生物素与氨基酸对林可霉素生物合成

【摘要】在合成培养基中利用林可链霉菌发酵生产林可霉素。当向培养基中加入生物素和氨基酸时，林可霉素的产量受到很大影响。本研究中首先采用两水平因子设计法筛选出6个显著影响因子，即生物素、谷氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酪氨酸；然后采用中心组合设计法，得到上述6因子的优化含量分别为30μg/L、100.5、83、29、117.5和58.5mg/L；最后在摇瓶中进行验证实验，优化条件下发酵液的生物效价为2116μg/ml；对照样品I(培养基中无生物素和氨基酸)和II(培养基中按原配方加入6个显著影响因子)的生物效价分别为893和1481μg/ml，与样品I和II比较，生物效价分别提高136.62%和42.88%。

【关键词】林可链霉菌；林可霉素；发酵；生物合成；响应面法

Effectsofbiotinandaminoacidsonbiosynthesisoflincomycin

LiXiao1,ChuJu1,ZhangSiliang1,HangHaifeng1,

ZhuangYingping1andGeYouqun2

(1StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237;

2JiangxiGuoyaoPharmaceuticalCo.,Ltd,Nanchang330052)

ABSTRACTStreptomyceslincolnensiswasutilizedtoproducelincomycinbyfermentationinchemicallydefinedmedium,enormouseffectontheyieldoflincomycinwouldoccurwhenbiotinandaminoacidswereaddedtothemedium.Inthisresearch,firstly,6significantfactorswerefoundwithtwolevelfactorialdesign,namelyDbiotin,Lglutamicacid,Lvaline,Lmethionine,LleucineandLtyrosine;secondly,theoptimizedingredientsof6factorsmentionalabovewereobtainedwithcentralcompositedesign,theywere30μg/Land100.5,83,29,117.5and58.5mg/Lrespectively;finally,verificationtestwasaccomplishedinshakingflasks,thetitreofthefermentedbrothwas2116μg/mlontheoptimizedconditions,butthetitresofthecontrolI(withoutDbiotinandaminoacidsinthemedium)andcontrolII(adding6significantfactorstomediumaccordingtooriginalingredients)were893μg/mland1481μg/mlrespectively,compairedwithcontrolIorII,increasedby136.62%and42.88%.

KEYWORDSStreptomyceslincolnensis;Lincomycin;Fermentation;Biosynthesis;Responsesurfacemethod

林可霉素是一种高效广谱抗生素，临床用于由抗革兰阳性菌引起疾病的治疗［1］。林可霉素A的分子式为C18H34N2O6S，分子量为406.56，它与林可霉素B在结构上的区别［2，3］为：林可霉素A4位上为正丙基，而林可霉素B4位上是乙基，两者在药理上存在着很大的区别，林可霉素B的抑菌活性比林可霉素A低，但对人的毒副作用较大。我国药典要求成品中B含量小于5%。

林可霉素属于林可胺类抗生素，由L酪氨酸和磷酸戊糖循环(戊糖5磷酸和景天糖7磷酸)的中间产物缩合而成，整个生物合成途径包括两个分支［4］：一个由L酪氨酸合成丙脯氨酸(PPL)，另一个由景天糖7磷酸构成α甲硫林可胺(αMTL)。林可霉素A的推测生物合成途径已有文献报道［5］，并提出酪氨酸是上述第一个分支途径的主要前体。

关于提高林可霉素产量的方法比较多，可在发酵液中加入前体［6］，也可用磷酸盐对发酵过程进行调节［7～10］。在实际的大生产中，常常采用少量多次补入玉米浆来实现发酵过程的调节。玉米浆的主要成分为每100g干物质中含生物素1mg、蛋白质43g和结合氨基酸22.8g等，随着玉米浆的补入，细菌中辅酶Q的合成量提高，细胞的呼吸强度也增加［11］。

D型生物素是许多微生物必不可少的生长因子。生物素是乙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酰CoA羧化酶和3甲基巴豆酰CoA羧化酶4种羧化酶的辅酶成分［12］，它对糖代谢、脂肪酸代谢及蛋白质和氨基酸代谢有较大的影响。L型氨基酸对微生物的生长和代谢具有很重要的作用，它们一方面可经过脱氨或转氨基反应生成对微生物的生长有刺激作用的物质，如分支脂肪酸，另一方面经过脱羧等多步反应生成丙酮酸、草酰乙酸、丙酰CoA及琥珀酰CoA等，对三羧酸循环有一定的强化作用［13，14］。

