高效液相色谱法测定栀子根中齐墩果酸3―乙酸酯含量

摘要：目的 建立高效液相色谱法测定栀子根中齐墩果酸3-乙酸酯含量的方法。方法 样品采用不同种类、不同浓度、不同时间的酸水解，将栀子根中齐墩果酸3-乙酸酯水解成齐墩果酸后，用二氯甲烷萃取、蒸干、甲醇定容，制备供试液，再采用高效液相色谱法测定其含量。结果 样品的甲醇提取液加盐酸2 mL，加热回流4 h，水解较好。齐墩果酸3-乙酸酯在1.102 5～11.025 ?g范围内线性关系良好，r=0.999 8，平均回收率为96.00%（RSD=1.34%）。结论 本方法操作简便，重复性好，专属性强，可用于栀子根的质量控制。

关键词：栀子根；齐墩果酸3-乙酸酯；含量测定；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.020

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0051-03

栀子根为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥根及根茎，主产于湖南、浙江、四川、江西、重庆、湖北等省。栀子根具有清热解毒、凉血之功效[1]。民间主要用于黄疸性肝炎、肾炎水肿、感冒高热、出血吐血等病症的治疗，在《福建民间草药》中称作为栀子花根[2]。栀子根是治疗丙型肝炎的中药新药――松栀丸方中的君药，主含齐墩果酸3-乙酸酯。因齐墩果酸3-乙酸酯无对照品，不能直接测定其含量，为控制栀子根的内在质量，本试验建立将栀子根中齐墩果酸3-乙酸酯水解为齐墩果酸后，再用高效液相色谱仪测定齐墩果酸

基金项目：国家重大科技专项（2005AA2Z3E40）；长沙市科技计划重点项目（K0803003-31）

通讯作者：李红，Tel：13973193967，E-mail：

含量的方法，为寻求栀子根最佳药材资源奠定基础，为确保松栀丸质量提供试验数据。

1 仪器与试药

LC-10AT型高效液相色谱仪（包括岛津LC-10AT vp泵， SPD-10A vp紫外检测器，LC-工作站），DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司），WGLL-125BE型电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司），TU1810型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），AB135-S型电子天平（0.01 mg，METTLER TOLEDO），KL-UP-Ⅲ-20型艾柯超纯水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司）。

齐墩果酸对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号110709-200505）；甲醇（色谱纯，湖南汇虹试剂有限公司，批号20100727），其他试剂均为分析纯，水为自制超纯水。

栀子根来自湖南醴陵，经湖南中医药大学药用植物资源教研室周日宝教授鉴定为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

固定相为WondaSilTM C18键合硅胶柱（4.6 mm×250 mm，

5 ?m），流动相为甲醇-0.4%冰乙酸（81∶19），流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为210 nm。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品12.62 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，浓度为0.504 8 mg/mL。

2.3 供试品溶液制备方法的优选

2.3.1 不同提取溶媒的比较 取本品粉末（过三号筛）约1 g 4份（每2份作为一个平行样），精密称定，分别置具塞锥形瓶中，一份精密加入乙醇50 mL，另一份精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，分别用乙醇和甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液25 mL，加盐酸2 mL，分别加热回流水解1 h，水解液加水20 mL，置80 ℃水浴挥去乙醇（甲醇），至约20 mL，用二氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，分别转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得。

精密吸取上述样品溶液20 ?L，注入高效液相色谱仪中，测定齐墩果酸峰面积，平行3次。结果，乙醇为溶媒时的平均含量为0.075 4%，甲醇为溶媒时的平均含量为0.150 6%。甲醇优于乙醇，故选用甲醇提取样品中齐墩果酸3-乙酸酯。

2.3.2 不同酸水解的比较 取本品粉末（过三号筛）约1 g 4份（每2份作为一个平行样），精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25 mL，一份滤液加盐酸2 mL，另一份加硫酸2.6 mL，分别加热回流水解1 h，水解液加水20 mL，置80 ℃水浴挥去甲醇至约20 mL，用二氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，分别转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得。

精密吸取上述样品溶液20 ?L，注入高效液相色谱仪中，测定齐墩果酸峰面积，平行3次。结果，盐酸、硫酸水解所得齐墩果酸平均含量分别为0.144 5%、0.000 1%，硫酸水解在齐墩果酸相应位置几乎没有峰，盐酸水解的含量为0.144 5%。盐酸明显优于硫酸，故选用盐酸水解样品中齐墩果酸3-乙酸酯。

2.3.3 不同提取时间的比较 取本品粉末（过三号筛）约1 g 8份（每2份作为一个平行样），精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，分别加热回流2、4、6、8 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液25 mL，加盐酸2 mL，加热回流水解1 h，水解液加水20 mL，置80 ℃水浴挥去甲醇至约20 mL，用二氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，分别转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得。

精密吸取上述样品溶液20 ?L，注入高效液相色谱仪中，测定齐墩果酸峰面积，平行3次。结果提取2、4、6、8 h的齐墩果酸平均含量分别为0.139 2%、0.181 2%、0.181 0%、0.165 7%。综合结果考虑提取时间为4 h最佳，随着时间的增加，含量没有明显升高，反而降低。

