生物素范文

生物素范文第1篇

关键词

关键词：高效液相色谱法　生物素　含量测定

前言

生物素(d-Biotin)又称维生素H或辅酶R，主要作为各种羧化酶的辅助因子。对糖、脂肪、蛋白质和核酸等代谢有重要意义，广泛应用于医疗，多维制剂及饲料添加剂等方面。已载入美国及欧州等国药典，含量测定均采用化学滴定法。本文建立了测定生物素的HPLC法，操作简便，结果准确，速度比较快。

实验部分

一、主要仪器与试剂

1.仪器

高效液相色谱仪：Agilent 1100　Chemstation 色谱工作站

2.试剂

乙腈( 浙江临海市浙东特种试剂厂，色谱纯)

三氟乙酸(上海化学试剂厂，分析纯)

磷酸（杭州化学试剂厂，分析纯）

3.试验样品

生物素对照品(中国药品生物制品鉴定所，含量100%，批号：1029*1-0001)。

生物素样品(浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：20070826，20070827，20070831)。

二、实验方法

1.色谱条件

高效液相色谱仪：安捷伦（Agilent）1100 （LC）

色谱柱：VP-ODS色谱柱(4.6 mm×250mm,5um)；

流动相：取乙腈250ml，加磷酸1ml，再加入0.05%三氟乙酸溶液750ml，混合均匀，过滤；

检测器：紫外检测器

检测波长：210nm；

进样体积：20μl

柱温：室温。

2.测试方法

精密称取生物素样品约10mg，置于50ml容量瓶中，加流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。另精密称取生物素对照品约10mg，置于50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。分别将上述两种溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算主色谱峰峰面积，用外标法计算生物素含量。

三、方法的确定

实验方法的确定涉及到多个方面，例如色谱柱、流动相、检测波长、柱温的选择与确定等。本文重点阐述检测波长的选择与确定。

由于生物素结构具有有一定的极性，因此选择采用反相色谱法，色谱柱选择常用的ODS柱，尺寸4.6 mm×250mm,填料粒径5um。

1.检测波长的确定

根据生物素本身紫外吸收的特性，使检测波长尽量靠近生物素最大吸收波长且尽可能避免溶剂截止波长的影响。

1.1 溶剂截止波长的影响

我们所使用的流动相和溶解样品涉及的溶剂为乙腈，由于乙腈的截止波长为190nm，因此我们应该把波长的选择放在大于或等于210nm的范围。

1.2生物素的紫外吸收特性

当然波长的测定主要还是依赖于待测试样品的紫外吸收特征来决定的。为测定生物素样品的吸收特性，我们使用二级管阵列检测器（DAD检测器）进行测定得到生物素标准品的紫外吸收色谱图。生物素的最大吸收波长位于198nm左右,从该波长开始随着波长增大，吸收变弱。高于225nm时，生物素没有明显的紫外吸收迹象。198nm～215nm是生物素紫外吸收相对较强区域。结合流动相中所含溶剂乙腈截止波长的影响。故选择范围应大于等于210nm的波长。在210 nm ～215nm区域下生物素的最大吸收在210nm，故最后选择210nm。

2. 流动相

流动相：采用乙腈-磷酸-0.05%三氟乙酸溶液(250：1：750)为流动相。

取空白溶液(流动相)注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行色谱分析，记录色谱图。将空白溶液的色谱图与样品溶液的色谱图进行比较，结果显示空白溶液对生物素的测定无干扰。

取生物素对照品溶液(2.2测试方法)注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行色谱分析，记录色谱图，结果该色谱条件下生物素峰的较高的柱效(本次为7943理论塔板数)和较低的拖尾因子(本次为1.146)：

四、方法验证

1.线性试验

精密称取生物素对照品25mg置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀。分别精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml各置10ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀。浓度分别为0.05 mg/ml、0.10 mg/ml、0.15 mg/ml、0.20 mg/ml、0.25 mg/ml、0.30 mg/ml（涵盖范围相当工作浓度的25%至工作浓度的150%），分别取上述溶液20ul注入色谱仪进样测定，记录色谱图。以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归分析，计算线性回归方程，相关系数。计算的结果见下表。

经回归分析可得，生物素样品的线性回归方程为：A=8246.29 C + 15.73 (相关系数r=0.9999),线性范围： 0.05～0.30mg/ml

以上结果表明，在样品浓度0.05～0.30mg/ml（相当于工作浓度的25%至工作浓度的150%）范围内线性关系良好。

2. 准确度（回收率试验）

取某个已知含量的样品，精密称取，加流动相溶解分别制成含生物素为0.16、0.20、0.24mg/ml的溶液，每个浓度各进样三次，计算生物素含量的平均回收率、生物素含量相对标准偏差（RSD）。计算结果见下表。

生物素范文第2篇

【关键词】生物素—卟啉偶联物；生物素；合成

1、实验部分

1.1仪器与试剂

傅立叶红外变换光谱仪为Equinax55型，德国Bruker公司；质谱仪LCQdeca XP plus，美国Finnigen公司；紫外-可见分光光度计7Cary紫外可见分光光度计，安捷伦公司，元素分析仪，美国P.E公司；核磁共振仪（400MHZ） 德国Bruker公司，吡咯（CR），Flucka公司；对羟基苯甲醛，瑞典进口； 三氟乙酸酐（CR），国药集团化学试剂公司，氯化钯（AR），国药集团化学试剂公司；D-生物素，日本进口；其他试剂无特殊说明者皆为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1化合物Ⅰ的合成

参照文献合成，采取如下方法，量取80ml丙酸、硝基苯25mL，110mL冰乙酸加入到500ml三口瓶，加热回流20min分钟，然后用滴加漏斗滴加滴加120mmol（14.66g）的对羟基苯甲醛与80mL的丙酸的混合液，低价完毕后，滴加120mmol（8.32ml）新蒸吡咯的60mL丙酸溶液，滴加完毕后，保持135-140℃反应2h，自然冷却至室温，减压过滤，得粗产品，烘干，将烘干后的粗产品用10%的NaOH水溶液溶解，滤去不溶物，得蓝黑色液体，滤液用浓盐酸调PH值7，溶液中会有沉淀析出，减压过滤，得黑色粘状物，真空干燥，用无水甲醇重结晶，用100目硅胶柱层析纯化，采用丙酮做洗脱剂，收集产物，浓缩干，得紫色晶体3.8g，产率19%。

1.2.2化合物Ⅱ的合成

称取化合物Ⅰ274mg（0.4mmol），三氟乙酸酐（TFAA）320uL和甲苯10mL加入25mL的圆底烧中，热回流，保持110-120℃反应6小时，反应完全后，减压蒸馏以除去甲苯，得化合物Ⅱ。

1.2.3化合物Ⅲ合成

在50mL吡啶中依次加入生物素366.0mg（0.1mmol）和化合物Ⅱ，40-50℃搅拌3h，冷却至室温，加500ml无水乙醚，冷却至0℃搅拌5h，减压过滤，无水乙醚洗涤，得紫色晶体，用100目硅胶柱层析纯化，先用丙酮洗脱，后改用乙醇洗脱，收集产物，减压蒸干，真空干燥得产物Ⅲ220.0mg，产率约为50%。

1.2.4化合物IV的合成

称取100mg二氯化钯溶在50mL苯甲腈中，加热至100℃反应2h，自然冷却至室温，滴加60ml石油醚，有固体析出，减压过滤，石油醚洗涤。真空干燥得淡黄色固体180mg，产率为79%，然后将钯的苯甲腈络合物和100mg化合物Ⅲ溶在30ml甲苯中，于50℃加热5小时，然后减压蒸除甲苯，残余物用甲醇溶解，用200—300目硅胶柱层析纯化，甲醇作洗脱剂，收集产物，真空干燥得产物63mg，收率为49%。

2、结果与讨论

2.1结构表征

化合物Ⅱ红外光谱图在3319cm-1（吡咯环：N-H）；1241cm-1（苯环：C-O）；1606cm-1，1509cm-（卟啉环：C-N，CH-N）有特征吸收峰。卟啉配体的紫外-可见光谱在418nm的强吸收峰为卟啉化合物的特征吸收Soret带，516nm，554nm，652nm处为Q带吸收峰。MS（+ESI）， 680（M++1）。元素分析（皆质量百分数，括号内为理论值，下同）：C，77.84（77.86）；N，8.17（8.25）；H，4.40（4.46）。