本文采用合成培养基进行摇瓶发酵实验，选择玉米浆中含量较丰富的D生物素、L谷

氨酸、L缬氨酸等15个因子首先进行两水平因子设计实验，以筛选出显著影响因子，然后进行响应面设计实验，通过软件分析得到优化的发酵培养基配方。

1材料与方法

1.1菌种

林可链霉菌(Streptomyceslincolnensis)L427，由江西国药有限公司提供。

1.2培养基

种子培养基(%)淀粉1.9，葡萄糖2.5，黄豆饼粉2.3，玉米浆2.6，硫酸铵0.2，硝酸铵0.14，氯化钠0.07，硝酸钠0.086，磷酸二氢钾0.005，碳酸钙0.68。

玉米浆购自华北制药康欣有限公司，批号20060701。

发酵培养基(%)葡萄糖3.0，硫酸铵0.1，硝酸铵0.2，氯化钠0.05，磷酸氢二钾0.25，柠檬酸钠0.3，硫酸锌0.0001，硫酸亚铁0.0001，硫酸镁0.15，碳酸钙0.8。

实验设计所用D生物素和L型氨基酸购自Sigma公司。

1.3培养条件与培养方法

种子培养种子摇瓶于30℃，220r/min培养48h。

摇瓶发酵培养按30%的接种量将种子液接入发酵培养基，30℃，220r/min，培养168h。

1.4生物效价的测定

采用管碟法［15］。鉴定菌为藤黄八叠球菌［Sarcinalutea，CMCC(B)28001］，由江西国药有限责任公司提供。林可霉素(lincomycin)标准品购自Sigma公司。

2结果与讨论

2.1实验设计

本文中发酵培养基采用化学合成培养基，通过两水平因子设计(2LevelFactorialDesign)实验可迅速找出生物素和氨基酸中对林可霉素的发酵生产有显著影响的因子，进一步对显著影响因子进行响应面设计(responsesurfacedesign，RSD)实验，对结果进行优化分析可得到优化配方。所采用的实验设计、数据分析软件为DesignExpert7.0［16］。

在大量实验基础上，选用D生物素(A)、L谷氨酸(B)、L苏氨酸(C)、L丝氨酸(D)、L缬氨酸(E)、L脯氨酸(F)、L甘氨酸(G)、L蛋氨酸(H)、L天冬氨酸(J)、L精氨酸(K)、L丙氨酸(L)、L亮氨酸(M)、L赖氨酸(N)、L苯丙氨酸(O)和L酪氨酸(P)共15个因子作两水平因子设计实验，影响因子的浓度范围分别为50～200μg/L，30～110、10～60、10～60、15～70、25～90、20～80、5～50、20～80、20～80、25～90、25～90、15～70、10～60和5～50mg/L，设计表中采用“-1”、“0”和“1”分别表示对应影响因子的最低浓度值、中间浓度值和最高浓度值。

(1)两水平因子设计该设计可从大量影响因子中快速找出显著影响因子，设计方案和结果如表1所示。

用软件进行分析，得知设计模型的F值为18.05，由于噪声影响而出现大于F值的概率仅为0.02%，故本设计模型是显著的。A(D生物素)、B(L谷氨酸)、E(L缬氨酸)、H(L蛋氨酸)、M(L亮氨酸)和P(L酪氨酸)的F值分别为46.2、13.87、12.83、6.82、11.42和17.16，由于噪声影响而出现比各自F值大的概率在5%以下，故它们对模型的影响显著。曲率的F值为19.62，出现比F值大的几率仅为0.16%，说明模型的响应曲面图显著弯曲，提示模型具有很强的显著性。鉴于此，选择生物素、谷氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酪氨酸作为影响发酵生产林可霉素的关键因素，进行响应面设计。其他可信度较小的因素对林可霉素的发酵生产无显著影响，在下一步的培养基优化中不予考虑。表1两水平因子设计和实验结果

(2)响应面设计将6个显著影响因子进行响应面设计中的中心组合设计(centralcompositedesign，CCD)，可得出响应值(生物效价)关于各显著影响因子的多项二次拟合方程，再对响应面进行分析，可得响应值与各因子之间、因子与因子之间的相互关系，经过综合分析得出整个响应区域中响应值的最优值和影响因子含量的最佳组合。

①中心组合设计6个显著影响因子D生物素(a)、L谷氨酸(b)、L缬氨酸(c)、L蛋氨酸(d)、L亮氨酸(e)和L酪氨酸(f)的浓度范围分别为30～100μg/L，90～190、30～130、20～120、40～1400和20～120mg/L。设计方案和实验结果如表2所示，“-1”、“0”和“1”分别表示对应影响因子的最低浓度值、中间浓度值和最高浓度值。

