时间：2023-11-13 11:18:18
人类起源及早期迁徙扩散是一个有趣而复杂的问题。目前有走出非洲和多区域起源两种理论来解释人类现在的分布格局。任何物种都有扩散和占领新领地的过程，人类扩散在史前时代就开始了。在全球一体化的今天，人类的迁徙更是迅猛和多样。若要研究特定地区常住族群遗传结构，一方面要借助家谱和史料，另一方面借助考古和遗传学分析来构筑模拟。遗传学分析的理论基础就是现代演化生物学中的溯祖理论和分子钟理论。本书是这方面最新进展的一个汇总。
本书内容分为三大部分，包括基础理论，各大洲族群的研究实例，最后是总结和回顾。本书共有26章：1.导言：人类迁徙展望；2.现代人类起源和散布的遗传学证据。第1部分 理论，含第3-7章：3.人类迁徙的生物学：类人猿无法做到？4.人类迁徙的演化基础；5.人类迁徙的演化结果：从遗传学、历史和考古学视角研究加勒比群岛和阿留申群岛人群的遗传结构；6.亲属结构化的迁徙和殖民；7.迁徙中的饮食与表观遗传学：遗传分化的分子机制。第2部分 迁徙的地理学，含第8-25章：8.非洲的迁徙和人群结构：考古学、语言学和遗传学数据的关联；9.北部非洲的人种迁徙；10.身份、语音、社区：堪萨斯州的新非洲裔移民；11.殖民时代墨西哥的非洲族群迁入：历史和生物学结局；12.人口扩张和文化交流：巴斯克族群的起源和迁徙；13.人口迁徙在罗马：用免疫球蛋白标记来研究人种遗传结构；14.迁徙、同化和混杂：苏格兰人遗传结构；15.门诺派教徒的迁徙：遗传和人口学结果；16.人口迁徙史：透过结核分枝杆菌种系地理分布来考察；17.青藏高原种群的形成：迁徙、基因和遗传适应；18.迁徙、全球化、非稳固族群的秘鲁中国裔；19.人口迁徙的“蓝色高速公路”：南太平洋群岛。20.西班牙殖民时代与现代的墨西哥种群结构；21.图皮人在亚马逊流域的扩张；22.迁徙和城镇化对秘鲁原住民的影响；23.巴西非洲裔的迁徙和乡村社区：历史、人口和遗传学数据的整合；24.契约化移民、基因流与印第安哥斯达黎加种群的形成；25.加勒比群岛和中美洲种族迁徙的原因和结局：完美的演化故事。第3部分，含第26章：26.人类为什么要迁徙？一个回顾。
Michael H.Crawford是堪萨斯大学人类学与遗传学系的教授，生物人类学实验室主任。Benjamin C.Campbell是威斯康星大学米尔沃基分校人类学系的副教授。2010年3月1-2日，两位主编在堪萨斯大学组织了人类迁徙国际会议，100多位国际学者参加了会议。本书是这次会议的论文集，在会议报告的基础上精心编著。
本书适合人类学、演化生物学、群体遗传学、考古学、古生物学、基础医学专业的学者和研究生。
关键词：学习技能；遗传学；布鲁姆；目标教学；创新驱动发展战略
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）33-0140-02
当前的生物学教学面临着两个问题，一是知识的不断积累使得讲授内容越来越多，对它们如何选择和怎样配置众说纷纭；二是该专业的学生相当一部分之后从事与生物学没有直接关系的工作，如何不让他们的学习活动看似无用让人焦灼。在不可能吸收所有知识以及不一定用得上的情况下，师生双方都开始看重教育的创新职能。大家的共识基本上是，教育要通过专业知识教学这个载体，最后达到提高学生的认知能力的目的。针对学生能力的提高，国内外在生物学教学方面进行了大量的探索，其中之一就是开展布鲁姆认知水平目标教学[1]。
本杰明・布鲁姆认为人的认知能力有六个水平，头两个水平即知道和理解代表着较低等的认知技能，第三个水平即应用处于过渡区间，而后三个水平即分析、综合和评价属于较高的认知层次。不管对于老师的授课还是学生的学习，应用布鲁姆体系都能明显地促进认知，特别是有益于复杂认知技能的提高[2]。然而如何进行布鲁姆评价有着很强的技术性。本人在湖南吉首大学已执教遗传学四年，从培养学生能力出发，在理论课和实验课中一定程度上践行了布鲁姆认知水平评价体系。
一、理论课中认知能力的培养
（一）建立问题体系
本人为理论课备课设定了两大任务，一是参阅多本教材以完善知识结构或者增加讲解素材，另一个就是根据布鲁姆认知层次体系设定问题。设定问题之前明确本堂课的核心内容，然后重温布鲁姆各个认知水平的定义特别是动作标签，最后精心设计出六个让学生回答的问题，当然它们分别对应于布鲁姆的六个认知层次。有时，既定的教学内容比较浅显单一，从而难以编制出代表不同水平的问题。这时，增加知识点从而使课堂讲授有更宏大的主题，有助于建立层次分明的评价体系。
（二）剖析科研论文
我们尝试让学生上台做遗传学方面知识的报告，发现他们的学习活动多半只是汇编资料，从应用到评价的能力基本上没有得到锻炼。为了引导学生向高水平认知能力攀升，理论课设置了论文剖析部分。以组为单位，学生首先按照自己的兴趣选取遗传学领域的研究性论文，然后课外时间对它进行研读，并做好课堂汇报文件。上课时，小组中一人单独或者多人接力上台讲解该论文，并剖析该论文的价值所在和不足之处。课堂时间充裕的话，还可以开展问答环节，进一步强化了教学效果。
（三）科学制定试卷
笔试时基本上采用客观题而尽量减少主观性评分，这样试卷中有很多的选择题，简答题也分成小而具体的得分点。分析2015年这样的期末考试后发现，在四十个单项选择题中，119个学生中90%以上答对的题目有13个，80%-90%答对的有8个，60%-80%答对的也有8个，40%-50%的有6个，而20%-40%的有5个。在下次考试中，较容易的题更可能被弃用，而对于错误率较高的题首先分清是试题表述不清还是相关知识点的确难懂，然后加以调整并继续运用。总之，保证试卷有一定的难度高低，从而促进认知能力的提高。我们还注意到，有一半的题目不管其难易程度，表现出了男女性之间的差异，并且是女学生的表现普遍较好。那么，这些性别差异性考题也需要认真调整。