化合物Ⅲ的红外光谱图谱在1224.82cm-1， 1143.85 cm-1（酯：C-O—C），1698cm-1（酯：C=O）处酯的特征吸收峰，其他特征吸收峰基本与II相同。其紫外-可见光谱的在414nm，512nm，548nm，649nm有吸收峰，与化合物Ⅱ相比，其Soret带和Q带都发生了一定波数的蓝移，这是由于发生反应生成酯，氧原子与苯环形成的p-π共轭有所减弱，引起紫外-可见光谱发生了一定波数的蓝移。

化合物V红外光谱图在3422cm-1（NH2：N-H）；1282cm-1（苯环：C-N）；1653cm-1（CON：C=O）；998cm-1有吸收峰，通过与化合物IV的红外光谱图谱相比，卟啉环环内的N-H吸收峰（3319cm-1）消失，在998cm-1处产生了一个新的吸收峰，根据文献报道，这个吸收峰是Zn（Ⅱ）氧化态敏感带，由此吸收峰可以判断卟啉环已经和金属钯离子形成了配合物。紫外-可见光谱431nm，564nm，Q带吸收峰减少了两个，金属离子和卟啉形成络合物物后，络合物环内的对称性增强，能级相近，表现为Q带数目的变少变弱，其Soret带（418nm）与化合物Ⅲ比较红移了4个nm，可能是Pd（Ⅱ）的特殊价电子结构为3d10，属于红移型光谱价电子层结构，于是发生了Soret带红移。从1H-NMR谱分析，化合物IV在δ为-2.65处出现环内两个质子的吸收峰，这是由于卟啉环大π电子流对其产生很强的屏蔽作用而产生的。而化合物V中，由于金属离子和卟啉环形成络合物，在此处特征的吸收峰消失。

2.2合成方法

生物素范文第3篇

泛酸又名维生素B5，因为它在动、植物中广泛分布，性质偏酸，所以被称为泛酸。

泛酸可以协助糖类、脂肪分解转化为能量，参与机体许多重要物质的合成和分解代谢，制造及更新机体组织。泛酸与头发、皮肤的营养状态密切相关，所以头发稀疏或缺乏光泽的人可以试试多补充一些富含泛酸的食物。此外，泛酸还可使机体抵抗疾病的能力增强，防止疲劳，辅助减压。泛酸还有助于缓和多种抗生素的毒副作用，并减轻过敏症状。

泛酸广泛存在于自然界的各种食物中，含量最丰富的天然食物是蜂王浆、金枪鱼等。人类获取泛酸的来源主要有动物内脏、肉类、鸡蛋、蘑菇、坚果、绿色蔬菜和某些酵母，全谷类食品也是其良好的来源，但容易受到加工程度的影响，而使泛酸大量丢失。

机体一般不会出现泛酸的缺乏，除非是严重的营养不良患者和使用泛酸拮抗剂治疗疾病的患者。而且，泛酸缺乏通常是由于糖、脂肪和蛋白质三大热能营养素和维生素不足而伴随引起的。根据泛酸缺乏的程度不同，所产生的症状也会有所不同，其中包括疲倦、忧郁、失眠、感觉迟钝、肌肉痉挛、运动机能不协调、食欲不振、消化不良，血液及皮肤异常，低血糖症等。

摄入过多泛酸而引起毒副作用尚未见报道，只是大剂量的泛酸会引起轻度的胃肠不适。

生物素

生物素，又称为维生素H，它其实也属于B族维生素，同样是机体不可缺少的重要营养物质。

生物素可以作为新陈代谢过程中许多酶的辅助因子，参与碳水化合物、脂类、蛋白质和核酸的代谢，并发挥重要作用。比如，生物素可以将食物转化为能量；可以使细胞再生，预防白发及脱发，保护头发和指甲的健康；缓解肌肉疼痛；减轻皮炎症状；改善糖尿病患者血糖等。

如果人体缺乏生物素，就会出现皮肤干燥，甚至发生皲裂、四肢鳞状皮炎、肌肉疼痛，脱发或白发，食欲不振、恶心、呕吐，红细胞水平下降，脂类代谢障碍、胆固醇增高，精神抑郁、失眠、易激惹或冷漠、沮丧等一系列症状。

生物素广泛存在于各类动、植物性食物中，也能由人体胃肠道细菌合成。牛奶、水果、啤酒酵母、大豆粉、花生、黄油、动物内脏、瘦肉、蛋黄、糙米、小麦等都是生物素良好的来源。摄入磺胺类药、雌激素、酒精时，会影响生物素的吸收。胃酸分泌缺乏也会减少生物素的吸收，造成生物素缺乏。

医生建议，饮酒的人或正在服用抗生素或磺胺类药的人每天应补充一定量的生物素；经常脱发、头发稀疏的人可以适当摄入生物素。另外，妊娠期间生物素会明显流失，应在医生或营养师的指导下合理补充。生物素和维生素A、B2、B6、烟酸有协同作用，一起服用效果更佳。

胆 碱

胆碱是具有强碱性的一种有机化合物，它是卵磷脂的关键组分，也存在于神经鞘磷脂之中，参与体内多种生化反应。胆碱是合成乙酰胆碱的前体，乙酰胆碱是传递神经信息的重要物质，参与许多神经活动，极为重要。虽然人体可以合成胆碱，它并不属于人体必需的维生素，但因为它的重要作用，很多专家主张将胆碱也作为维生素B族中的一员。

胆碱的功能主要体现在：

防止脂肪肝的发生，促进脂肪在肝脏中的代谢、利用，避免脂肪堆积；

促进脑发育，提高记忆力，因为胆碱可以通过“血脑屏障”进入脑细胞，制造帮助记忆的化学物质。胆碱还可以防止老年人记忆力衰退，有助于治疗老年痴呆症；

降低血清胆固醇，避免胆固醇在血管壁沉积而引起的动脉粥样硬化，预防心血管疾病；

此外，胆碱还有很多其他的生理功能，如构成生物膜，保证细胞间信息的正常传递，促进代谢，调控细胞凋亡等。

由于人体可以合成胆碱，所以一般不会出现胆碱缺乏。但一旦出现胆碱缺乏，可能会导致肝肾功能的损害、记忆功能的紊乱、生长发育的障碍，甚至有可能诱发肝癌。

生物素范文第4篇

关键词：生物素；羧化酶辅酶；基因表达

生物素（biotin），是动物机体内维持正常生理机能所必需的维生素之一。由于生物素广泛分布于动植物中，在食物中分布较为广泛，而且动物肠道菌群能够合成生物素，因此，过去人们曾经认为食物中不会缺乏生物素。但是，由于人类科技的迅速发展，生活水平的不断提高，吃的食物越来越精细化，经常出现了生物素缺乏症的案例。尤其是那些爱吃在集约化条件下生产的快餐、方便面等加工食品的人群，更容易出现生物素缺乏症状。于是，人们开始重新审视和研究生物素的营养作用。近年来，生物素已成为人们最受关注的水溶性维生素之一。

一、生物素的化学结构和分子作用机制

生物素的化学结构中包括具有尿素与噻吩相结合成骈环的两个五元杂环，和一个带有五个碳原子的羧基侧链组成。天然的生物素主要以与其它分子结合的形式存在，在体内由侧链上的五个碳原子羧基与酶蛋白的赖氨酸s残基结合，发挥辅酶作用。生物素有8种不同的异构体，其中只有D-生物素具有生物活性。在一般情况下，生物素是相当稳定的，只有在强酸、强碱、甲醛、败脂肪、胆碱及紫外线照射才会逐渐被破坏。生物素是许多需ATP的羧化反应中羧基的载体，羧基暂时与生物素双环系统上的一个氮原子结合，如在丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸的反应中。动物缺乏生物素会引起皮肤疾病和脱毛症。鸡蛋清蛋白含有能与生物素紧密结合的抗生物素蛋白，如果大量食用生鸡蛋，就会妨碍生物素的吸收，可导致人类生物素缺乏症。在正常情况下，人类肠道细菌合成的生物素可以满足人体正常新陈代谢的需要，不会发生生物素缺乏症。在生物体内，它几乎都是作为生物素酶的辅基与蛋白质的赖氨酸的ε-氨基形成共价键。其生理作用主要是由生物素酶引起的固碳作用及羧基转移反应。通过丙酰辅酶A羧化酶，乙酰辅酶A羧化酶，甲基丙二酸单酰CoA羧基转移酶等反应，参与糖和脂肪的代谢。在这些酶促反应中形成的N-羧基生物素作为中间产物。

