大黄素对HL-60细胞增殖和凋亡的影响

摘 要：目的：探讨大黄素对人白血病细胞HL-60增殖及凋亡的影响。方法：应用MTT法检测大黄素对HL-60细胞增殖的影响；应用流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡；蛋白印迹法(Western-Blot)检测Bcl-2蛋白表达水平的变化。结果：在5～20mg/L浓度范围内，大黄素对HL-60细胞增殖的抑制作用呈时间剂量依赖性20mg/L作用72h后，抑制率分别达到（19.8±2.7）%，（58.8±4.4）%和（73.8±5.7）%；流式细胞术检测发现：大黄素5、10和20mg/L作用24h后，细胞凋亡率分别为（15.5±3.4）%、（56.0±3.4）%和（71.1±5.0）%，与对照组（1.01±0.06）%有显著性差异（P

关键词：大黄素；HL-60细胞；细胞增殖；细胞凋亡；bcl-2

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2764-03

Effect of Emodin on Inducing HL-60 Cells of

Proliferation Inhibition and Apoptosis

WANG Xiao,QIAN Xudai, CHEN Xiaohong, YIN Liming, LIN Xiaojie, GAO Ruilan

(Institute of Hematology, the First Affiliated Hospital of Zhejiang University of TCM, Hangzhou 310006, Zhejiang, China)

Abstract:Objective：To investigate the effect of emodin on inducing HL-60 leukemia cells of proliferation inhibition and apoptosis. Methods： HL-60 cells were exposed to emodin at different dosages. Growth inhibition was detected by MTT assay, and cell apoptosis was detected by flow cytometry and DNA agarose gel electrophoresis. The expression of bcl-2 was detected by Western-blot. Results： The results showed that when HL-60 cells were treated with 5-20mg/L of emodin, the proliferation of HL-60 cells was obviously inhibited in dose-dependent and time dependent manner. The proliferation rate of HL-60 cells treated with emodin for 72 hour were （19.8±2.7）%，（58.8±4.4）% and （73.8±5.7）%. 24 hours after exposure to 5,10,20mg/L emodin, the apoptotic rates of HL-60 were respectively （15.5±34）%、（56.0±3.4）% and （71.1±5.0）%,and were statistically significant when compared with the control group （1.01±0.06）%（P

Key words:Emodin; HL-60 cell; cell proliferation; cell apoptosis

细胞凋亡在维持机体处于稳定状态中起着重要作用，细胞凋亡异常与人体多种恶性肿瘤的发生发展过程密切相关。白血病是严重危害人类健康的恶性血液病，化疗虽然是目前主要的治疗手段，但其副作用及耐药性已成为临床上治疗白血病的极大障碍。大黄素(emodin)属单蒽核类，1,8-2二羟基蒽醌衍生物，与阿霉素、柔红霉素等抗癌药同属蒽醌类化合物，是大黄、虎杖、何首乌、望江南、砂仁及百合等多种中药的有效成分之一。大黄素药理作用广泛，具有免疫调节、抗菌、抗炎、抗肿瘤等方面的作用\[1-2\]。

近年来，大黄素抗肿瘤的作用已经引起的研究者的极大关注\[3\]。目前对其抗癌作用的研究主要集中在实体瘤方面，对于非实体瘤作用的研究报道较少。本实验以HL-60白血病细胞作为靶细胞，研究大黄素对其抑制增殖和诱导凋亡的作用以及对Bcl-2蛋白表达水平的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料 大黄素为Sigma公司产品，纯度>99%，用二甲基亚砜(DMSO), Sigma公司溶解, - 20℃； IMDM培养液购自Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DSMO）均购自Sigma公司；Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit购自Biovision公司；bcl-2抗体购自Santa Cruz公司。HL-60白血病细胞系为本研究所保存。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人白血病细胞HL-60细胞悬浮含10%新生牛血清的IMDM培养液中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养，每2～3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT法测定细胞增殖抑制率 取对数生长期的HL-60细胞，以1×105/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔0.2mL，实验组：加5、10、20mg/L大黄素；对照组：加等体积的培养液；空白组：只加培养液，无细胞。每组设3个复孔。置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养，分别培养24、48、72h，于终止培养前4h加入MTT溶液（5mg/ml）10μL，培养4h，离心，弃上清，加入150μL的DSMO，震荡5min，使结晶完全溶解。酶标仪于490nm处测量吸光值(OD)，取各组均值，重复实验3次。计算大黄素对HL-60细胞增殖抑制率。抑制率=\[（OD对照组-OD实验组）/ OD对照组\]×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 收集不同浓度大黄素（5、10、20mg/L）作用24h的HL-60细胞和对照组HL-60细胞，用预冷的PBS洗涤2次，重悬于结合缓冲夜（binding buffer）中，加Annexin V-FITC和PI，室温避光孵育15min，流式细胞仪检测。