二、实验课中认知能力的培养
在一个长达10年的入门生物学实验课程改革中[3]，人们比较了通常的一周一个主题的实验安排和新提出的两周甚至十四周一个主题的实验安排；结果发现，后两种实验安排中学生的能力提高更多，并且暗示实验主题越少学生的能力收益越大。在新的课程中，学生有更多可供支配的时间，并且受到鼓励独立自主地开展工作，另一方面老师要求学生在实验中提出问题、设计方案、展开调查和结果，这是学生能力得以提高的关键。然而，要达到这个目的，该课程中学生要先后完成一系列实验并最后得到一个明确的结论，即要采取一种作者形象地称之为“流”（stream）的形式。每个学生置身于同样的“流”，即运用相同的技术方法去开展研究。然而，他们各自着眼于不同的科学问题，如运用基因的克隆测序技术有的研究物种之间的亲缘关系而有的想进行亲子鉴定。其实，实验课程可以围绕一个科学问题而成形，并且各个项目之间是一种并联的关系；即每个实验从不同角度提供证据，任何一方面的结果均能一定程度上诠释主题。类似地，我们把这种向目标集中的实验安排叫做“汇”，而传统的各实验之间几无联系的安排类似“池”。为了探讨“汇”式实验教学与学生认知能力提高的关系，我们尝试了在实验中增设内部对照的策略。
在这个改革中，首先凸显了实验课程涉及的主题。多数生物的遗传物质是染色体及其DNA，并且许多物种的全基因组序列已被测定，所以本课程的所有实验项目分别设定为进行生物信息学分析、DNA分析和染色体分析。在生物信息学分析中，首先通过浏览基因组而说明基因位于哪个染色体的什么区域、正链还是负链编码、外显子-内含子边界、在群体中发现的变异、转录本的数目和差异、翻译出的氨基酸序列。然后，运用BLAST程序从多个物种中提取基因的近似序列，用CLUSTAL软件获得它们的多序列比对，最后在MEGA界面中完成基因树的构建。该主题的实验的一个明确指向就是重复基因的进化。染色体水平的所有实验都以大蒜为材料，步骤主要有材料的预处理、固定、解离、染色、压片以及最后的观察，该水平的实验旨在进一步认识细胞分裂和DNA复制的关系。DNA分析涉及细菌的液体培养、质粒提取、PCR以及电泳，争取深入理解基因型和表现型以及突变型与野生型等基本概念，并初步了解原核生物基因的转录和翻译以及操纵子调控。
设立实验的内部对照是“汇”式实验教学的一个变种。在进行生物信息学分析时，指定分析2到3个基因，它们属于一个基因家族，但位于基因树的不同分枝上，并且具有不同的功能。
我们的初步调查发现，仅仅到这里并写出一份实验报告几乎不能促进学生认知水平的跃升，其原因可能是一直到这里都没有明显的更高级的比如评价的活动环节。所以，为了确实保证这种形式能提高学生的认知水平，我们建立了评价和反馈体系。三个层次的实验最后产生三份实验报告，每份报告由该组的学生共同撰写，主要内容为实验结果和问题解答。每个层次的实验结束后，接下来的一次课用于评价实验报告，此时每个小组对其他组的每份报告指出至少一个不足之处并将意见写在报告末尾。对于意见，有时学生自己通过努力能够较好地解决，有时需要师生一起讨论从而找到思路。最后，每组的每个成员分别在报告之后简要指出整个实验学习中印象最深刻的环节。老师将给实验报告一个分数，但重要的是将实验报告与心得体会结合起来，根据布鲁姆认知水平体系去确定学生能力提高的状况。
三、结语
国内外的实验证明，布鲁姆的认知能力评价有助于提升学生的能力水平，在大学生物学教学中也能大展拳脚。为此，本人在遗传学教学中，一边竭力领会该理论和熟悉其手段，另一方面大胆提出措施并加以周密运用。为了进一步增强教学效果，本人还特别注意在其中贯彻其他的教学理念如同伴学习和形成性评价。然而，世界上没有两片完全相同的树叶，对于课堂也是如此，这给组织布鲁姆的认知能力目标教学特别是估计其教学效果带来了相当大的困难。不过，遗传学教学改革在不断进行[4，5]，相信将有更多教育教学工作者来为如何提升大学生的认知能力献计献策，从而推动世界的创新驱动发展。
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骨髓细胞形态学检查是一门具有百年悠久历史的血液病诊断技术，一百多年来一直都是使用瑞氏及其先驱者发明的涂片染色法，它是血液病理学重要的诊断工具。因为其制片的过程容易简单，能快速的对样品做出初步检查，即使在血液病检测手段与日俱进的今天，传统的骨髓细胞形态学检查仍然具有独一无二的魅力，它为现代血液病理诊断的发展奠定了基础。本文通过骨髓细胞形态学检查对其本身的不断完善进步，并结合其他现代血液病诊断技术，在MICM方法上对各种白血病的发病机理的研究现状作一综述。
一、血细胞的生成，发育规律及正常形态学特征
(一) 血细胞的生成
目前认为，所有血细胞均起源于共同的造血干细胞。造血干细胞是造血组织中一类目前尚无形态学特征描述的功能细胞。其功能特点为：①具有高度自我更新的能力；②具有多向分化的能力。
血细胞的生成过程可划分为三个连续的阶段，即造血干细胞，造血祖细胞和形态学上可辨认的各系原始幼稚细胞阶段，然后进一步成熟为具有特定功能的各系血细胞。
(二) 血细胞发育过程中形态学演变的一般规律
1、细胞大小及外形
(1)大小：从原始细胞到成熟细胞，胞体由大逐渐变小。但巨核细胞则与此相反。
(2)外形：红细胞系始终呈圆形，粒细胞和淋巴细胞系保持圆形或椭圆形不变；单核细胞系和巨核细胞系则均由圆形或椭圆形变为不规则形。