生物素是羧化和羧基转移酶系的辅酶，是羧基转用的载体，这些酶系在细胞中有转移羧基和固定二氧化碳的作用。具体分子作用机制表现在：1、生物素作为丙酮酸羧化酶的辅酶，通过糖异生作用，从丙酮酸到丁酮二酸生成葡萄糖；2、当乙酰辅酶A被乙酰辅酶羧化酶产生丙二酸单酰辅酶A的时候，生物素作为乙酰辅酶A羧化酶成分起作用。消耗三磷酸腺苷ATP而生成羧基生物素中间体，然后将活性二氧化碳提供给乙酰辅酶A，生成丙二酸单酰辅酶A，这是脂肪酸合成的首步反应，再与一分子乙酰辅酶A结合，经脱羧，还原和去水后，被转化为丁酰辅酶A。这个衍生物经过反复合成，最终形成长链脂肪酸（硬脂酸、棕榈酸）。在长链不饱和脂肪酸合成过程中，尤其是必需脂肪酸代谢中，生物素是十分重要。3、在碳水化合物供给不足时，从脂肪和蛋白质生成葡萄糖的糖原异生作用中，生物素都起着重要的作用，三羧酸循环也离不开它；氨基酸代谢中，直接参与亮氨酸和异亮氨酸等氨基酸的脱氨基及核酸代谢，蛋氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙酰辅酶A羧化酶（生物素酶）的作用，经琥珀酰辅酶A进入柠檬酸循环。4、其他作用，氨基甲酰转移、嘌呤合成、糖代谢、色氨酸分解等，生物素还通过其对核糖核酸的性质和合成速度的作用，而影响蛋白质的合成。5、生物素可以使肝脏鸟氨酸转甲氨酰酶活性及其mRNA丰度升高，鸟氨酸转甲氨酰酶在精氨酸代谢和尿素循环中起着很重要的作用。

二、生物素影响基因表达的作用机理

目前，已经发现生物素影响基因表达的主要途径有3条：1、生物素酰腺苷酸能够激活可溶性鸟苷酸环化酶；2、生物素能够影响细胞核因子与其他转录因子的活性；3、生物素与组蛋白结合对染色体的重组的影响。

DNA芯片研究表明，生物素对外周血液单核细胞的200多个基因表达有影响。生物素在蛋白质合成、氨基酸脱羧、嘌呤合成、氨基甲酰转移及亮氨酸和色氨酸分解代谢中起着重要作用，也是多种氨基酸转移脱羧所必需。 生物素不仅参与羧化酶代谢途径，而且影响基因表达，动物缺乏生物素将导致细胞增殖减缓，免疫功能受损和胚胎发育畸形。

1、生物素酰腺苷酸。生物素酰腺苷酸是羧化全酶合成过程中的中间产物，生物素酰腺苷酸的合成是由羧化全酶合成酶催化的，生物素酰腺苷酸是通过一种目前尚不清楚的作用机理对可溶性鸟苷酸环化酶进行活化。鸟酸环化酶的活化使环鸟苷酸量增加，从而刺激蛋白激酶G产生信号传导，蛋白磷酸化得到活化，使编码羧化全酶合成酶、乙酰-CoA羧化酶，丙酰-CoA羧化酶基因转录活性增强。如果生物素缺乏或羧化全酶合成酶的活性降低这些基因的转录活性将受阻碍。在大肠杆菌和其他肠道细菌中，有一族基因参与生物素的合成，生物素酰腺苷酸与生物素蛋白连接酶形成复合物，复合物结合在生物素操纵子的启动子区域，通过反馈调节抑制这些基因表达。

2、细胞核因子与其他转录因子。细胞核因子在参与调节，防止细胞死亡和胚胎发育等过程起着重要的作用。哺乳动物NF-kB、Rel家族已经有五个转录因子被克隆和测序。其作用机理：细胞未受刺激时NF-kB家族蛋白以二聚体的形式存在，单体IkBα或者IkBβ使该二聚体活性受到抑制，NF-kB与IkB结合后滞留在细胞质中，IkB激酶受到细菌、细胞因子、有丝分裂原、生长因子和激素等刺激后引发IkBs磷酸化，之后在蛋白酶体依赖性途径中降解；被释放的NF-kB二聚体移位到细胞核中，结合在基因调控区域的反应元件从而引发基因表达。

3、组蛋白的生物素酰化。染色质包括DNA、组蛋白和非组蛋白，DNA的折叠进入染色质主要由组蛋白起作用。组蛋白可以通过乙酰化、甲基化、磷酸化、泛蛋白化等共价修饰。研究发现人体细胞含有生物素酰化的组蛋白。Stanley等通过酸提取的方法在人体外周血液单核细胞细胞核中分离出了生物素酰化的组蛋白。在人体T细胞白血病细胞系、细小细胞肺癌细胞、人绒膜癌细胞和鸡红血球细胞等也发现有生物素酰化组蛋白，组蛋白的生物素酰化对细胞增殖起着很重要的作用；组蛋白的生物素酰化可以促进人体外周血液单核细胞的增殖。但与生物素酰化组蛋白相关的基因是否被激活或沉默以及生物素酰化组蛋白是否参与DNA修复尚不清楚。最近研究发现，在紫外诱导的DNA损伤的细胞中生物素酰化蛋白量较高，推测生物素酰化组蛋白可能参与DNA损伤的修复。

本文通过生物素对人体基因表达主要途径影响以及生物素是以多种酶的辅助因子形式参与人体许多的新陈代谢过程的研究，阐明了生物素是人体维持正常生理机能所不可或缺一种维生素。

参考文献

[1]潘林，孙建义。生物素的生理功能及其分子作用机制[J]。中国饲料，2005（03）。

[2]刁立兰，李秀珍，杨平平，薛永玲，王燕。生物素测定方法的分析[J]。食品与发酵工业，2007（06）。

生物素范文第5篇

【关键词】 氯胺酮；单克隆抗体；生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法

biotin-avidin mediated competitive enzyme-linked immunosorbent　assay for determination of ketaminezhang wen-di，su ping，yang yi*，guo zhen-quan(college of science，beijing university of chemical technology，beijing 100029)(college of life sciences，peking university，beijing 100871)abstract a rapid and sensitive method based on biotin-avidin mediated competitive enzyme-linked immunosorbent assay(ba-elisa) was established for the determination of ketamine.the optimal concentration of coated antigen and anti-ketamine monoclonal antibody were found to be 2.0 and 10.2 mg/l.the concentrations of biotinylated goat anti-mouse igg(biotin-igg) and streptavidin-horseradish peroxidase(sa-hrp) were optimized and the optimum results were found to be 0.29 and 1.0 mg/l，respectively.the linear range of the presented method was from 0.1 to 1000 μg/l，and the limit of detection was found to be 0.03 μg/l.the recoveries of ketamine spiked in human serum and urine were between 94% and 102%.comparing the result of traditional elisa，the present ba-elisa method had a lower detection limit for ketamine.the experimental results indicated that the present ba-elisa method was specific and sensitive.

keywords ketamine；monoclonal antibody；biotin-avidin mediated competitive enzyme-linked immunosorbent assay

1 引言

氯胺酮(ketamine)是苯环己哌啶的衍生物，属n-甲基-d-天门冬氨酸(nmda)受体拮抗剂，主要用于小手术、小儿检查或诊断操作时麻醉诱导及辅助麻醉[1]。氯胺酮具有一定的兴奋、致幻和依赖性，近年来，其滥用现象日益严重。检测氯胺酮方法主要是色谱法[2~4]。由于生物样品的基体复杂， 前处理步骤繁琐，色谱方法不适合大量样品的现场检测。因此，建立一种快速、可靠和低成本的氯胺酮检测方法具有重要意义。