方差分析结果如表3所示。该模型的F值为61.79，比F值大的几率仅为0.01%，说明该模型是显著的；由于ab、ad、ae、af、bc、cd、ce和ef各项的F值均比较大，大于各自F值的概率均在5%以下，故这些交互项对模型的影响是显著的；ac项大于其F值的概率为5.22%，由于缬氨酸(c)在玉米浆中含量较多，它对微生物的生长有刺激作用，也可认为ac项对模型的影响是显著的；失拟项的F值仅为0.25，比模型的F值要小得多，实验数据与模型不相符的情况不显著，提示本设计模型能充分反映实际情况。表2响应面设计和实验结果表3方差分析表

软件分析得知，模型的拟合度(RSquared)为0.997，说明预测值与实测值之间具有高度的相关性；校正决定系数(AdjRSquared)为0.9809，说明该模型能解释98.09%响应值(Titres)的变化,仅有总变异的1.91%不能用此模型来解释；模型的信噪比(AdeqPrecision)为23.723，一般来说，模型的信噪比大于4就是较好的模型，进一步说明本模型设计是非常成功的。

②分析与优化利用软件对生物效价预测值与显著影响交互项ab、ac、ad、ae、af、bc、cd、ce、ef之间的响应面图进行分析，得知上述交互作用项对生物效价的影响很大，在低浓度范围内，生物素浓度越低，生物效价的预测值越大；谷氨酸和缬氨酸之间、缬氨酸和亮氨酸之间以及亮氨酸和酪氨酸之间对生物效价的影响具有显著的正协同效应；缬氨酸和蛋氨酸对生物效价的影响存在拮抗效应，缬氨酸浓度较高和蛋氨酸浓度较低时，预测效价值较高。

对上述结果进行分析可知，低浓度的生物素对林可链霉菌的糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢有促进作用；林可链霉菌对谷氨酸的需求量较高，可能是因为其参与较多的脱氨基和转氨基反应，生成了较多的α酮戊二酸等中间产物，一方面对三羧酸循环有强化作用，另一方面可为林可霉素的生成提供丰富的中间产物；缬氨酸和亮氨酸为分支氨基酸，它们脱氨基可生成支链脂肪酸，对林可链霉菌的生长有刺激作用；酪氨酸为林可霉素A合成的前体，补入适量的前体，可提高林可霉素A的合成速率和产量；蛋氨酸为去甲基林可胺转甲基反应的甲基供体，它对林可霉素的合成速率可能具有较大的限制作用，而缬氨酸对林可霉素的生长具有刺激作用，菌体生长与林可霉素的合成在某种程度上说是一种相互制约的关系，这样就表现为蛋氨酸和缬氨酸之间的拮抗作用，而且林可霉素的合成要求有较高的菌浓，故培养基中应适当增加缬氨酸的浓度，相应适当降低蛋氨酸的浓度。

应用DesignExpert7.0软件进行优化分析，得到生物效价的最大预测值为2275μg/ml，对应的D生物素、L谷氨酸、L缬氨酸、L蛋氨酸、L亮氨酸和L酪氨酸的浓度为：30μg/L及100.5、83、29、117.5和58.5mg/L。由江西国药厂林可链霉菌L427发酵得到的林可霉素产品中B组分含量很低，所以本研究未用HPLC测定B组分含量。

2.3验证实验

为了检验优化结果的有效性，在摇瓶中同步进行了优化组、对照组I(培养基中无生物素和氨基酸)和对照组II(培养基中按原配方加入6个显著影响因子)的验证实验，结果如表4所示。

3结论

在化学合成培养基中用林可链霉菌发酵生产林可霉素，通过两水平因子设计实验对生物素和氨基酸组分进行筛选，得出六个对生物效价有显著影响的因子：D生物素、L谷氨酸、L缬氨酸、L蛋氨酸、L亮氨酸和L酪氨酸；通过响应面设计实验和软件的优化分析表4验证实验设计与结果

a：发酵培养基配方为原始配方(材料与方法)与表4配方的组合；b：生物效价为每组3个平行样的平均值。

得到上述六个显著影响因子的含量分别为30μg/L及100.5、83、29、117.5和58.5mg/L时，最终发酵液的最大预测效价为2275μg/ml。

采用优化配方进行摇瓶实验，最终发酵液的生物效价为2116μg/ml；而采用对照I和II配方进行摇瓶实验，最终发酵液的生物效价分别为893和1481μg/ml，即采用优化配方相对于采用对照I和II配方在生物效价方面提高的百分含量分别为136.62%和42.88%。

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