2、核质比例(N/C)胞核逐渐缩小(巨核细胞例外)，胞质量逐渐增多，由核大质少变为核小质多。
3、细胞核
(1) 大小：由大变小，巨核细胞的胞核则由小明显变大。
(2) 核形：幼红细胞胞核始终呈圆形，核逐渐缩小，核染质固缩，最后脱核而消失，成熟红细胞无细胞核；粒细胞系原始及早幼粒细胞阶段呈圆形或椭圆形，随着细胞成熟，胞核的一侧逐渐凹陷，最后形成分叶状。
(3)核位置：居中，常偏位，侧这边。
(4)核染色质：结构由细致疏松逐渐凝集变为紧密粗糙，着色则由浅变深。
(5)核膜：由不明显到明显。
(6)核仁：由清晰可见到消失。
4、细胞质
(1)胞质量：一般由少逐渐增多，淋巴细胞例外。
(2)着色。
(3)颗粒：多从无到有，从非特异性颗粒到特异性颗粒。
(4)空泡：正常情况下，浆细胞胞质中可见小空泡，其他细胞系列中一般无空泡，出现空泡多由于细胞退行性变。
二、常见血液病的形态学特征[1]
(一) 贫血
1.缺铁性贫血 是因体内贮存铁缺乏而使血红蛋白合成不足所致。
【血象】
(1)红细胞，血红蛋白均减少，以血红蛋白减少更为明显。
(2)轻度贫血时成熟红细胞的形态无明显异常。中度以上贫血才显示小细胞低色素性特征，红细胞体积减小，淡染，中央苍白区扩大。
(3)网织红细胞轻度增多或正常。
(4)白细胞计数和分类计数，以及血小板计数一般正常。
【骨髓象】
(1)骨髓增生明显活跃。
(2)红细胞系统增生活跃。
(3)贫血早期程度较轻时，幼红细胞形态无明显异常。中度以上贫血时，幼红细胞内血红蛋白合成不足，细胞体积减小，胞质量少。
(4)粒细胞系相对减少。
(5)巨核细胞正常。
2、再生障碍性贫血(AA)简称再障，是由于多种原因所致骨髓造血干细胞减少和(或)功能差异常及造血微环境损伤，导致红细胞，粒细胞和血小板生成减少的一组综合征。
(1)急性期：急性型再生障碍性贫血(AAA)又称重型再障I型(SAA-I)，起病急，发展迅速，常以严重出血和感染为主要表现。
【血象】呈全血细胞减少。①红细胞，血红蛋白显著减少，两者平行性下降，呈正常细胞正常色素性贫血；②网织红细胞明显减少，绝对值
【骨髓象】急性型再障的骨髓损害广泛。①骨髓增生明显减低；②粒、红两系细胞极度减少，淋巴细胞相对增高；③巨核细胞显著减少；④浆细胞分类比值增高。
(2)慢性型：CAA起病和进展缓慢，以贫血和轻度皮肤，粘膜出血症状多见，严重出血和感染少见。
【血象】①红细胞，血红蛋白平行性下降，血红蛋白多为中度或重度减低，呈正常细胞正常色素性贫血。②网织红细胞减少，绝对值低于正常，常小于15×109/L；③白细胞减少，多在(2、0~3、0) ×109/L；④血小板减少，多在(30~50) ×109/L。【骨髓象】慢性型再障的骨髓中可出现一些局灶性代偿性造血灶，故不同部位骨髓穿刺的结果可有一定的差异。①骨髓增生程度多为增生减低；②巨核细胞、粒细胞、红细胞三系细胞均不同程度减少。巨核细胞减少常早期就出现，治疗有效时恢复也最慢，故在诊断上的意义较大。③淋巴细胞相对增多。
如穿刺部位为代偿性造血灶，则骨髓象呈增生活跃，粒系百分率可呈正常或减低，红系细胞百分率增高，但巨核细胞仍显示减少或明显减少。
(二) 白血病
1、急性白血病
【血象】
(1)红细胞及血红蛋白中度或重度减少，呈正常细胞正常色素性贫血。
(2)白细胞计数不定：白细胞数增多者，多在(10~50) ×109/L之间，也有白血病计数在正常范围或减少。白细胞分类计数可见一定数量的白血病性原始或幼稚细胞，所占百分率不定。
(3)血小板计数常减少。
【骨髓象】
(1)骨髓增生在极盛期明显活跃或极度活跃，但在疾病过程中会出现岛状增生，非均一性增生，局部增生(混杂性浸润)及间质变，再障样变等多种变化需要通过骨髓活检来鉴定。
(2)一系或二系原始细胞明显增多。≥30%ANC(all nucleated cell,所有有核细胞)。
(3)因白血病细胞类型的不同，其他系列血细胞均受抑制而减少。
(4)涂片中分裂型细胞核退化细胞增多。在急诊白血病中，“蓝细胞”较其他类型白血病中多见；在急粒和急单白血病中，可见到Auer小体。
2、慢性白血病
慢性粒细胞白血病：CML为起源于造血干细胞的克隆性增殖性疾病，以粒系细胞增生为主。多见于青壮年，起病缓慢。突出的临床变现为脾明显肿大和粒细胞显著增高。细胞遗传学的特征为具有特异性的Ph染色体。
【血象】①红细胞及血红蛋白早期正常或轻度减少，随病情发展贫血逐渐加重，急变期呈重度贫血。一般为正常细胞正常色素性贫血；②白细胞显著增高为突出表现。疾病早期可在(20~50) ×109/L,多数在(100~300) ×109/L。分类计数粒细胞比例增高，可见各阶段粒细胞，尤以中性晚幼粒细胞为多见，原粒细胞和早幼粒细胞
【骨髓象】①骨髓增生极度活跃；②粒细胞系显著增生，原粒和早幼粒细胞
3、急性骨髓纤维化
急性骨髓纤维化临床进展迅速，脏器浸润轻，外周血常呈全血细胞减少，无泪滴状红细胞，但伴少量原始细胞；骨髓穿刺常呈干抽，骨髓象增生低下，可伴少量原始细胞。
【骨髓活检】骨髓增生极度活跃，红系前体细胞、粒系、巨核三系增生活跃；幼稚细胞簇状及散在分布，幼稚红细胞簇突出，巨核细胞较多，不同大小的均可见，核分叶少；大多数网状纤维增生显著，胶原纤维增生不明显。
4、多毛细胞白血病
外周血及骨髓涂片染色见直径10-15μm、胞浆 淡染有多毛状突起的毛细胞。相差显微镜下多毛突起最明显。外周血单核细胞减少(HCL 亚型时不减少)。骨穿常见干抽。骨髓活检是金标准。