免疫分析具有特异性强、选择性好等优点，可对复杂体系中痕量物质进行快速灵敏检测，被广泛应用于生物学、医学等领域[5]。2003年，tan等首次报道了由美国neogen公司制造的氯胺酮试剂盒[6]。本实验利用制备的氯胺酮单克隆抗体，采用生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法，检测人体血清和尿液样品中的氯胺酮，具有高特异性和高灵敏度等特点。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

genios酶标仪(澳大利亚tecan公司)；生化培养箱(哈尔滨东联电子技术公司)；96孔酶标板(美国costar公司)；牛血清白蛋白(bsa)，卵清蛋白(ova)和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tmb，美国sigma公司)；生物素化羊抗小鼠igg(biotin-igg)，酶标链霉亲和素(sa-hrp)和hrp标记羊抗小鼠igg(北京博奥森生物技术有限公司)；溴代乙酰溴(山东金城医药化工股份有限公司)；氯胺酮、去甲氯胺酮和可卡因(中国药品生物制品检定所)；吗啡(青海制药厂)；其它试剂均为国产分析纯，实验用水为重蒸的去离子水。

2.2 实验步骤

2.2.1 氯胺酮全抗原的合成 取100 mg氯胺酮和300 mg k2co3溶于20 ml甲苯中，在氮气保护下向上述溶液中缓慢加入500 μl溴代乙酰溴[7]，常温搅拌5 h。将所得溶液旋转蒸干，用磷酸盐缓冲溶液溶解残渣。将含有bsa的磷酸盐溶液缓慢加至上述溶液，搅拌过夜，冷冻干燥即得氯胺酮全抗原(ketamine-bsa)。全抗原(ketamine-ova)的合成方法与ketamine-bsa相同。

2.2.2 氯胺酮单克隆抗体的制备及纯化[8] 用制备好的全抗原多次免疫小鼠后，取其脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合，获得氯胺酮杂交瘤细胞，经筛选和克隆化后，将稳定分泌氯胺酮单抗的杂交瘤细胞株进行冻存。实验时将其从液氮罐中取出传代培养，状态良好后注射入小鼠腹腔内，两周后收集腹水。采用优球蛋白法纯化所得腹水，用紫外-可见分光光度法测定，以公式cprotein(g/l)=1.45a280－0.74a260计算纯化后氯胺酮单克隆抗体的蛋白浓度[9]，于－20 ℃保存。

2.2.3 生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法的测定步骤 参考文献[10]，用抗原溶液包被96孔板，4 ℃下放置过夜。次日用明胶溶液封闭2 h，加入氯胺酮单克隆抗体和氯胺酮溶液温育1 h。再依次加入biotin-igg和sa-hrp，分别温育60和50 min。然后加入底物，15 min后终止显色反应。最后利用酶标仪测定450 nm的吸光度值。

2.2.4 氯胺酮生物样品的测定 实验所用人体血清和尿液均来自健康捐赠者。将已知高、中、低浓度的氯胺酮加入上述血清和尿液样品中，同氯胺酮单克隆抗体混合，在优化条件下，采用ba-elisa法测定。

3 结果与讨论

3.1 全抗原的合成

利用溴代乙酰溴对氯胺酮的仲氨基进行活化，活化后与bsa或ova的氨基进行反应，获得氯胺酮全抗原(ketamine-bsa或ketamine-ova)。以考马斯亮蓝法分别对ketamine-bsa和ketamine-ova的偶联率进行测定，

图1 杂交瘤细胞染色体照片（放大600倍）（略）

fig.1 photos of somatic chromosomes of hybridomas(magnification×600)结果分别为1∶20和1∶21，满足免疫反应的需求。

3.2 单克隆抗体的鉴定

对处于生长对数期的杂交瘤细胞进行染色体检测。如图1所示，杂交瘤细胞约有100条染色体，证明其为小鼠脾细胞（20对染色体）与sp2/0细胞（36对染色体）融合而成。采用间接elisa测定腹水效价，结果为1∶105。

3.3 抗原和抗体工作浓度的确定

分别以8， 4， 2和1 mg/l的全抗原包被酶标板，加入10倍比稀释的抗体溶液，按照2.2.3节操作步骤检测。

如图2所示，其中，c0为抗体储备液的浓度，c为10倍比稀释抗体的浓度。本实验选择2.0 mg/l作为抗原的最佳包被浓度，在此抗原浓度下，吸光度下降到最大值一半时的抗体稀释度为1000，所对应的抗体工作浓度为10.2 mg/l。

图2 抗原和抗体最佳工作浓度的测定（略）

fig.2 determination of the optimal concentrations of antibody and coated antigen

ketamine-bsa：（■）8 mg/l；（） 4 mg/l；（） 2 mg/l；（?） 1 mg/l； c0和c分别为抗体储备液和10倍比稀释抗体的浓度（c0 and c are the concentrations of stock antibody solution and 10-fold serially diluted antibody solution ）。

3.4 biotin-igg与sa-hrp反应条件的优化

在biotin-igg不同的稀释度下，2倍比稀释sa-hrp，作吸光度与biotin-igg和sa-hrp稀释度的关系图(图3)，其中，c0为sa-hrp储备液浓度（2 mg/l），c为2倍比稀释sa-hrp浓度。再将不同稀释倍数的biotin-igg与sa-hrp反应的时间作图（图4），在50 min 后，反应均达到平衡，考虑到吸光度的大小及反应的完全性对分析结果的影响。实验的最佳条件：biotin-igg的稀释度为3500倍(0.29 mg/l)，sa-hrp的浓度为1.0 mg/l，与sa-hrp的反应时间50 min。

图3 不同稀释倍数biotin-igg与sa-hrp（2倍比稀释）反应曲线图（略）

fig.3 two-time serial dilution curve of streptravidin-horseradish peroxide(sa-hrp) in biotin-avidin mediated competitive enzyme-linked immunosorbent assay(ba-elisa) with primary concentration of 2 mg/l at different dilutions of biotin-lgg

c0：sa-hrp 2 mg/l， c：2倍比稀释sa-hrp（two-time serial dilution）； ketamine-bsa：2 mg/l； 抗体(antibody)： 10.2 mg/l； biotin-igg：（■）1∶3500，()1∶5000，()1∶7000 diluted(起始浓度(primary concentration)：1000 mg/l）。

图4 不同稀释倍数的biotin-igg与sa-hrp反应的时间关系图（略）

fig.4 time curves of serially diluted biotin-lgg reacting with sa-hrp in elisa

ketamine-bsa：2 mg/l；抗体(antibody)：10.2 mg/l；biotin-lgg：（■）1∶3500，()1∶5000 and ()1∶7000 diluted（起始浓度(primary concentration):1000 mg/l）。

3.5 方法的线性范围和检出限

以lg(c0/c)为横坐标(c0和c分别为氯胺酮的储备液和工作溶液浓度)、吸光度值a为纵坐标进行线性拟合。当氯胺酮的浓度在0.1~1000 μg/l的范围时，线性回归方程为a=0.1844+0.0298lg(c0/c)，r=0.9956。检出限为0.03 μg/l（s/n=3）。

3.6 方法的重现性与特异性

对5批样品进行5次重复测定，批内和批间的rsd分别为1.61%~3.10%和3.62%~8.33%。以去甲氯胺酮、吗啡和可卡因为交叉反应物，采用50%替代法测定本方法的特异性。从表1中可知，吗啡和可卡因的交叉反应率均小于1%；去甲氯胺酮约为10%，表明本方法的特异性良好。

3.7 氯胺酮生物样品的测定

取冰冻健康人血清和尿液样品，分别加入0.9， 9和90 μg/l的氯胺酮，测定结果见表2。回收率在94%~102%之间，rsd为1.31%~8.46%。

表1 抗体与氯胺酮、去甲氯胺酮、可卡因和吗啡的交叉反应率（略）

table 1 cross-reaction of ketamine，norketamine，morphine and cocaine

表2 氯胺酮在血清和尿液样品中的回收率（略）

table 2 recovery of ketamine in the serum and urine samples

： mean±sd．

3.8 酶标二抗elisa法测定氯胺酮

以某公司生产的氯胺酮单克隆抗体为对照，采用酶标二抗体系elisa方法对氯胺酮进行测定。其工作曲线方程为a=0.1304+0.0716lg(c0/c)(c0和c分别为氯胺酮储备液和工作溶液浓度， r=0.9936，n=5)，线性范围为1～10000 μg/l，检出限为0.18 μg/l(s/n=3)。

