微生物法测定婴幼儿奶粉中游离生物素条件优化

摘要 微生物法测定婴幼儿奶粉中游离生物素含量因实验室条件差异，严格按照国标方法测定标准曲线线性及结果的准确性及重现性均不太理想。对菌悬液浓度、菌种传代次数以及标准溶液配制方式进行优化，试验结果表明，最佳条件为菌悬液吸光度（A）0.50～0.64、菌种传代不超过5 次、标准溶液使用超纯水临用现配的条件下标准曲线符合试验要求，相关系数（R2）可达0.995 6，有较大的提高，此条件下平均回收率92%，变异系数为3.56%。

关键词 微生物法；婴幼儿奶粉；游离生物素；条件优化

中图分类号 TS252.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）15-0296-02

婴幼儿奶粉中游离生物素的检测方法有微生物法、色谱法、荧光法、ELISA法等，微生物法具有灵敏度高的特点，我国国家标准及国际上通常采用微生物法测定。但是由于各实验室工作条件的差异，严格按照国标试验条件通常无法取得可信的检测结果，失败率较高且检测成本高[1-3]。因此，针对笔者所在实验室情况对试验条件进行简化优化，以期提高试验质量和检测结果准确性，降低检测成本。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种为植物乳杆菌（ATCC8014），由美国模式培养物集存库提供。供试培养基为乳酸杆菌肉汤培养基（青岛海博），游离生物素测定培养基（碧迪医药器械公司）。生物素标准品（上海安普）。供试仪器与设备：TU-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析）；LRH-250 生化培养箱（广东医疗器械厂）；SIK-202净化工作台（苏净集团安泰公司制造）；YXQ-LS-75S立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制作。样品处理及标准曲线的制作及样品测定的步骤参照GB5413.19-2010，接种时使用一次性无菌注射器垂直悬空滴加1滴菌液。标准曲线工作液浓度c=0.2 ng/mL。

1.2.2 标准曲线溶液配制方式的影响。使用乳杆菌肉汤培养基对菌种进行传代活化，以第4代菌株制备菌悬液，菌悬液吸光度A=0.57，自标准中间液起分别使用超纯水、50%乙醇溶液配制，分别进行标准曲线制作，每种方式重复试验3次。

1.2.3 菌悬液浓度的影响。使用乳杆菌肉汤培养基对菌种进行传代活化，使用超纯水配制标准曲线工作液，以第4代菌株制备系列浓度菌悬液，菌悬液吸光度（A）分别为0.14、0.22、0.36、0.50、0.64、0.79，分别进行标准曲线制作。

1.2.4 传代次数的影响。使用乳杆菌肉汤培养基对菌种进行传代活化，使用超纯水配制标准曲线工作液，分别以第1、2、3、4、5、6代菌株制备菌悬液，菌悬液吸光度依次为0.52、0.54、0.56、0.54、0.60、0.55，分别进行标准曲线制作。

2 结果与分析

为考察各因素对标准曲线线性的影响，考虑标准溶液配制方式、传代培养基选择、传代次数及菌悬液浓度对试验曲线线性的影响。

2.1 标准曲线溶液配制方式的影响

使用50%乙醇溶液配制标准工作液试验标准曲线基本没有线性，不能满足试验的线性要求，而使用超纯水配制标准溶液试验的标准曲线线性有极大提高，最高可达到0.991 2（表1、表2）， 3次结果均符合试验要求。GB5413.19中要求使用50%乙醇溶液配制标准工作液，但是由于灭菌过程中的高温及试管的气密性问题造成乙醇挥发，导致测试管体积发生不均一变化导致曲线线性差，同时由于乙醇本身可抑制植物乳杆菌的生长，标准工作液中的乙醇不同程度地影响了试验最终的微生物生长量也是造成线性差或无线性的原因。采用超纯水配制可以避免这些问题的发生，有效提高曲线的线性。

2.2 菌悬液浓度的影响

菌悬液吸光度（A）在0.50～0.79曲线线性符合试验要求，R2在此范围内变化不大，菌悬液吸光度达到0.79时虽然线性基本符合试验要求，但测试管内生长量过大，吸光度过大，对试验结果有一定的影响，且试验时间不宜控制，因此菌悬液吸光度在0.50～0.64较为适宜（图1）。菌悬液浓度过低，标曲线性差的原因可能是浓度最高管生长终止时间过长，时间过长可能导致植物乳杆菌死亡而无法完全消耗最高浓度管生物素。

2.3 传代次数的影响

1～5代的菌种均可满足试验要求，超过5代以后曲线线性明显下降，可能原因是随着传代次数的增加，菌种发生变异，特异性发生改变，从而无法正常体现植物乳杆菌对生物素的特异性需求，而无法呈线性生长，导致试验没有线性或线性差（图2）。

3 结论与讨论

使用超纯水配制标准曲线工作液、菌悬液吸光度A=0.57、第4代菌种制备菌悬液来制作标准曲线，曲线y=1.023 7x+0.180 8，R2=0.996 2。对不同样品进行测定并做加标试验，平均加标回收率为92%，加标回收率范围为85%～97%，对同一样品进行10次重复试验，变异系数为3.56%。使用超纯水配制标准曲线工作液、菌悬液吸光度A在0.50～0.64、不超过5代的菌种制备菌悬液的条件下，试验准确度较高，重现性较好，同时采用5个浓度点来制作曲线，较国标方法不仅减轻了工作量而且降低了检测成本，因此此试验条件具有一定的可行性。

试验过程中器皿的清洗、商品培养基的选择、菌种使用乳杆菌肉汤培养基传代活化、标准工作液临用现配，注射器滴加菌种必须垂直悬空以及培养时间的控制等均是试验成败的关键[4-6]。

4 参考文献

[1] 殷晓红，杨金宝，张潇宇，等.婴儿配方食品中生物素测定[J].中国乳品工业，2002，30（5）：117-119.

[2] 汤水平，李冰，彭灿，等.微生物法测定婴幼儿配方乳粉中游离生物素含量的研究[J].食品与机械，2008，24（5）：96-98.

[3] 余家林，朱倩军.概率论与数理统计[M].北京：高等教育出版社，2006.

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