【骨髓活检】毛细胞胞浆丰富、透明(HCL 亚型时嗜碱性)，核圆、椭圆，居中呈“煎蛋样，多无核仁，有的核呈粗块状似成熟浆细胞胞核，有胞核似豆形核。根据毛细胞浸润骨髓程度不同，可呈间质性、大片状或弥漫均匀分布，胞浆丰富，胞核彼此间距宽而类似“铺药片”样或“蜂窝”状是其特征，在骨髓“血湖样”改变不常见。粒、红、巨核三系细胞随毛细胞浸润加重而减少，网状纤维可增多。
5、冒烟型白血病
冒烟型白血病涂片检测可为阴性，仅表现为骨髓活检阳性。骨髓活检：见体积大，有异型的成片的幼稚细胞。由于成片存在，极易误诊为转移性肿瘤。这种早期白血病的诊断需要非常谨慎，必须结合相关特异性免疫标记，才可做出诊断。否则其诊断仅可作为参考，不能认为是最后诊断，更不能作为治疗依据。
三、骨髓检查的新进展：
1、骨髓活检是用一种环钻(trephine)切取骨髓作活组织检查，可观察骨髓完整的组织结构，真实反映骨髓局部的增生情况，发现局灶性坏死等。而抽吸取样破坏了骨髓原来的结构并被血液稀释，故骨髓活检被认为是观察骨髓各细胞系列比例和增生情况的金标准。
2、细胞免疫表型分析即细胞分化抗原簇(CD)分析。用各种荧光染料标记的抗CD单克隆抗体与流式细胞术结合，鉴定包括造血干细胞、各种淋巴细胞、髓系细胞、单核细胞、巨核细胞等的CD表型。目前在血液细胞学分析，特别是淋巴瘤和白血病分型方面应用越来越广。
3、细胞遗传学分析淋巴瘤，白血病、MDS等恶性血液病，往往有染色体异常。通过直接制片用荧光原位杂交(FISH)技术可以作细胞分裂间期的细胞遗传学分析或通过短期培养，即可进行常规染色体鉴定，目前以FISH和常规染色体鉴定为基础的细胞遗传学已逐步发展为诊断淋巴瘤，白血病乃至多种实体肿瘤的常规诊断手段。
4、分子遗传学分析从基因(DNA或RNA)水平研究和诊断血液系统疾病[2]，是当前热点，例如由于9号和22号染色体易位t(9:22)形成的，在慢粒白血病常见的Ph染色体，以往多用染色体分析法鉴定，后来发现这种易位形成了一个新的融合基因bcr-abl，从而可用基因探针技术或PCR进行定性和定量分析。
5、直接查找微生物如黑热病的利-杜体、弓形虫等。近年来，由于临床免疫抑制剂的大量使用和艾滋病的发生率增高，许多以往很少见的微生物如鸟分枝杆菌、组织胞浆菌(Histoplasma)等。这些病原微生物的检测近来多利用包括分子生物学技术在内的先进实验室检验技术进行，但也常可在骨碎片中找到。
随着时展，骨髓检查的内容愈加丰富，技术手段也越来越多。现代的骨髓检查已从早期单纯的细胞涂片发展到以细胞形态学和组织形态学为基础结合细胞化学、免疫组织化学、流式细胞分析，细胞遗传学和分子生物学、超微结构分析等诸多方面的综合诊断学。常规的形态学检查也逐步规范化。
参考文献
[1]王振法，血液病诊断及图谱[M] .天津:新华出版社,1997:145-150.
关键词 骨髓细胞学 免疫学分型 血液病 诊断
中图分类号：R733.2； R730.4 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2016）23-0059-03
Value of MICM classification in the diagnosis of leukemia*
PENG Yongquan**
（Department of Laboratory， Ji-an central hospital， Ji’an 34300， China）
ABSTRACT Objective： To investigate the value of MICM （morphology， immunology and cell genetics） classification in the diagnosis of leukemia. Methods： One hundred and three cases of leukemia patients treated in our hospital from February， 2015 to January， 2016 were selected as subjects， and the coincidence rates to the diagnosis of leukemia were compared among three detective methods including single bone marrow cytology classification， single cell immunology classification and MICM classification. Results： The coincidence rates to the diagnosis of leukemia were higher by bone marrow cytology classification combined with immunology classification than by single bone marrow cytology classification and single cell immunology classification （94.17% vs 76.69% and 78.64%） （P0.05）. Conclusion： The MICM classification has a higher value in the diagnosis of leukemia and is worthy of further clinical practice.