由于生物素-亲和素之间的结合力极强(亲和常数高达1015 l/mol)，且一个亲合素分子上可以标记多个酶分子，因而采用放大体系可以提高elisa的灵敏度[10]。实验结果表明，ba-elisa法比酶标二抗体系elisa法的线性范围向低浓度扩展一个数量级，检出限更低，本方法具有潜在的应用前景。

【参考文献】

1 zheng ji-wang(郑继旺)，liu zhi-min(刘志民).chin.j.drug depend(中国药物依赖性杂志)，2001，10(1)：64~66

2 niedorf f，bohr h h，kietzmann m.j.chromatogr.b， 2003，791(1-2)：421~426

3 wu c h，huang m h，wang s m，lin c c，liu r h.j.chromatogr.a，2007，1157（1-2）：336~351

4 li guan-bin(李关宾)，lin xiu-li(林秀丽)，zhu chen-fu(主沉浮)，wu pei(吴 培).chinese j.anal.chem.(分析化学)， 2000，28(10)：1287~1290

5 jiang hui-juan(蒋慧娟)，chen liang(陈 亮)，sun yang(孙 洋)，xu qiang(徐 强)，chen ting(陈 婷).chinese j.anal.chem.(分析化学)，2008，36(9)：1238~1240

6 tan m e c，moy h y，lui c p，lee t k.forensic sci.int.， 2003，136（supplement 1）：305

7 gong y h，xue g p，bradshaw j s，lee m l，lee h k. j.heterocyclic chem.，2001，38(6)：1317~1321

生物素范文第6篇

苏轼有诗：“竹外桃花三两枝，春江水暖鸭先知。”崔护也云：“去年今日此门中，人面桃花相映红。”令人浮想联翩。可是，诗人只看到了桃花的外在美，却不知它“深刻的内涵”。

桃花味苦性平，具有利水、祛痰、活血、通便的作用。孙思邈的《千金方》中就有“桃花渍酒服之，好颜色，治百病，三月三日收”的说法。此外，桃叶能祛风除湿、清热解毒、杀虫消炎，树胶能生津止渴、益气和血，果实则有生津润肠、活血消积、益颜色、解劳热的功效，桃仁更是常用的活血祛瘀良药(桃仁有毒，不可生吃)，就连根皮，都有止血、消炎、解毒的作用，可谓全身是宝。

桃树的药用，民间积累了不少验方，如以桃仁20枚，去掉外皮与尖后，与藕一块同煮服食，治疗妇女产后血闭，再如将桃根皮加入红糖少许，共捣烂后外敷，治疗骨髓炎，不一而足。《本草纲目》中也有“治五痔作痛，桃根水煎汁浸洗之”的验方。

总之，桃树不但在莺飞草长的春天以其独有的风韵与百花争艳，同时也是人类健康的好伙伴。

应用推荐：

治糖尿病：桃胶50克，以温水洗净，加水煮沸，用盐水少许调味服用。

治经闭腹痛：桃仁9克、丹皮6克、红花3克，以酒水合煎，一日2次。

治阴道滴虫：桃叶50克，加水1000毫升，煮沸30分钟左右，滤取煎液，冲洗，每日1次。

美容：鲜桃花200克装瓶，加白芷30克，白酒500克，密封存放1个月，取之每日饮用或搽面。

灭虱：桃叶及嫩枝适量，煎浓汁去渣，喷洒衣物。

生物素：万能“配角”

对于生物学史来说，1936年是个值得铭记的日子。这一年，德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中分离提取出一种结晶物质――生物素。

生物素又叫维生素H、辅酶R，广泛存在于自然界的各种生物中，是人类和动物维持健康不可或缺的要素，无法经由人工合成。生物素是合成维生素C的必要物质，也是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，同时参与维生素B12、叶酸、泛酸的代谢，促进尿素合成与排泄，提升维他命B群的利用，促进汗腺、神经组织、骨髓、男性性腺的健康，是名副其实的万能“配角”。

生物素在食物中分布很广，且人体每天只需要100-300微克，所以人们一般不缺乏。不过，生物素在人体内仅停留3-6小时，所以必须每天补充。此外，生鸡蛋清中有一种蛋白质能和生物素结合，结合后的生物索不能由消化道吸收，造成生物素缺乏，此时就会出现食欲不振、舌炎、皮屑性皮炎、毛发脱落、少年白发、抑郁失眠、肌肉疼痛等。值得庆幸的是，目前尚未出现人类生物素缺乏的病例。

适用人群：

1.好吃生鸡蛋和饮酒的人需要补充。

2.服用抗生素或磺胺药剂的人每天至少要摄取25微克。

3.头发稀疏的男性摄入生物素，防脱发效果明显。

佳春佳品：蜜糖蒸萝卜

暖风徐徐，阳光普照，正是踏青的好时节。和公婆约好，周末一家人去郊区。

郊区的空气真好，透着新雨后的青草香。兴奋的女儿脱下外套，在镜头前摆出各种pose。我怕她感冒了，一遍遍地喊她穿上外套。谁知，一向信奉“捂春”的婆婆却说：“不要紧，让她玩去吧。”原来，她老人家早有准备，带来了蜜糖蒸萝卜。

生物素范文第7篇

关键词：免疫组化；二步法；三步法

免疫组化技术就是通过已知的特异性抗体和抗原的特异性结合，来对细胞或者组织内某物质性质进行检测，同时通过酶作用于底物所产生的颜色反应来对物质在细胞内的分布情况进行显示[1]。随着免疫酶标技术的发展，免疫组化技术也得到了快速的发展和完善，在临床诊断和科研中免疫组化技术的应用也越来越广泛。本研究选择C-MET作为目的指标，对免疫组化二步法和三步法在C-MET检测中的差异进行了观察，分析了两组方法在实际使用中的差异。

1资料与方法

1.1一般资料 选择胃癌常规石蜡标本。选择C-MET兔抗人多克隆抗体，胞浆着色表示阳性。二步法PV-9000试剂盒和三步法SP超敏试剂盒分别选购于两个不同生产厂家。

1.2方法 选择已知为阳性的乳腺癌组织作为阳性对照，选择PBS替代一抗作为阴性对照。DAB显色，严格按照相关的说明书来进行染色。三步法的具体操作如下：①对石蜡切片进行常规脱蜡直到水化，利用PBS对其进行3次冲洗，冲洗时间为3 min/次；②利用EDTA缓冲液进行浸泡，进行2 min的高压修复，暴露抗体；③切片加入150 Ll过氧化酶阻断溶液，在室温下进行10 min孵育，从而来讲内源性过氧化物酶活性阻断。采用PBS进行3次冲洗，冲洗时间为3 min/次；④将PBS液去除，每张切片加正常非免疫动物血清150Ll，在室温下进行10 min孵育；⑤将血清去除，每张切片加入第一抗体150 Ll；⑥采用PBS冲洗3次，冲洗时间为3 min/次，之后将PBS液去除，每张切片加入生物标记的第二抗体150 Ll，在室温下进行10 min孵育，之后利用PBS冲洗3次，冲洗时间为3 min/次；⑦将PBS液除去，每张切片加入链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液150 Ll，在室温下进行10 min孵育，之后利用PBS冲洗3次，冲洗时间为3 min/次；⑧将PBS去除，每张切片加入新鲜配置的DAB600Ll，在显微镜下进行3～10 min的观察；⑨采用自来水进行冲洗，苏木素复染，自来水冲洗反篮或者在冲洗之后利用PBS快速反蓝；⑩采用梯度酒精进行脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶进行封固。

二步法和三步法相比，4～7的操作不同，二步法不采用正常血清进行封闭，直接加入第一抗体过夜，之后加入特异性二抗，其余操作步骤则和三步法相同。

1.3统计学方法 将数据纳入SPSS 19.0统计软件中进行分析，计数资料比较采用χ2比较，以率（%）表示，若（P

2结果

与二步法相比，三步法制片结果的阳性率和背景低，非特异性着色小，结果比较明确易读；而与三步法相比较，二步法的操作更加简单方便，检查阳性率和阳性强度更高。

3讨论

二步法也被称之为非生物素酶法，二步法中的第二抗体是将特异性抗体和辣根过氧化物酶利用多聚糖骨架连接成多聚体[2]。通过PV系列二步法免疫组化检测试剂，在氨基酸骨架上将二抗抗体分子和酶聚合在一起，形成一种多聚体，从而来代替传统方法中的三抗和二抗，让抗原和抗体的结合信号得到有效放大，防止再次采用生物素，之后在利用DAB呈色反应来对抗原表达部位进行观察。

