HPLC—ICP—MS法分析测定药用植物中的形态汞

摘 要 确定针对连翘、红花、番泻叶、西洋参、川穹、当归等药用植物中的汞形态（甲基汞、乙基汞、二价汞离子）超声提取样品前处理方法，采用phenomenex C18液相色谱柱进行分离，ICP-MS检测。样品回收率72.83%～98.25%，精密度（RSD）（n=6）均小于15%，甲基汞、乙基汞、二价汞的检出限分别为0.125mg/kg，0.250mg/kg，0.125 mg/kg。该方法具有灵敏度高、干扰小、样品前处理简单等优点，可用于药用植物中汞形态的筛查和测定。

关键词 高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱 汞形态分析

引 言

汞是一种毒性较大、熔点低、易挥发的重金属。自然界中以金属汞、无机汞和有机汞形态存在[1]。另外，汞是对人类和高等生物最具危害的元素之一， 有机汞化合物在农业中常用作杀虫剂和杀菌剂，无机汞和单质汞在生活中也普遍使用，且无机汞通过生物甲基化作用生成毒性更强的甲基汞， 从而被动植物吸收， 并通过食物链的富集作用进入人体， 其富集倍数可高达106～107[2]。鉴于不同形态汞化合物的毒性和差异，测定样品中不同形态汞含量和差异越来越重要[3]。汞的毒性取决于化学结构， 元素汞、无机汞和有机汞是汞暴露的3种形态，它们的中毒症状和暴露途径各不相同。汞中毒事件频有发生，其中日本水俣湾有机汞污染事件最为突出，该事件引起世界范围对甲基汞的关注，各国针对水生产品中甲基汞含量都有严格的限量标准[4]。随着对汞形态毒理性能研究的深入，世界各个发达国家如欧盟等国已经立法要求不仅要测定总汞含量，而且要区分不同形态汞含量，更加明确对汞的不同形态分析十分重要[5]。

无论是惯于使用植物药的中国、印度等东方国家，还是惯于使用西药的英国、美国等西方国家，都在加大对天然药物的研究和管理制度，各国药典收录的植物药也越来越多，用于质量控制的检测方法也日趋完善[6]。目前，我国检测分析汞形态的方法仍没有相应的国家标准和行业标准。本文目的在通过建立药用植物中汞形态的检测分析方法，使中药真正达到治病救人的目的和满足中药现代化和国际化的需求。

汞形态分析可以通过各种联用技术实现，如气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）等分离手段与原子吸收光谱（AAS）、原子发射光谱（AES）、原子荧光光谱（AFS）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等具有元素选择性的检测手段相结合的分析方法[7，8]。本文应用液相色谱-串联电感耦合等离子发射质谱仪，用2%盐酸+0.5%硫脲提取液超声萃取的前处理方法，通过phenomenex C18分析柱，流速1.0mL/min对不同的汞形态进行分离，应用ICP-MS进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲基汞标准溶液（GBW08675）：86.2mg/kg（以甲基汞计）；乙基汞标准溶液（GBW（E）081524）：77.3mg/kg（以乙基汞计）；二价汞离子标准溶液：1000mg/kg（GBW08617）（以Hg计）中国计量科学研究院；连翘、红花、番泻叶、西洋参、川芎和当归（购置于北京的中药材市场）；L-半光氨酸盐酸盐（生化试剂）国药集团化学试剂有限公司；乙酸铵（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯） 美国 ThermoFisher公司；盐酸（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；硫脲（分析纯）北京化学试剂有限公司；氨水（分析纯）北京化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DRC-E型电感耦合等离子体质谱仪，美国 PE公司；Series 200型高效液相色谱仪，美国 PE公司；phenomenex C18柱（250×4.6mm，5 micron），美国 phenomenex公司；3K15型离心机，德国 SiGMA公司；50 mL BD离心管，美国；1.5mL进样瓶，美国，戴安公司；HZS-H型水浴振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；0.45?m水相滤膜，美国戴安公司；BT 224S型分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：phenomenex C18柱（250×4.6 mm，5micron）；流动相：0.1 %半胱氨酸盐酸盐+5%甲醇+ 0.01mol/L乙酸铵溶液；流速：1.0mL/min；进样体积：50?L。