KEY WORDS bone marrow cytology； immunology classification； blood disease； diagnosis
血液病是指造血系统发生的生理或病理性疾病，临床表现为贫血、出血、发热等症状，常见的血液病有白血病（acute leukemia， AL）、再生障碍性贫血等[1]。白血病是常见的血液病，在造血系统疾病患者中占首位[2]。目前对白血病的分型诊断标准是根据细胞形态学进行分型，但该分型方法常因白血病细胞形态不典型而出现误诊，诊断符合率有待提升[3]。本文探讨MICM（形态学、免疫学与细胞遗传学）分型在白血病诊断中的应用价值，报道如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
选取2015年2月―2016年1月我院治疗的白血病患者103例，所有患者均经病理学检查初诊为白血病。纳入标准：①符合WTO关于白血病的诊断标准[4]；②患者对本研究知情同意且签署知情同意书。排除标准：不同意纳入本研究的患者。其中男53例，女50例，年龄5～72岁，平均年龄（41.21±4.57）岁。
1.2 方法
1）样本收集 采集骨髓标本2～3 ml于抗凝管，置于15～25 ℃保存，制备样本待测，所有样本在获取6 h 内处理。
2） 骨髓细胞形态学检查 常规使用瑞氏过氧化物酶（POX）染色，光学显微镜下对血细胞进行细胞形态学分型诊断。
3） 细胞免疫学检查 取抗凝骨髓液2 ml，常规分离单个骨髓核细胞，采用荧光显微镜间接免疫荧光法测定，单克隆抗体购自美国贝克曼公司和BD公司，流式细胞仪由BD公司生产，严格按说明书操作。 判断标准：淋系抗阳性细胞>30%， 髓系及干组系抗原>20%，非系列特异性抗原及其干组抗原>20%为阳性，分型判断标准根据国际白血病欧洲协作组 （EGIL）标准[5]。
4）检测方法 根据检查结果，比较分析单一的骨髓细胞形态学分型，单一细胞免疫学分型与MICM分型这3种检查方法对白血病诊断的符合率。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0软件，计数资料比较采用卡方检验，以P
2 结果
2.1 分型结果
检测结果显示，急性髓细胞性白血病（AML）检出率最高，其次是急性淋巴细胞性白血病（ALL）和慢性粒细胞性白血病（CML），急性白血病（AL）最低（表1）。
2.2 单一骨髓细胞学分型、单一细胞免疫学分型与MICM分型诊断比较
MICM分型诊断白血病的灵敏度、特异度、阴性预测值和阳性预测值均较单一骨髓细胞学分型、单一细胞免疫学分型诊断高，差异有统计学意义（P
3 讨论
白血病是造血干细胞异常克隆性疾病，至今仍有40%左右为难治性病症，且其发生机制目前尚未明了。患者的临床表现、细胞形态、对化疗药物的敏感性各不相同，因而正确识别和诊断不同特征的白血病患者，对于指导治疗具有十分重要的意义[6]。骨髓细胞形态学分型是白血病分型的基础[7]，它可以按不同的血液病的细胞形态学特征，结合临床表现做出肯定性诊断，有利于各种血液系统疾病的早期诊断，尤其是对各型白血病，多发性骨髓瘤等，为治疗方案提供客观依据[8]。作为基础的诊断方法，它常由于细胞形态不典型而难以明确诊断。细胞免疫分型应用多种荧光标记单克隆抗体对细胞行标记检测，由于其对某些形态特征不典型、单克隆抗体反应特异性不灵敏的白血病的诊断确诊有困难，故单独使用符合率不高[9]。
本文通过研究单一骨髓细胞学分型、单一细胞免疫学分型与MICM诊断白血病，比较这3种方法诊断白血病的价值。结果显示，在如M2等某些特定的白血病分型中，形态学和免疫学诊断各有优劣，然而总体诊断的准确性，特异性均较低，故目前临床上很少单一使用。相比之下，MICM分型在白血病各类分型中诊断的价值较高，诊断结果符合率因而也较高，因此成为目前临床上常用的诊断白血病的方法。本文通过研究MICM分型临床应用现状再次验证其应用效果，明确其广为推广对于患者临床分型的重要指导意义。MICM检测，可供的标本种类有骨髓外周血脑脊液及其他体液，既克服了传统形态学和细胞学分型方法上的缺点，又具有简单快速计数细胞量大灵敏度高及结果准确度高的特点，对提高白血病诊断的灵敏度及分型的准确性起到极大的作用[10]。随着近年该检测技术的推广，操作技术日益娴熟，MICM分型为白血病患者的诊断提供了准确的结果，对深入研究其发病机理，进行个体化治疗起到了很好的辅助作用。
综上所述，MICM分型在白血病的诊断中具有较高的诊断价值，可为白血病的诊断提供准确结果，值得临床进一步实践。
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[文献标识码]A
[文章编号]1006-1959(2009)07-0280-02
肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,长期危害着人类健康。近十年来,对肾细胞癌的分子生物学研究取得了长足的进展,使我们对肾细胞癌有了更深刻的认识。本文就肾细胞癌各种病理分型的分子生物学研究进展进行综述。
1肾细胞癌发生的分子生物机制
肾癌的发生发展是多阶段、多步骤的过程,包括癌基因激活和抑癌基因(tumorsuppressorgene,TSG)失活在内的一系列遗传学改变。抑癌基因的缺失或失活是肿瘤发生发展过程中重要的分子事件之一。肿瘤常在抑癌基因位点出现染色体基因缺失,表现为等位基因杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH),通过检测分析肿瘤LOH及其规律,可在染色体一定范围内发现肿瘤的抑癌基因及易感基因。为了能较全面的了解导致肾细胞癌发生发展的关键分子事件,不同学者对肾细胞癌全基因组进行了不同的研究,发现肾细胞癌发生高频率LOH主要见于以下几个染色体:3p、5q、8p、9p、10q、14q、17和18q染色体。