1.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳分析 收集不同浓度大黄素（5、10、20mg/L）作用24h的HL-60细胞和对照组HL-60细胞，PBS洗涤，提取DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳，80V，2h，紫外灯下检测并摄像。

1.2.5 Western blot检测Bcl-2蛋白 收集不同浓度大黄素作用 24h及对照组细胞 , PBS洗涤后，入裂解缓冲液 , 4℃孵育30min，12000r/min离心5min，取上清，测定蛋白含量。取20μg蛋白样品，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，1.2%BSA封闭后，加入一抗，室温1.5h，TBST洗膜3次，再加入二抗，室温孵育1h，TBST洗膜3次。ECL发光检测，X光片显影。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS 10.0统计学软件进行方差分析，数据以均数±s标准差表示。

2 结 果

2.1 大黄素对HL-60细胞增殖的影响

大黄素作用24h后，HL-60细胞生长开始出现不同程度的抑制，20mg/L时抑制率为(19.8±2.7)%，与对照组相比有显著性差异（P

图1 不同浓度大黄素对HL-60增殖抑制作用

2.2 流式细胞仪检测结果

经FCM检测发现，经不同浓度大黄素处理的HL-60细胞出现了不同程度的凋亡。而且随着浓度的增加，凋亡程度也越来越明显。当大黄素浓度为5、10和20mg/L时，细胞凋亡率分别为(15.5±3.4)%、(56.0±3.4)%和(71.1±50)%，与对照组（1.01±0.06）%有显著性差异（P

A 对照组；B 大黄素5mg/L组；C 大黄素10mg/L组；D 大黄素20mg/L组

图2 大黄素作用HL-60细胞24h后FCM分析凋亡结果

2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳结果

DNA琼脂糖凝胶电泳显示，大黄素20mg/L处理HL-60细胞胞24h后，DNA裂解为180-200bp及其整倍数的片段，琼脂糖凝胶电泳获得清晰的凋亡特征性梯形条带；对照组细胞DNA完整，无DNA梯形条带。见图3。

1.DNA Marker； 2.对照组；3.大黄素5mg/L组；4大黄素10mg/L组；5大黄素20mg/L组

图3 大黄素诱导HL-60细胞凋亡电泳图2.4 Western blot检测Bcl-2蛋白变化

大黄素作用24h后，Bcl-2蛋白的表达水平呈下降趋势。见图4。

1.对照组；2.素5mg/L组；3.大黄素10mg/L组；4.大黄素20mg/L组

图4 大黄素对HL-60细胞Bcl-2蛋白水平的影响3 讨 论

细胞凋亡是在基因控制下的细胞主动性死亡过程，是区别于细胞坏死的另一种细胞死亡方式，其形态学及生物化学改变具有自身特点。大量研究表明，肿瘤的发生不仅与细胞增殖异常有关，而且与细胞凋亡异常有着密切关系。目前临床上已经把抑制白血病细胞增殖、诱导其凋亡作为治疗白血病的重要手段。

Bcl-2是1984年Tsujimoto等\[4\]从滤泡型淋巴细胞瘤中分离出的一种癌基因,是细胞凋亡的抑制基因，它的激活和过度表达能抑制细胞正常的凋亡，从而导致恶性肿瘤的发生和发展\[5\]。Bcl-2蛋白的表达与恶性肿瘤的发生、发展密切相关\[6\]。一些研究发现Bcl-2基因家族蛋白表达水平的变化 ,能显著改变肿瘤细胞株对化疗药物诱导凋亡的敏感性。所以，Bcl-2可以通过抑制肿瘤细胞的凋亡途径而导致耐药\[7\]。由于Bcl-2在调控细胞凋亡和诱导耐药发生等方面具有重要的作用，因此已经成为肿瘤治疗的靶点之一。

大黄素是从大黄及其它中药中提取出来的蒽醌类化合物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎等。特别是其抗肿瘤作用已引起人们的极大关注，如抗肝癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌等［8-11］。

本研究通过MTT法观察不同浓度大黄素对HL-60细胞生长的影响，结果表明大黄素能够明显的抑制HL-60细胞增生长，并随着药物浓度和时间的逐渐增加，抑制作用也明显增强，呈时间-剂量依赖性。当浓度20mg/L时作用72h后，抑制率分别达到（19.8±2.7）%，（58.8±124）%和（73.8±5.7）%。流式细胞术检测结果显示，经不同浓度大黄素处理的HL-60细胞出现了不同程度的凋亡，最终抑制HL-60细胞的增殖。琼脂糖凝胶电泳显示，大黄素能诱导细胞出现典型的 DNA梯状带。这说明大黄素对HL-60细胞有一定的抑制增殖作用和诱导凋亡。进一步的实验结果显示，大黄素能够使HL-60细胞中的Bcl-2蛋白表达水平降低。我们实验结果说明大黄素能够抑制HL-60细胞增殖和诱导其凋亡，可能通过抑制Bcl-2蛋白表达来诱导HL-60细胞的凋亡。

参考文献

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