型胶原分泌影响 与对照组相比，黄芪甲苷虽可抑制HSCsⅠ型胶原分泌，但与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。见表2。

目前我国乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)携带者超过1亿，占我国人口的十分之一。全球丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)携带者也近2亿人。部分乙型、丙型肝炎患者会发展至慢性肝病。加之其它病因导致的慢性肝病，如慢性酒精性肝病、中毒性肝病等，慢性肝病患者数量巨大。同时，在我国肝癌患者中，95%可找到乙肝证据。慢性肝炎、肝硬化、肝癌成为恶性发展链。减缓或阻止肝纤维化进程成为重要的抗肝硬化、肝癌治疗对策\[9\]。肝纤维化是肝脏内细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)弥漫性过度沉积性疾病，但无假小叶的形成。HSCs增殖、胶原合成增加是肝纤维化形成的重要环节之一\[10 \]。HSCs活化增殖，与肝纤维化的关系极为密切\[11\]。抑制HSCs的活化增殖及胶原合成，对于肝纤维化防治具有重要意义。

中医药治疗肝纤维化近年来成为研究重点。精简组方、对单味药进行深入研究是中药研究方向。中医认为慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化属于血瘀气结、脾虚范畴\[12\]。黄芪是中药补益补气的重要用药。目前研究表明，黄芪在防止肝糖原减少、抑制肝细胞脂质过氧化、拮抗肝脏内毒素、保护肝脏线粒体损伤、防止肝纤维化等方面均发挥重要作用\[13\]。

本研究表明，黄芪甲苷可抑制HSCs增殖，可能为黄芪抗肝纤维化的有效作用成分之一。但黄芪甲苷对HSCs的 I型胶原分泌并无显著抑制作用，表明其抑制肝纤维化作用的主要途径可能是抑制、减少活化的HSCs数量，而HSCs一旦活化为功能亢进细胞，黄芪甲苷可能不能进一步抑制胶原的合成分泌。故而作者考虑，黄芪抗肝纤维化作用可能通过减少HSCs数量或促进肝脏中胶原降解实现，而非直接抑制胶原合成。其更明确的作用机制仍需针对肝纤维化发生中多种因素进行研究。

本研究结果提示，黄芪正常、病理药物血清内黄芪甲苷含量存在差异，表明不同机体状态（健康、肝纤维化）对于不同药物的代谢过程及产物影响不同，符合中医辨证施治原则。部分中药经正常、病理不同机体代谢后代谢产物可能有所不同。故在选择中药研究方法时，应当从药物预期应用的人群进行考虑，若是用于养生的预防保健性药物，其前期研究更应注重在正常机体内的作用效果及不良反应。若明确用于某种疾病治疗的药物，对其机制与疗效的研究宜选择在同种病理模型动物体内进行更为妥当。

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