1.13号染色体:3号染色体短臂的部分缺失是肾癌基因改变中的高发事件。其中定位于3p25-26的VHL抑癌基因被认为是这些基因改变的首要目标。在以前的研究中,VHL在肾透明细胞癌(cc-RCC)中的失活机制主要为等位基因缺失和突变,DNA超甲基化很少见。刘宁等利用PCR限制性片段长度多态性法对3号染色体上的VHL基因的两个单核苷酸多态性位点进行检测来分析VHL基因的杂合性缺失失情况,发现,42%(8/19)发生VHL基因LOH,并未发现VHL基因失活与肿瘤的分期、分级存在联系。
有杂合性缺失研究显示,有可能在染色体3p上存在另外的RCC相关抑癌基因。定位于染色体3p14.2上包含最常见的FRA3B脆性位点的FHIT基因作为候选抑癌基因日益受到关注。Velickovic等通过选择性的检测FHIT区域的LOH发生情况认为这个基因在ccRCC的发展过程中起到很重要的作用。并且发现在cc-RCC中染色体3p的LOH发生率达76%。Farkas等对88例肾细胞癌病例进行LOH研究,选取了3p14.2-p25范围内16个位点采用PCR技术进行LOH分析,结果显示VHL基因和FHIT基因区域,透明细胞癌的LOH发生率高达96%,而状细胞癌和嫌色细胞癌仅为10%和18%,并且LOH的发生率与肿瘤大小、分期、分级无关。从而认为VHL和FHIT的等位基因缺失是肿瘤发生的早期事件。
1.25号染色体:1986年APC基因首次在一位患有息肉病及多种其它先天性畸形患者的5号染色体长臂片段先天性中间缺失中得到证实,确切的基因位点随后由定位克隆确定。Pecina-SlausN等利用相对外显子11和15的特殊寡核苷酸引物对36例肾细胞癌病例进行限制性片段长度多态性的检测,了解与APC基因相关的LOH情况,并同时检测APC蛋白的表达情况。研究发现36例样本中有33例为信息性病例,其中有17例出现LOH,并且LOH的发生与年龄以及肿瘤的TNM分期呈正相关。但并不是所有出现LOH的病例都有APC蛋白的表达。从而认为APC基因与肿瘤的进展有着密切关系,可能不是肿瘤发生的早期事件。
1.38号、9号染色体:Presti等学者对72例肾透明细胞癌进行LOH测定,并将LOH作为临床预后指标的评估,他们选取了3p,8p,9p,14q四个不同的染色体,在每个染色体上选取两对引物,结果显示8p、9p的LOH发生率与肿瘤复发率正相关。由此推测8p、9p的LOH可作为判断局部进展型肾癌预后的一个指标。
近年来许多学者在多种肿瘤,如肺癌、食管癌、黑色素、胃癌、成神经细胞瘤等研究中均发现,9号染色体常出现较高频率的LOH,所以推测9号染色体上存在不止一个与这些肿瘤的发生相关的抑癌基因。Fukunaqa等利用荧光多重PCR技术比较提取自肿瘤组织和对应的外周血液样本中的DNA,通过对9号染色体上的13个位点进行分析,发现109例肾细胞癌中27例至少有一个位点出现LOH,其中最高发生率出现在PTCH基因所在的9P22区域。而Sanz-casla等对40例单发肾细胞癌病例同时进行p16基因附近染色体9p21区域的LOH和p16基因启动子超甲基化的检测,出现LOH的为9例,超甲基化的为8例但是两者之间没有必然联系由此推测p16基因的失活和其他未知的抑癌基因共同参与肾细胞癌的发病机制。Grady则通过对60例肾细胞癌病例进行9号染色体上的16个微卫星位点的LOH分析,60例样本中至少一个位点出现LOH的为44例,主要缺失区域出现在位于9p21的DS171、D9S1749和DS270上。有46%的病例在9q32-9q33出现LOH,在这一区域的D9S170位点LOH发生率达22%,研究认为除了在9p21附近的p16候选抑癌基因外,在9p21以及9q32-9q33附近很有可能存在其它的抑癌基因。
1.410号染色体：Velickovic等对10号染色体上与PTEN/MMAC1抑癌基因相关的7个微卫星标记物LOH发生率进行分析，其中肾透明细胞癌的LOH发生率为37.5%，状细胞癌为29.7%，嫌色细胞癌为87.5%，且LOH发生率与肿瘤的分期、分级和生存率有关，并且认为双等位基因失活的发生多由非点突变畸变导致。
1.514号染色体：Kaku等对染色体14q24-31区域的7个微卫星位点进行研究，发现42例信息性病例中23例（54.8%)出现LOH，并发现LOH发生最普遍的区域位于D14S67附近的2-Mb范围，且LOH的发生率与肿瘤分期呈正相关。同样Alimov等利用2个RFLP位点对45例肾细胞癌患者进行研究，发现45例信息性病例中17例（38%）在染色体14q31-q32.2上出现LOH，并且LOH的发生率与肿瘤的分级和低生存率正相关。而Gallou等的实验则将14q上的普遍缺失区域定位于D14S281到D14S277之间。另外有学者对130例肾透明细胞癌病例采用D14S588、D14S617、GATA136B01三个位点进行LOH分析，数据显示LOH发生率与肿瘤大小、组织学分级、生长速度以及致死率呈正相关。
以上关于14q染色体的LOH研究均显示与肿瘤的分级和低生存率呈正相关关系，表明肿瘤的14qLOH很可能与肿瘤的侵袭发展有关。
1.617号染色体：p53基因位于17p13.1上，具有反式激活功能和广谱抑癌作用，与多种恶性肿瘤的发生、发展及预后有关。因此研究染色体17p上TP53位点的LOH情况对于揭示P53在肿瘤发生过程中发挥的作用意义重大。在29例肾细胞癌中，W.M.L.报道了关于P53的杂合性缺失为48%(14/29)，并通过序列测定确认单链构象多态性而发现了有11例出现突变。Ogawa等利用p53基因附近的5个多态性探针对48例肾癌进行研究，发现染色体17p的等位基因缺失率为17%(6/36)，并且染色体17p的等位基因缺失与肿瘤分期无确切相关性。其他研究者发现在17号染色体上还存在着其它LOH发生区域。Khoo等对BHD基因区域的2个微卫星位点D17S740和D17S2196进行检测，28例肾细胞癌中10例（36%）出现LOH，其中6例嫌色细胞癌中2例（33%）出现LOH，6例状细胞癌中出现5例（83%），透明细胞癌12例出现3例（25%）。并推测BHD基因可能在肾脏肿瘤的发生发展中起重要作用。而Simon-kayser等对处于17q11到17q23之间的7个微卫星标记物进行检测，15例状肾细胞癌中14例为信息性病例7例出现LOH。发生频率最高的为与FBXO47候选抑癌基因相关的D17s250位点。