1.3.2 质谱条件 离子透镜电压：6V；雾化室气体流量：0.82L/min；RF功率：1100W；辅助气体流量：1.2L/min；等离子体气流量：16L/min。

1.3.3 样品前处理 每种中药材样品约500g，将其切碎后，用捣碎机将样品加工成粉末状。混匀，均分成2份作为试样，分装入洁净的盛样袋内，密封并标明标记。

称取约2.00g （精确至0.001g）的样品溶解于50mL的BD管中，加入25mL提取液，放入水浴振荡器中20℃转速为200 r/min摇1.5h后，以8000r/min离心10min，分离出上层清液，过0.45μm滤膜，取5mL滤液，加入约5mL氨水中和，电感耦合等离子体质谱仪测定。如样液在24h内未测定，应于-20℃冰箱保存。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件选择

汞化合物形态分析中，常用的是反相高效液相色谱与各种检测器的联用技术，其所用的色谱柱大都为C18分析柱，仅有Sarzanini等人利用Dionex公司的阳离子交换柱分离无机汞、甲基汞和乙基汞[9，10]。因此，本文采用phenomenex C18分析柱，对3种不同形态的汞进行分离，并且根据保留时间，确定流速为1.0 mL/min。

用HPLC进行汞形态分析时，通常在流动相中加入适当的络合剂或离子对试剂，使之与样品中各种汞形成非极性化合物而后在色谱柱上进行分离。由于L-半胱氨酸的亲水性较强，故其与汞形成的络合物在C18柱上保留较弱，可缩短检测时间，因此选择采用L-半胱氨酸作为络合剂[11]。实验发现，随着L-半胱氨酸盐酸盐浓度的增加，3种汞形态的色谱峰形也越来越尖锐，保留时间变短，尤其是乙基汞的保留时间明显缩短，灵敏度大大提高，当增加到一定浓度时，3种形态汞的峰形、保留时间和灵敏度都不再有明显变化。同时考虑到L-半胱氨酸盐酸盐浓度太大对色谱柱有损害，因此选择0.1% L-半胱氨酸盐酸盐为形态汞分析的络合剂。

经过反复改变有机溶剂的量和种类，发现使用有机溶剂乙腈或甲醇均能改变淋洗液的性质和保留时间，且都能使3种形态汞很好的分离。但是高有机负载可能会导致ICP-MS分析信号的不稳定，同时有机溶剂分解产生的碳粉可能导致ICP-MS锥口的堵塞，综合以上因素选用含碳量少的甲醇而不使用乙腈，浓度为5%[12]。

在流动相中加入适量的缓冲盐乙酸铵，会改善峰拖尾现象。随着乙酸铵浓度增加，汞形态的峰形都有变锐，且出峰时间缩短[1]，当乙酸铵含量增加到10mmol/L时，峰形和出峰时间达到最佳，且随着乙酸铵浓度的继续增加，3种汞形态的出峰时间和峰形不再有明显变化。

流动相最终选择0.1% L-半胱酰胺盐酸盐+5%甲醇+0.01mol/L乙酸铵，流速为1.0mL/min，二价汞、甲基汞、乙基汞在此条件下的分离图（见图1）。

2.2 前处理方法选择

在汞的传统提取方法上，主要有酸提取、碱式消化、蒸馏法等前处理方法。通过对这3种提取方式对比，酸提取较完全，但提取时间长，形态容易发生变化；而文献中介绍的碱提取方式效率较低；而Krishna等人提出的采用盐酸+硫脲的方式是一种较好的提取模式，该方法可以在较温和的条件下将形态汞进行提取，从而保证其形态的稳定，其提取原理为硫脲（C2N2SH4）中的S可以与Hg结合（结合的比例关系是S：Hg=1：2）并溶解于酸性条件下，因此本文选用酸+硫脲的提取方式[13]。本文通过试验确定酸加入量、硫脲加入量和提取时间3个因素对提取效率和加标回收的影响。

