超高效液相色谱/四极杆—飞行时间质谱法检测22种禁用和限用合成色素

摘 要 建立有色饮料中22种禁用和限用合成色素的固相萃取超高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱快速检测方法。样品经固相萃取柱萃取，氨水-甲醇解吸，按GB/T5009-2003进行后处理，经超高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱检测，通过Q-TOF MS提供的精确质量数定性，利用TargetMS/MS提供的二级质谱碎片离子定性，对禁用合成色素进行准确定性，对常见限用合成色素进行定量，检测方法的6种常见色素加标回收率均在80%以上 。此外，对这些色素软电离裂解规律进行初步研究。

关键词 固相萃取 超高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱 合成色素 饮料

合成色素都是以苯、甲苯、萘、蒽等化工有经硝化、卤化、酰化、磺化、还原、重氮化、偶合等化学反应合成。大量食用合成色素后，对人身体健康会造成潜在危害。食品中允许使用的合成色素在我国食品添加剂使用卫生标准[1]中有明确规定，然而某些不法分子为节省成本/增惑，在食品中非法添加有毒工业染料，对人民健康和社会稳定造成极大危害。

目前，对于食品中禁用、限用合成色素的检测研究，以高效液相色谱及液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）为主。飞行时间质谱（Q-TOF MS）能够提供精确质量数，同时还能提供二级质谱离子及离子比例供定性和定量，利用其较强的定，结合固相萃取的快速提取，可提高对食品中非法添加有色物质的检测能力。本文以有色饮料为研究对象，采用SPE LC/MS（Q-TOF）方法对22种常见水溶性合成色素（主要包含酸性染料，碱性染料）进行分析，建立饮料中合成色素的快速定性检测方法和常见6种合成色素的定量方法。并对色素的软电离裂解规律进行初步研究。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Agilent Technologies 6530 Accurate-mass Q-TOF LC/MS。

色谱柱：CNW.Athena UHPLC C18 2.1mm×100mm 1.8μm，

ANPEL，P/N LAEO-2110μA。固相萃取柱：迪马ProElut PLS 500mg/6mL。超纯水发生机：美国Millipore，电导≥18MΩ·cm；固相萃取仪：Biotage AB Rapidtrace SPE。

标样：柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、靛蓝、新红、赤藓红、偶氮玉红，国家标准物质中心。酸性橙Ⅱ、酸性嫩黄G、酸性大红G、酸性大红GR、偶氮玉红、酸性黑10B、专利蓝V、碱性嫩黄O、碱性品红、碱性品绿、碱性橙Ⅱ、碱性桃红T、碱性玫瑰精，工业品，青岛川林染料工业有限公司等。

氨水、甲酸，LC-MS。

1.2 标样配制

柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝6种常见色素分别配成5μg/L，2μg/L，1μg/L，0.5μg/L，供定量做标准曲线，其它均配成2μg/L供定性测定用。

1.3 样品制备

1.3.1 活化 用5mL甲醇活化，5mL水平衡，弃去滤液（去除吸附剂中的干扰物，创造合适的上样环境）。

1.3.2 上样 将待净化样品约1mL加入小柱，弃去滤液（保留目标物及部分干扰物，其余干扰物随样品溶液流出小柱）。

1.3.3 淋洗 加5mL 2%甲酸水溶液，弃去滤液，将小柱抽干（洗去部分干扰物，又不洗脱目标物）。

1.3.4 洗脱 加4mL 2%氨水/甲醇溶液洗脱，收集流出液，用2%氨水/甲醇溶液调至中性（完全洗脱目标物）。

1.3.5 重新溶解 用旋转蒸发仪于40℃减压蒸馏近干，用50%甲醇水溶液溶解并定容至1 mL（浓缩及溶剂转换）。

1.4 液相色谱分离条件

流动相：A：0.02mol/L乙酸铵溶液（LC-MS），用超纯水配制，B：甲醇（LC-MS）。流速：0.4mL/min；分离时间见表1。

1.5 质谱条件

经优化的质谱条件如下：Gas Temp：300℃， Drying Gas：8L/min， Nebulizer：45 psig， SheathGas Temp：350℃， SheathGasFlow：11L/min， Vap：4000V， Capillary：0.059μA， Frag：175V， Skimmer：65V， OCT .IRFVpp：750 V， Esi Vcap 4000V， Capillary ：0.447μA， Chamber ：16.37μA， Nozzbe Voltage：1000V。

1.6 6种常见限用合成色素离子提取

6种常见限用合成色素保留时间从前至后依次为：柠檬黄，苋菜红，胭脂红，日落黄，诱惑红，亮蓝（见图1）。从积分面积可看出，从前至后基本呈现从小到大的状况，在梯度洗脱条件下，溶剂的基质效应比较明显。

1.7 6种常见限用合成色素线性回归方程、相关系数、检测限、加标回收率（见表2）。由表可见，6种常见禁限用合成色素在标样浓度范围内线性相关良好，检出限随着面积响应值的增大而降低，加标回收率能够满足定量测定需要。

2 结果与讨论

2.1 22种合成色素的基本信息（见表3）

2.2 22种合成色素的离子模式、目标母离子、丢失特点、子离子、碰撞能量信息（见表4）

2.3 谱图解析

柠檬黄和酸性嫩黄G同属吡唑啉酮类合成色素，柠檬黄在环上有羧基，较小的碰撞能量（10V）就能脱羧释出CO2；接着同时发生吡唑啉酮环的开裂（C-C，N-C键）和N-C键环合[2]，生成大量子离子；酸性嫩黄G则无羧基而相对稳定，在稍高碰撞能量（15V）少量解离出SO3，与柠檬黄相似，同时发生吡唑啉酮环的开裂环合；有同样需中等及以上碰撞能量解离出SO3的合成色素还有：苋菜红、日落黄、诱惑红、亮蓝、靛蓝、新红、偶氮玉红、专利蓝V、酸性黑10B。