1.718号染色体：Hirata等对126例肾透明细胞癌病例进行研究，通过对染色体18q上的9个微卫星位点实验，发现24例(19%)发生LOH，LOH最高发生率出现在DCC基因所在的18q21.3区域，并发现LOH的发生率与性别、肿瘤分期、分级、等参数无关。认为DCC和SMAD4可能做为候选抑癌基因与肾透明细胞癌的发生有关。 2肾细胞癌的病理分型与分子生物学机制
1997年国际抗癌联盟(UICC)和美国癌症联合委员会(AJCC)根据已知基因改变以及肿瘤细胞起源，并结合肿瘤细胞形态特点将肾癌分为透明细胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma)、状肾细胞癌(papillaryrenalcellcarcinoma)、嫌色细胞癌(chromophoberenalcellcarcinoma)和集合管癌（carcinomaofthecollectingducts）4种基本形式。约有4％~5％肾癌细胞形态及遗传学改变不一，细胞成分混杂或有未识别的细胞成分，此类肿瘤归为未分类肾细胞癌（renalcellcarcinoma，unclassified），有待今后进一步研究。由于在各型肾癌组织中都可见到细胞质中含有嗜酸颗粒或梭形细胞成分，所以在新分类中取消了颗粒细胞癌和肉瘤样癌。
肾透明细胞癌或称为传统的肾细胞癌或非状肾癌，约占70％~80％，是最常见的病理类型，起源于肾近曲小管。已明确的遗传学改变是以3p缺失、VHL基因突变、甲基化或缺失为特征，此外尚有不十分明确的改变。综合国内外文献报道，常见的染色体缺失区域包括4q、6q、9p、13q、Xq、8p，常见的染色体扩增区域包括5q、9q、17p、17q。Jiang等利用分枝树模型及时间树模型对肾癌比较基因组杂交数据进行分析后认为透明细胞癌至少可能分为两个亚型，一型伴有-6、+17p、+17q，另一型伴有-9p、-13q、-18q。-4q是透明细胞癌发展过程中除-3p外的另一重要早期事件，-8q多出现在转移灶中，是原发性透明细胞癌的一个晚期事件，9p、13q上可能存在与肾癌进展相关的抑癌基因。
状肾细胞癌或称为嗜色肾细胞癌或肾小管状癌，约占10％一15％，是第二常见的肾恶性肿瘤，可能起源于肾近曲小管。遗传学上，以Y染色体丢失、7号染色体和17号染色体的三倍体或四倍体异常为特征，此外较典型的分子遗传学异常尚有C-MET基因活化、+12q、+16q、+20q、-1P、-4q、-6q、-9p、-13q、-xp、-xq、-Y等。Delahunt和Eble在1997年应用免疫组化方法分析91例状肾细胞癌，根据形态学改变分为2型，1型状肾细胞癌光学显微镜下呈管状结构，被覆小细胞，含有卵圆形小细胞核，核仁不显著，胞质少、灰白。2型状肾细胞癌为状结构，被覆丰富嗜酸性胞质的大细胞，含有大球形细胞核。分析结果显示：7号染色体和17号染色体倍体异常多见于状肾细胞癌1型，而-Xp常提示预后不良。与透明细胞癌相比，状肾细胞癌的多灶性或双肾癌更常见。
嫌色细胞肾细胞癌约占5％，起源于肾集合小管暗细胞。遗传学以多个染色体丢失和单倍体为特征，LOH常发生在1、2、6、10、13、17或21号染色体。
肾集合管癌少见，起源于肾髓质或肾的中央区集合管上皮，遗传学上的改变无统一形式，以染色体18、21和Y染色体单体丢失以及染色体7、12、17、20的多倍体异常较常见。
随着荧光原位杂交(FISH)、比较基因组杂交GH)、单链构象多态性(SSCP)分析、cDNA及组织阵列等分子生物学技术的发展，染色点的异常已经能准确检出，并根据肾癌的特征性遗传学改变行分型。Wilhelm等应用阵列比较基因组杂交技术对40例肾肿瘤(透明细胞癌16例，状癌13例，嫌色细胞癌5例，嗜酸细胞瘤6例)及2例正常肾组织进行检测。杂交结果使自动图像分析，根据遗传学的改变对肿瘤进行分类，准确率达98％。
【关键词】宫颈癌;比较基因组杂交;树模型
Abstract:ObjectiveBasedonCGH(comparativegenomichybridization,CGH)data,toconstructtreemodelofcervicalcarcinomaandtoexploremultipathwaymodelofcervicalcarcinomaprogression.MethodsUsingthesoftwarewhichDesperetaldeveloped,treemodelsofcervicalcarcinomawereconstructedaccordingtotheCGHdataof58cervicalcarcinomapatients.ResultsTreemodelsforcervicalcarcinomasuggestedthattherewere+1q，+3q，+5p，+17q，+20qand+20psixnonrandomgeneticevents,and+1qand+3qmightbeimportantearlyeventsincervicalcarcinogenesis,indicatingthattheremightbecancerrelatedgenesinthesechromosomalarms.Aschangesof+3qoccurredpriortothoseof+17q,theremightbesomecauseeffectrelationship.Thechangesof+1qmightbeaindependentgeneticevent.ConclusionTreemodelsbasedonCGHdataofcervicalcarcinomaimplyits’multistepandmultipathwayprogressionanddirecthowtosearchingforcervicalcancerrelatedgenes.