2.2.1 盐酸的用量 在汞形态分析中的前处理技术文献中何滨提出，针对形态汞的提取消率会随着盐酸用量的增加而增大，但是盐酸浓度太高，会增加色谱柱分析压力，并且对ICP-MS检测器造成干扰，从而影响测定结果[14]。因此本文对盐酸的用量进行优化，采用柑橘叶（GBW10028）为样品，在提取液中硫脲用量为1%不变的情况下，分别加入浓度为1%～10%盐酸，按照上述前处理方法，通过ICP-MS测定（见表1）。

从测定结果上来看，当盐酸浓度大于2%时，柑橘叶测定值在标准参考值范围内，综合离子浓度太大会对检测器的检测结果造成影响，最后确定提取液中盐酸浓度为2%。

2.2.2 硫脲的用量 Krishna等人提出的提取原理可以得知，硫脲中的S与Hg结合的比例关系为1：2，因此只要加入硫脲的量大于所含Hg的2倍即可[15]。在盐酸浓度为2%的提取液条件下，分别加入0.2%，0.5%，1%，2%的硫脲，按照上述前处理方法，对柑橘叶（GBW10028）样品进行测定，对硫脲的用量进行优化，最终确定提取液中硫脲浓度为1%（见表2）。

2.2.3 提取时间 以柑橘叶（GBW 10028）为样品，加入25mL 2%盐酸+1%硫脲的提取液，在20℃水浴震荡器中，分别提取0.5h，1h，1.5h，2h，3h，6h后测定总汞的提取量，实验结果表明，测定样品在提取1.5h时，已经能够提取完全，且柑橘叶样品在1.5h各形态回收率103.5%～113.0%，不同时间样品的提取率和各形态的回收率（见表3，4）。

2.2.4 pH的影响 形态汞在不同pH值条件下，不仅质谱检测的灵敏度有较大差异，同时也会对各种汞化合物的分离度、峰高、拖尾因子、柱效均产生不同程度影响，其中对二价汞离子影响最大[16，17]。本方法在pH条件优化过程中，选择10%氨水对样品溶液（5?g/L的甲基汞、5?g/L二价汞、10?g/L的乙基汞）的pH值进行调节，实验所得峰面积及pH值的趋势（见图2），从图2中可清晰地看出在pH=3的时候灵敏度最高，因此本方法的样品溶液需用10%氨水调节pH=3。

2.3 方法的线性范围、线性方程、相关系数及检出限

取标准工作液，按照上述色谱条件进行测定。以峰面积Y对质量浓度x进行线性回归，在一定范围内线性良好，线性方程、相关系数及检出限（S/N=3）（见表5）。

2.4 样品分析和加标回收实验

在选择样品种类时，考虑目前常见药用植物类，以连翘代表果实类、红花代表花类、番泻叶代表叶类、西洋参代表根类、川芎和当归代表茎类为样品，分别添加相当于样品中含二价汞为：0.125mg/kg，0.250mg/kg，0.500mg/kg；

甲基汞为：0.125mg/kg，0.250mg/kg，0.500mg/kg；乙基汞为：0.250mg/kg，0.500mg/kg，1.000mg/kg。按实验步骤进行测定，按相同方法，每个浓度的样品进行6次平行实验（见表6）。

在连翘、红花、番泻叶、西洋参、川芎和当归的样品中，二价汞、甲基汞、乙基汞的6次平行测定值的相对标准偏差均小于15%，回收率在72.83%～98.25%之间，具有良好的精密度。

3 结论

本方法简单、快速、灵敏度高、检出限低，可用于连翘、红花、番泻叶、西洋参、川芎、当归等药用植物中汞形态的定性和定量分析，对完善中药质量控制、检测方法及相关技术有重要意义。

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