三步法也被称之为生物素酶法，实验室采用的SP超敏试剂盒主要是利用链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶链接系统来进行设计的。利用生物素对第二抗体进行标记；选择从链霉菌中分离出的蛋白质作为链霉菌抗生物素蛋白，这种蛋白质的分子量为60KD，包含有亚基4个，每一个亚基都具有和生物素进行相连的部位，而且亚基和生物素之间的亲和力比较强。链霉菌抗生物素蛋白和过氧化物酶形成链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合体；生物素化的第二抗体和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合体，利用DAB呈色反应能将抗原抗体的结合部位有效显示出来[3]。

本研究结果发现，与二步法相比，三步法制片结果的阳性率和背景低，非特异性着色小，结果比较明确易读；而与三步法相比较，二步法的操作更加简单方便，检查阳性率和阳性强度更高。免疫组化三步法染色的非特异性着色率低于二步法，主要原因是三步法在加入一抗之前，采用血清封闭将内源性杂质去掉，从而对染色非特异性着色率产生了干扰，而PV二步法则没有这一步骤，所以免疫组化三步法染色的非特异性着色率更低。二步法的灵敏度更高，第一抗体在4e环境下过夜背景更容易着色，所以三步法的假阳性率比二步法低，因此实验室在对C-MET阳性率表达率进行研究检测时，可以选择采用三步法来有效防止误差。但是三步法的时间更长，步骤较多，对操作人员也有比较高的要求，不容易检测出阳性表达率不高的患者，而二步法则具有较高的灵敏度，漏诊的几率不大，没有内源性生物素的影响，DAB显色比较快，所以在临床诊断时可以选择二步法来进行，这样能更快得出诊断结果。

本研究主要针对的是胃癌上一抗为C-MET时的结果，对于其他检测指标，二步法和三步法是否也存在差异还需要进一步的分析和探讨。

参考文献：

[1]盖文君，姚宏.免疫组织化学染色技术SP三步法与PV二步法比较探讨[J].山西医药杂志，2013，05.

[2]朱淑玲，杨清绪，赵文丽.两种免疫组织化学方法结果比较[J].中国医药指南，2010，08：29-30.

生物素范文第8篇

1.病例介绍

患儿女，4个月，因咳嗽1个月，气促3天于2016年6月19日入院。患儿入院前1个月无明显诱因出现咳嗽，咳少，家属未介意，人院前3天咳嗽加重，喉有痰响，并出现气促，吸奶少，伴低热，无呕吐、腹泻、抽搐、昏迷等，病情加重后于6月16日到当地县医院住院，诊断为“支气管肺炎、脓毒症、代谢性酸中毒”，治疗3天后病情无好转而转来我院。系GIPl，足月顺产，出生时无窒息抢救史，出生体重2，8kg。生后母乳喂养，3月龄开始添加米糊。生长发育迟缓，4月龄不能抬头。父母体健，非近亲婚配。查体：T 38.0℃，P 160次/分，R 56次/分，身长60cm，体重4 kg。营养差，反应差，皮肤黏膜苍白，左侧面颊皮肤见红色斑丘疹，局部皮肤粗糙、脱皮，口唇青紫，肢端暖。头颅五官无畸形，无特殊外貌，颈软，三凹征阳性，双肺呼吸音粗，闻及散在细湿罗音和哮鸣音。心音有力，律齐，无杂音。腹不胀，肝脾肋下未触及，肠鸣音正常。四肢肌张力低下。人院后查血气分析：pH 6.916、PO257.8、PCO，32.3、SB-26.1。血常规：WBC 20.1×10/L、N 63.6%、L 26.1%、RBC3.86×10/L、Hbl04g/L、HCT 30.3、PLT 375x 10/L、超敏CRP>5.0 mg/L。尿酮体阳性。血乳酸7.9mmol/L。肝功能、肾功能正常。电解质：K 3.8mmol/L、Na 147 mmol/L、Cl 110 mmol/L、Ca 2.19mmol/L。床边胸片：肺部感染。

人院诊断为“1.重症肺炎并呼吸衰竭，2.脓毒症，3.代谢性酸中毒，4.营养不良，5.湿疹”，人院后予机械通气辅助呼吸、美罗培南抗感染、纠酸、激素消炎、鼻饲配方奶等治疗。治疗后病情渐好转，但代谢性酸中毒不易纠正，每天予5%碳酸氢钠20-40 ml治疗，4天后血气才渐恢复正常，6月23日顺利脱离呼吸机。因患儿有严重代谢性酸中毒、生长发育落后，考虑合并有遗传代谢性疾病，6月23日予干血滤纸片查串联质谱和尿液气相质谱检查。串联质谱（氨基酸和酰基肉碱谱分析报告）：丙氨酸630.47（50.00-400.00）umol/L、3-羟基异戊酸肉碱5.63（0.05-0.70）umo]/L。气相质谱：乳酸55.7（0-13.0）umol/L、丙酮酸113.6（0-30.00）Ixmol/L、3-羟基丁酸185.4（0-9.0）umol/L、2-酮-异戊酸1.4（0-0.3）umol/L、乙酰乙酸14.1（0-1.5）umol/L、2-酮-异己酸2.9（0-0.8）umol/L、2-羟基丁酸6.2（0-2.0）umol/L、3-羟基丙酸7.5（0-4.0）umol/L、3-羟基-异戊酸34.4（0-4.0）umol/L。串联质谱和气相质谱检查回报后考虑有多种羧化酶缺陷症（multiple carboxylase deficiency，MCD）可能性大，行相关基因检查，在治疗肺炎的同时予生物素30 mg/d治疗，患儿病情明显好转，呼吸道症状及体征消失，面部皮疹减少，于2016年7月1日出院。

出院半个月后基因检查回报，患儿生物素酶缺乏症（biotinidase deficiency，BTD）基因测序结果：阴性，未检测到致病的基因突变。全羧化酶合成酶缺乏症（holocarbexylase synthetase，HLCS）基因测序结果：阳性，检测到致病性的基因突变，携带c，1522C>T（R508W）纯合子突变。患焊盖HLCS基因测序结果：检测到特定位点的基因突变，携带c.1522C>T（R508W）杂合突变。母亲HLCS基因测序结果：检测到特定位点的基因突变，携带c.1522C>T（R508W）杂合突变。修正诊断为“1.全羧化酶合成酶缺乏症，2.重症肺炎”。出院后继续口服生物素30 mg/d治疗，一个月后随访患儿一般情况好，皮疹消退，体重增长至5 kg，5月龄能抬头。

2.讨论

多种羧化酶缺乏症（MCD）是常染色体隐性遗传的单基因疾病，是一种少见的、生物素代谢相关的有机酸血症。根据缺陷酶的不同，MCD分为生物素酶缺陷（BTD）和全羧化酶合成酶缺陷（HLCSD）两类，BTD的发病率约为1/61 067，HLCSD发病率更为罕见，日本曾报道HLCSD的发病率约为1/100000，我国对于该病的发病率尚无报道。HLCSD患儿由于全羧化酶合成酶活性下降，不能催化生物素与生物素依赖的羧化酶（乙酰CoA羧化酶、丙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶及3-甲基巴豆酰CoA羧化酶）的结合，两种酶缺乏均可影响生物素依赖的羧化酶的活性，使脂肪酸合成、糖原异生及氨基酸的分解代谢发生障碍，乳酸、3-羟基异戊酸、3-甲基巴豆酰甘氨酸、甲基枸橼酸及3-羟基丙酸等异常代谢产物在体内蓄积，出现不同程度的临床症状。HLCSD发病一般较早，患儿多在新生儿、婴儿期发病，临床可表现为神经系统、皮肤、呼吸系统、消化系统和免疫系统等多个系统的损害，无特异性，极易误诊和漏诊。