胭脂红与苋菜红为1对同分异构体，为双萘类色素。胭脂红不像苋菜红那样能够解离出SO3，它结构不稳，在较小的碰撞能量（15V）下，就能够开环解离出HSO3CHCH2。这是由于其2个磺酸取代基位于萘环同侧，使萘环上的电子云偏向，从而使萘环更易断裂开环，结构的不均衡同时也容易在偶氮双键两侧同时发生断裂脱去N2，剩余部分接合形成子离子；苋菜红结构非常均衡稳定，在较高的碰撞能量（30V）下，除解离出少量SO3外，能够使偶氮键发生断裂，形成相应子离子。

与胭脂红双磺酸基位于萘环一侧相同的情形也出现在色素酸性大红GR上，但酸性大红GR为双偶氮苯-萘色素，偶氮双键更多与苯环共轭，靠近萘环的偶氮侧链仅需10V就会较多断裂。同为双偶氮苯-萘色素的酸性黑10B，由于萘环位于中间，电子云向中间集中，由于其中1个苯环带有亚硝酸取代基，造成苯环电子云向亚硝基偏移，从而使靠近亚硝基取代苯侧的偶氮侧链暴露而更易断裂，在中等碰撞能量下（25V），亚硝基取代的苯环同时开裂形成少量子离子，同时也有少量偶氮侧链在靠近萘环侧断裂脱去N2。偶氮玉红也为双萘类合成色素，但其萘环上均只有1个磺酸取代基，只是位置有差异，结构相对稳定，在中等碰撞能量下脱去1，2个磺酸基，释放SO3，从子离子丰度看，偶氮间位磺酸基较易丢失，在此基础上，偶氮侧链在纯萘环处更易断裂，形成相应子离子。

新红和酸性大红G同为苯-萘型色素，二者结构类似。新红在苯环上多1个磺酸钠取代基，电子云分布更均衡，需较高碰撞能量（30V）才会使靠近萘环的偶氮侧链大量断裂，而酸性大红G，由于苯上无磺酸等取代基，电子云均衡性稍差，需中等碰撞能量就可达到同样效果。

日落黄和诱惑红同为苯萘型色素，二者结构相近。在解离出SO3的同时，均在靠近萘环的偶氮侧链处断裂，同时脱H2O形成子离子，诱惑红由于苯环多1个甲基和甲氧基，正电性基团的存在使其在负离子模式和相同碰撞能量下母离子的解离稍少。

赤藓红与碱性玫瑰精（罗丹明B）同属氧杂蒽类合成色素，结构比较稳定。在高碰撞能量（40V）下，赤藓红脱去苯环上的羧基及碘化氢生成子离子，碱性玫瑰精则更稳定，需要更高的碰撞能量（42V）才能解离出1，2个HNCH2CH3离子，而非羧基的CO2，这可从解离离子的精确质量上进行分辨。

亮蓝、专利蓝V、碱性品红、碱性品绿（孔雀石绿）同属三芳甲烷类合成色素，结构比较稳定。碱性品红需高碰撞能量（40V）可脱出NH2及NH2CH3，同时发生甲烷键断裂形成子离子，专利蓝V，需中等稍小能量（20V）使苯环断裂，这也是由于2个磺酸取代基位于同一苯环，电子云偏心引起不稳定，使苯环更易开裂，在此同时甲烷靠近双磺酸取代苯侧发生断裂形成子离子，而亮蓝结构稳定需极高能量（50V）才解离出少量SO3，碱性品绿也需高碰撞能量（40V）脱去CH3CH3，并同时使甲烷键开裂（在靠近N甲基取代苯侧）形成子离子。

酸性橙Ⅱ，结构简单稳定的单磺酸基取代苯-萘色素，需中等碰撞能量（25V），可导致偶氮侧链沿磺酸基取代苯侧断裂形成子离子。

碱性橙Ⅱ，结构简单的苯-苯类偶氮色素，在正离子模式下稍小碰撞能量（20V）就可脱NH3，同时发生偶氮键断裂形成子离子，但母离子总体响应值与其它碱性色素比稍低（无正电性的甲基等存在），在负离子模式下，则脱氢形成母离子，同时形成的碎片离子也不同（不发生偶氮键断裂）。

碱性嫩黄O，属于二苯甲烷类色素，M+H为母离子，在较高碰撞能量（30V）脱出CH4，同时发生甲烷键断裂大量形成子离子。

碱性桃红T，属吡嗪类色素，结构非常稳定，需用高的碰撞能量（40V），脱去CH3CH3，同时吡嗪环裂开，大量生成子离子。

酸性嫩黄G，在负离子模式下检测灵敏度很低，这是由于在其吡唑啉酮环上存在正电性的甲基。在正离子模式下，灵敏度同样偏低，整个分子接近电中性，要提高灵敏度需考虑用其它电离方式检测。

2.4 常见丢失及碎片分子（离子）的精确质量（见表5）

3.3 实际样品筛查

通过对市场上销售的20种常见饮料进行检测，除2例检出少量柠檬黄、1例检出少量亮蓝外（均在允许添加范围内，并通过二级特征子离子的确证），暂未检出其它种类合成色素。本文所研究的方法，主要针对常见易添加的22种人工合成色素的Q-TOF MS 精确质量定性及二级碎片离子定性的条件研究，并对形成这些碎片离子的质谱软电离裂解规律进行初步研究，对常见6种禁限用色素给出定量的方法学数据。

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