2.3.4 不同酸用量的比较 取本品粉末（过三号筛）约1 g 6份（每2份作为一个平行样），精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液25 mL，分别加盐酸1.0、2.0、3.0 mL，同上水解、萃取、定容、测定。结果齐墩果酸的平均含量分别为0.138 1%、0.138 4%、0.138 2%。酸用量对试验结果无显著影响，综合考虑，盐酸用量以2 mL为佳。

2.3.5 不同水解时间的比较 方法同“2.3.4”取本品粉末约1 g 6份（每2份作为一个平行样），分别水解2、3、4 h，再同上萃取、定容、测定。结果齐墩果酸的平均含量分别为0.153 2%、0.156 8%、0.156 6%。可见水解时间不是影响齐墩果酸含量的主要因素，水解时间延长，含量不会明显增加。故水解时间可选为2 h。

2.3.6 小结 从以上供试液制备方法的单因素考察中可以看出，提取溶媒、酸种类和提取时间是影响含量的主要因素，酸浓度和水解时间都不能明显的影响栀子根中检测到的齐墩果酸含量。为节省整个供试液的制备过程，考虑将提取和水解过程合并。制备过程如下：取本品粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入（4100）的盐酸甲醇溶液50 mL，称定重量，加热回流4 h，放冷，再称定质量，用（4100）的盐酸甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液25 mL，加水20 mL，置80 ℃水浴挥去甲醇至约20 mL，用二氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，置75 ℃水浴上蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取浓度为0.504 8 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液1.0、2.5、5.0、7.5、10 mL，分别置10 mL容量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液各20 ?L进样，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以齐墩果酸进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，并对其进行线性回归，得回归方程Y=10 262 465.24X-50 224.9， r=0.999 8，表明齐墩果酸在1.009 6～10.096 ?g （折算为齐墩果酸3-乙酸酯在1.102 5～11.025 ?g）范围内质量与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取齐墩果酸对照品溶液20 ?L，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，以齐墩果酸峰面积平均值与标准差计算RSD=1.15%，结果表明精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取样品供试液20 ?L，按上述方法于0、2、4、6、8、12、24 h测定，以齐墩果酸峰面积平均值与标准差计算RSD=0.77%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密吸取栀子根样品6份，按供试品溶液的制备方法制备样品供试液，精密吸取样品供试液20 ?L，按上述色谱条件测定，外标两点法计算含量，平均含量为0.071%，RSD=0.82%。

2.8 加样回收率试验

取已知含量（0.71 mg/g）栀子根约1.0 g，精密称定，加入浓度为0.68 mg/mL齐墩果酸溶液（相当于齐墩果酸3-乙酸酯0.743 mg/mL）1.0 mL，相当于栀子根中齐墩果酸含量（1∶1），平行共6份。按“2.3.6”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 ?L，按上述色谱条件测定，计算含量与回收率。结果见表1。

2.9 3批醴陵栀子根中齐墩果酸3-乙酸酯含量测定

取3批栀子根，按“2.3.6”项下方法制备供试品溶液，将供试品溶液和对照品溶液用0.45 ?m微孔滤膜滤过后，精密吸取20 ?L，分别注入高效液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件，分别测定齐墩果酸峰面积，色谱图见图1。按外标法计算齐墩果酸的百分含量（按干燥品计），再乘以系数1.092 027 8，结果表明，醴陵栀子根中齐墩果酸3-乙酸酯平均含量为0.106%， RSD=3.72%。见表2。

注：A.对照品；B.供试品

3 讨论

因栀子根中含有的齐墩果酸与熊果酸为同分异构体，二者极性相近，分离难度较大。笔者曾经试验过用甲醇-乙腈-0.4%冰乙酸溶液（72∶13∶15）[1]、甲醇-水-冰乙酸-三乙胺（90∶10∶0.03∶0.06）[3]、甲醇-水（90∶10）[4]、甲醇-水-冰乙酸（89∶11∶0.2）[5]、乙腈-甲醇-0.3%磷酸（60∶30∶10）[6]等流动相，结果其分离效果均不佳。而选择甲醇-0.4%冰乙酸（81∶19）为流动相时，齐墩果酸与熊果酸能够分离完全，可以满足测定要求。

笔者对萃取溶剂曾比较过二氯甲烷和三氯甲烷，发现二者的含量没有明显差异。从经济性和溶剂毒性等方面综合考虑，最后选定用二氯甲烷作为萃取溶剂。

栀子根依法提取、不水解，测定，色谱图中未见齐墩果酸峰，而加齐墩果酸对照品后的样品，在43.307 min可见齐墩果酸峰，因此，栀子根在该取样量、定容量、进样量及仪器灵敏度的条件下，未检测出齐墩果酸。齐墩果酸3-乙酸酯又称齐墩果酸醋酸酯[7] ，但称齐墩果酸醋酸酯（与C3羟基形成的酯）易与齐墩果酸乙酯（与C17羧基形成的酯）名称混淆，所以，本文叫更确切的名字――齐墩果酸3-乙酸酯。

在该色谱条件下，齐墩果酸的出峰时间大约在40 min，所有峰都检出需要大约65 min，时间过长，为节约分析时间，更优的色谱条件还有待摸索。

参考文献：

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[7] 王雪芬，陈家源，张贵岭.栀子茎和根的化学成分的研究[J].中药通报， 1986，11（10）：44-45.

（收稿日期：2012-03-19，编辑：陈静）