本例患儿于婴儿期发病，以咳嗽、气促为首发症状，伴面部湿疹，入院后检查发现生长发育落后、四肢肌张力下降、严重代谢性酸中毒，开始诊断为重症肺炎、脓毒症，在治疗过程中因难治的代谢性酸中毒才考虑有遗传代谢性疾病。经串联质谱、气相质谱检测和基因分析，最后确诊为HLCS。

患儿HLCSD基因突变分析示携带c.1522C>T（R508W）纯合子突变。患儿的两个等位基因均存在HCS基因突变，父母携带致病突变。有学者报道R508W突变是我国人群中常见的突变。基因诊断提示患儿父母每次生育子女均有25%的可能成为该病患者，如要生育第二胎，应做产前诊断，可通过羊水基因突变分析进行产前诊断。

生物素范文第9篇

关键词：鸡新城疫病毒（NDV）；量子点；双抗夹心荧光免疫分析（sFLISA）

中图分类号：S858.31文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）05-0118-04

新城疫是由新城疫病毒（Newcastal disease virus，NDV）引起的急性、高度接触性传染病，常呈败血症，主要特征是呼吸困难、下痢、神经机能紊乱、黏膜和浆膜出血，严重危及禽类养殖业的发展，现流行于世界各国[1～3]。新城疫被国际兽疫局（OIE）定为A类传染病，中国将其列为一类动物疫病[4]。

新城疫病毒的检测主要应用免疫方法（包括免疫传感技术、蛋白质芯片技术、胶体金免疫层析技术、免疫组化技术、免疫荧光技术等）和分子生物学技术（包括RT-PCR技术、基因芯片、液相芯片技术等）[5]。量子点（Quantum dots，QDs）是近年发展起来的一种新型荧光纳米材料，与传统有机荧光染料相比，具有荧光稳定性高、吸收光谱宽、发射光谱窄而对称、衰减寿命长、生物相容性好等特点，已经成为病原检测的新工具[6～9]。

本研究以抗NDV多克隆抗体为捕捉抗体，以生物素标记抗NDV单克隆抗体为检测抗体，以量子点标记的链霉亲和素为荧光探针，建立了NDV sFLISA检测方法，为养殖业早期发现NDV感染提供了有力的工具。

1材料与方法

1.1试验材料

灭活新城疫病毒（NDV，HA效价为256）和阳性尿囊液病毒由本试验室保存。鸡产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、鸡新城疫病毒（La Sota株）国家参考品、抗鸡新城疫病毒阳性血清和鸡新城疫试验用阴性血清购自国家兽医微生物菌种保藏中心。

1.2主要试剂和抗体

兔抗NDV多克隆抗体（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；鼠抗NDV单克隆抗体（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；量子点标记的链霉亲和素-605（QS605，武汉珈源量子点技术开发有限公司）；包被液：0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.6）；洗涤液：0.5% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS）；封闭液：1× BSA-PBS。

1.3主要仪器和器材

多功能荧光酶标仪（SpectraMax M5）；6930型冷冻离心机（日本KUBOTA公司）；5415R 微量冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；MS3涡流旋转振荡仪（德国IKA公司）；黑色底透的荧光酶标板（Thermofisher NUNC）；Eppendorf移液枪（0～200 μL、0～1000 μL，德国Eppendorf 公司）；冰箱[冷藏温度（4±1）℃，中国海尔]；恒温培养箱[（37±1）℃、（42±1）℃，日本SANYO]。

1.4尿囊液病毒的制备

4℃反复冻融尿囊液3次，然后3 000、5 000、8 000 r/min 各离心30 min，上清经100 000×g离心2 h，用少量 TEN 缓冲液将病毒沉淀悬浮，再用20%～60%的蔗糖溶液经密度梯度离心纯化，经100 000×g 离心8 h，收集40%～60%梯度层内的病毒带，用pH 7.4、0.01 mol/L PBS 透析48 h，分装，于-20℃冻存备用。

1.5 sFLISA标准操作程序

sFLISA在NUNC酶标板反应微孔中完成，具体实验方法如图1所示。微孔板先用100 μL含有1.25 μg/mL的抗NDV多克隆抗体在4 ℃包被过夜（包被液：0.05 mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液）；洗涤液洗涤3次，200 μL/孔，每次3 min；用1×BSA-PBS封闭，300 μL/孔，37℃ 封闭2 h；洗涤液洗板3次后，加入待测样品，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入1∶200稀释的生物素标记NDV单克隆抗体，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入量子点标记的链霉亲和素荧光探针，37℃孵育1 h，洗板后晾干。阴性对照孔加阴性血清，空白对照孔加入100 μL PBS，通过荧光分光光度计测定其相对荧光强度。

1.6sFLISA工作条件的优化

1.6.1多抗包被浓度、生物素标记单克隆抗体稀释度的确定抗NDV多克隆抗体以10、5、2.5、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL等5个稀释浓度各100 μL竖排包被聚苯乙烯板，4℃过夜；洗涤封闭后加入标准抗原NDV，100 μL/孔，固定标准抗原NDV浓度；洗涤拍干，生物素标记抗NDV单克隆抗体以1∶200、1∶400、1∶800共3个稀释浓度各100 μL反应，37℃作用1 h；洗涤拍干，加入1∶100稀释的量子点标记的链霉亲和素，37℃作用1 h，洗涤拍干后在多功能酶标仪上用390 nm的激发波长、605 nm的发射波长读取相对荧光强度（RFU）值。根据P/N比值，以确定包被抗体和生物素标记抗体的最佳浓度。

1.6.2量子点标记的链霉亲和素稀释倍数的优化以NDV包被酶标板，生物素标记抗体按1∶200稀释作为检测抗体，量子点标记的链霉亲和素分别按照1∶50、1∶100、1∶200稀释，100 μL/孔加入，37 ℃作用1 h，洗涤拍干后在多功能酶标仪上用390 nm的激发波长、605 nm的发射波长读取相对荧光强度（RFU）值。根据P/N比值，以确定量子点标记的链霉亲和素稀释倍数。

1.7阴阳性判定标准的确定

采用建立的sFLISA方法进行12次阴性对照检测，计算相对荧光单位RFU的平均值（X）和标准差（SD），阳性临界值=阴性样品的X+3SD。检测时，当样品RFU>阳性临界值，判断为阳性。

1.8sFLISA敏感度检测

确定单抗和多抗的最佳工作浓度，将纯化的尿囊液病毒在1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280等8个稀释度进行测定，同时进行原倍毒液试验，设阴性和空白对照。

1.9sFLISA特异性试验

用建立的检测方法对NDV、鸡产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、鸡新城疫病毒（La Sota株）国家参考品进行检测，确定所建立检测方法的特异性。

1.10重复性试验

在同一个酶标板内检测NDV、NDV国家标准品和尿囊液制备的NDV，每样重复3次；选取3块不同酶标板，每个板重复3孔，按1.5的步骤进行sFLISA，分别计算样品的板内和板间变异系数（CV）。

1.11阻断试验

将阳性NDV用灭菌生理盐水按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀释后，50 μL分别加入等量的标准阳性血清（1∶10稀释），37℃作用1 h，10 000 r/min离心，取上清进行检测，以NDV为阳性对照。

2结果与分析

2.1包被多克隆抗体与生物素标记抗体稀释度的确定

包被抗体分别以10、5、2.5、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL进行包被，生物素标记抗体分别进行1∶200、1∶400、1∶800的稀释，量子点标记的链霉亲和素以1∶100的稀释度进行偶联。结果表明，包被抗体单抗为1.25 μg/mL，生物素标记的检测抗体1∶200时，其P/N值最大，为56.028。因此，选择1.25 μg/mL作为包被抗体的浓度，1∶200 作为生物素标记抗体的最佳稀释度（见表1）。

2.2量子点标记的链霉亲和素稀释倍数优化

以上述优化的条件，即包被抗体浓度为1.25 μg/mL，生物素标记的检测抗体稀释倍数为1∶200，对量子点标记的链霉亲和素稀释倍数进行优化。结果（表2）表明，在1∶100时，P/N值为61.453，最大，故选择此稀释倍数为最优稀释倍数。

2.3 sFLISA阴阳性界限的确定

在上述优化的反应参数条件下，进行12次阴性血清sFLISA试验，得到阴性试验平均值为0.361，标准差为0.037，X+3SD =0.472，从而确定RFU 值在0.472及以上为阳性，RFU值在0.361～0.471之间为疑似，RFU值在0.361以下为阴性（表3）。

2.4 敏感性分析

将制备好的尿囊液NDV以1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280等8个稀释度稀释，按照优化sFLSA的条件检测结果表明，随着病毒含量的降低，其RFU 值呈下降趋势，但当病毒1∶640 稀释时，结果仍为阳性（RFU值为0.725），表明该方法灵敏度较好。

2.5 特异性试验

在已优化的sFLISA反应条件的基础上，对鸡产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、鸡新城疫病毒（La Sota株）国家参考品进行了检测，结果只有鸡新城疫病毒（La Sota株）国家参考品为阳性，其它病毒均为阴性，表明本方法具有较好的特异性（表5）。

2.6重复性试验

在同一酶标板内，对NDV、NDV国家标准品和尿囊液制备的病毒进行板内重复性试验，每份样品重复3次。重复性分析结果显示：板内变异系数为1.5%～4.1%，板间变异系数为1.5%～3.0%（表6），变异程度很小，均小于10%，表明该方法具有较好的重复性。

2.7阻断试验

结果表明（表7），经稀释的NDV作为被检材料，标准阳性血清能特异性地阻断NDV与包被抗体的结合，病毒1∶40稀释后检测结果呈阴性。

量子点作为一种新型的荧光探针，被越来越多地应用到病原生物检测中[8]，但应用于动物病毒检测的研究较少。本研究应用量子点标记的链霉亲和素作为荧光探针、生物素标记单克隆抗体作为检测抗体，通过生物素-亲和素之间的特异性互作，建立了一种基于量子点荧光探针的NDV sFLISA检测方法。通过对已知阳性样品的比较测定，阳性样品稀释至640倍还能检出；与其它有关禽类病毒无交叉反应（产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原），说明此检测方法对NDV特异性较强，灵敏度高。该方法的建立为NDV的监测和诊断提供了新方法，在进出口检疫上也将发挥良好的作用。

参考文献：

[1]包红梅， 田国彬， 陈化兰，等. 禽流感的诊断技术与防制措施[J]. 中国兽医科技， 2003（33）：75-79.

[2]陈创， 陈良冬， 张志凌，等. 量子点在肿瘤标志物研究中的应用进展[J]. 中国癌症杂志， 2007（17）：813-818.

[3]魏祥法， 刘辉， 井庆川，等. 抗鸡新城疫、传染性法氏囊病免疫球蛋白的研究[J]. 山东农业科学， 2007（2）：97-98.

[4]陈宏伟， 刘红莉， 王一理，等. 量子点：新的荧光标记物质[J]. 中华病理学杂志， 2005，34（1）：47-49.

[5]杜景娇， 薛强， 邹明强，等. 新城疫检测技术的研究新进展[J]. 中国畜牧兽医， 2012， 39（2）： 187-191.

[6]Murphy C J. Optical sensing with quantum dots[J]. Analytical Chemistry， 2002， 74： 520-526.

[7]Niemeyer C M. Nanoparticles， proteins， and nucleic acids： biotechnology meets materials science[J]. Angew.Chem .Int. Edn. Eng.，2001， 40： 4128-4158.

[8]Alivisatos P. The use of nanocrystals in biological detection[J]. Nature Biotechnol.， 2004， 22（1）： 47-52.

[9]Akerman M E， Chan W C W， Laakkonen P， et al. Nanocrystal targeting in vivo[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2002， 99（20）： 12617-12621.

生物素范文第10篇

[关键词]双重免疫组化染色法；鼻咽癌；P53；细胞角蛋白

[中图分类号]739．6

[文献标识码]A

[文章编号] 1673-755512007]02-5-02

双重染色法是在一张切片上做两种不同染色的方法，如免疫组化和免疫组化、免疫组化和原位杂交、免疫组化和特殊染色等。其中双重免疫组化染色是在同一张切片上显示两种不同抗原的免疫组化染色方法，这种方法可以了解不同细胞、组织之间的相互关系，甚至可以了解同一种细胞内抗原之间的相互关系。本实验运用双重免疫组化染色法，在一张切片上同时显示鼻咽部低分化鳞癌组织P53与细胞角蛋白(cytokeratin，CK)，用以观察CK阳性的癌细胞是否同时表达P53。

1材料和方法

1．1材料50例鼻咽部低分化鳞癌组织，选自郑州大学三附院病理科2004年1月～2006年1月标本。

1．2方法

1．2．1 P53单克隆抗体，CK多克隆抗体，双重免疫组化染色试剂盒，均为美国Maxim公司产品。预实验中将同一组织连续切片4张，分别先后进行P53、CK染色，其中每种染色都分别使用不同的显色方法，如链霉菌抗生物素―碱性磷酸酶，用5―溴-4-氯―3吲哚磷酸盐／氯化硝基四氮唑蓝(BCIP／NBT)显色，呈紫黑色；而链霉菌抗生物素―过氧化物酶，则用3―氨基-9-乙基卡唑(AEC)显色，呈橙红色；最后根据着色情况，将着色深的P53(BCIP／NBT显色)定为首先显色的一抗。

1．2．2双重染色过程(1)石蜡切片脱蜡水化；(2)过氧化酶阻断溶液10min，PBS洗；(3)非免疫性动物血清10min，PBS洗；(4)一抗PCNA 60min，PBS洗；(5)生物素标记的二抗10min，PBS洗；(6)链霉菌抗生物素―碱性磷酸酶溶液10min，PBS洗；(7)BCIP／NBT，显微镜下观察10～30min，阳性显色为紫黑色,PBS洗；(8)双染增强液10min，PBS洗；(9)重复(3)；(10)一抗GFAP 60min，PBS洗；(11)重复(5)；(12)链霉菌抗生物素―过氧化物酶溶液10min，PBS洗；(13)新鲜配制的AEC显微镜下观察5～10min，阳性显色为橙红色；(14)自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，水性封片剂封片，显微镜观察。

2结果

鼻咽部低分化鳞癌组织胞核着紫黑色为P53阳性，胞浆着橙红色为CK阳性，双标记阳性者同一细胞中核呈紫黑色，胞浆呈橙红色，即P53与CK同时表达，50例标本均有不同数量的双标记阳性细胞。

3讨论

3．1免疫组化双重染色法，提供了纯亲和力的生物素化二抗，与链霉菌抗生物素―碱性磷酸酶及链霉菌抗生物素―过氧化物酶相结合。使用不同的一抗，因着色部位不同，不影响诊断。双染增强剂的应用也提高了第二次染色的敏感性和特异性，并可明显降低背景着色。

3．2在选择双重染色的一抗时，应避免两种一抗的定位(胞核、胞浆、胞膜)重复，如两者都是在胞浆或胞膜上显色，结果后一种显色会将前一种显色覆盖，实验结果不能区分。

3．3所选的两种一抗的预处理方法(高温抗原修复、酶消化等)应完全相同，以保证两种抗原都得到良好的暴露。我们在预实验中尝试了PCNA和CK的双重染色，由于CK需要高温修复，而PCNA不需要，实验无法继续。本实验的P53和CK均需高温修复，实验结果理想。

3．4双染要注意显色方法的合理搭配，双重染色中显色系统的选择应注意染色对比度，选择两种颜色差别明显的显色剂，以利于观察。P53用BCIP/NBT显色，阳性为胞核紫黑色；CK用AEC显色，阳性为胞浆橙红色，对比明显，容易判断。

3．5在进行双重染色之前，必须首先做单独染色的预实验。其实验条件必须与双染时的条件相同，观察实验结果，抗体定位正确后，再确定2种抗体使用的顺序，进行双染实验。我们在预实验中，分别用一种染色，二种底物显色进行对比。如先显示AEC,AEC经BCIP／NBT作用后可转变为灰黑色，易与BCIP／NBT的紫黑色产物相混淆，降低对比度。而即使第二种显色时用AEC，它也会去掉BC IP／NBT的部分染色，严重时会全部去掉，所以我们将易着BCIP/NBT显色并着色较深的P53首先显色，着色较浅的CK其后显色。而且BCIP／NBT显色一定要充分，时间可在30rain，因为第一重染色后的显色经过酸性增强液的作用和反复冲洗后会变淡。