Keywords:cervicalcarcinoma;comparativegenomichybridization;treemodel
肿瘤的发生发展是基因改变不断发生、不断累积的结果。那么，在肿瘤发生发展过程中，基因改变的模式如何呢？1988年，Vogelstein等［1］首次提出了结直肠癌演进的经典模型，即结直肠癌的演进由4个遗传事件以链式模式发展的，即路径模型：染色体5q上APC基因的缺失或突变；12p上Kras基因的突变；18q上DCC基因的缺失；17p上p53基因的缺失或突变。第一个事件的发生能增加第二个事件发生的概率，第二个事件的发生能增加第三个事件发生的概率，依次类推。这些基因改变一旦发生，就是一个不可逆的发展演进过程。肿瘤演进的经典路径模型对于确定肿瘤早期诊断或治疗的相关基因位点具有重要价值。于是，人们试图在其他肿瘤的演进过程中找到与结直肠癌类似的路径模型，但是，都没有成功［2］。事实上，在肿瘤的发展演进过程中，遗传物质的改变不会总是按照一定的顺序、沿着一条路径发生，而且，即使在临床上或者病理学上认为同质的肿瘤，其本身存在异质性［3］。因此，探索不依赖于单纯线性演进的肿瘤发展模型是很有必要的。Desper等［4,5］提出了反应肿瘤异质性的肿瘤发生发展的两种进化树模型，即分枝树和距离树。为此，本研究利用Desper等基于比较基因组杂交（comparativegenomichybridization,CGH）资料建立的树模型软件并加以改进，对58例宫颈癌患者（其中包括4种宫颈癌细胞株）的CGH资料进行了分析，构建了宫颈癌发展演进的树模型。
1材料与方法
1.1材料
收集了58例宫颈癌完整CGH检测资料，其中FIGO分期Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期16例，Ⅳ期3例，还有4种宫颈癌细胞株的CGH资料［6-9］。
1.2事件的选择
CGH检测的结果是一个关于染色体拷贝数量改变（copynumberaberrations,CNAs）的遗传事件集。本文利用最常用的Brodeur法［10］选择一组非随机事件，Brodeur法假设扩增和丢失的机会均等，并与染色体臂长成正比［11］。构建树模型的数据是一系列的染色体扩增和丢失，一例病人对应一行数据，记录的是染色体臂水平扩增和丢失。人类有22对常染色体和X、Y两条性染色体，所有染色体都有长臂q，而13、14、15、21、22号染色体短臂p很短，本文排除了这5个染色体短臂，还忽略了1p、16p、19p、19q和22q这5个染色体臂，因为这些区域富含胞嘧啶和鸟嘌呤，易出现假阳性；另外，还忽略了Y染色体，因为其短且很少改变。这样就剩下36条染色体臂需要分析，而每条染色体臂都有可能扩增或丢失，因此，总共有72个可能事件。
1.3树模型
1.3.1分枝树（branchingtrees）
Desper等人［4］利用基于计算机技术的最大权重分枝方法提出的一种重构肿瘤发生发展的树模型方法，并称这种树模型为分枝树。该模型把一个节点作为根（root），而其他的每个节点都代表一个遗传事件。在一个树枝上，i>j表示一种假说的因果关系，即事件i的出现使得事件j的发生更为可能。分枝树实际上是Vogelstein路径模型的泛化，也就是将肿瘤发生的一条路径模型转化为多条路径模型（multiplepathways），一个树干即为一条路径，更直观地体现了肿瘤的异质性。分枝树提示：（1）靠近树根的事件可能是早期事件，也可能是因为与其他事件的发生相关性不大而置于近根部；（2）在一个树枝（edge）上按顺序走向的事件有可能存在因果关系；（3）集聚在树的分枝（subtree）下的事件可以作为肿瘤亚型（subclass）的标志。
1.3.2距离树（distancebasedtrees）
Desper等人［5］利用现有的系统发育算法建立另一种树模型。该模型把所有的事件都作为叶子，同时把隐含的、未命名的事件作为内在节点。该模型的另一个不同点是，树中的每一个树枝都有长度，因此，基于这种方法建立的树模型被称作距离树。从根到其他事件i的距离为log(pi),其中pi是事件i的观察概率，可见，事件i的观察概率越大，它离树根的距离越近，即越早发生。距离树提示：（1）靠近根的事件是早期事件；（2）集聚在树的分枝（subtree）下的事件可以作为肿瘤的亚型（subclass）标志。
1.4统计学分析
用SPSS10.0forwindows统计软件包进行χ2检验,当n<40或频数<1时,用确切概率法。
2结果
2.1宫颈癌发展演进树模型的构建
宫颈癌树模型见图1。从分枝树模型可以看出，+1q和+3q可能是宫颈癌癌变较早期事件，+1q是相对较独立的事件，+3q的出现可能导致+17q的发生，而+17q的发生又将促进+20q的发生，+20q的发生必将增加+5p、+20p出现的概率。从距离树可以清楚地得出+3q是宫颈癌发生发展过程中较重要的早期事件。
2.2宫颈癌中非随机染色体事件的统计分析
58例宫颈癌（其中4个细胞株）样本中，+1q，+3q，+5p，+17q，+20q和+20p分布见表2，各染色体臂改变的频率如下：+1q为36.2%；+3q为70.7%；+5p为20.0%；+17q为24.1%；+20q为15.5%；+20p为15.5%。表1宫颈癌6个非随机染色体事件分布情况（略）
2.3根据宫颈癌树模型可以看出，宫颈癌可能存在2种亚型：一种以+3q、+5p、+17q、+20p和+20q为标记，一种以+1q为标记；宫颈癌染色体改变以扩增为主。
3讨论
自从1988年Vogelstein等［1］提出结直肠癌发生、发展、演进的经典路径模型，科学研究者们希望其他肿瘤的发展演进也有与结直肠癌相似的经典路径模式，但是都没有取得理想的结果。原因是肿瘤是一个多因素参与、多基因改变、多步骤发展的复杂过程，肿瘤具有异质性。
比较基因组杂交技术可以在染色体或染色体亚区水平上对DNA序列拷贝数进行检测、定位。它最大的优点是一次杂交就可以全面检测出肿瘤基因组复杂的遗传改变，包括染色体区段拷贝数的增加或减少。为了深入挖掘从大量标本获得的海量CGH资料中蕴含的关于肿瘤发生、发展、演进的规律，Desper等根据数学原理结合计算机技术开发出了一种CGH资料数据分析软件，即根据CGH资料数据构建肿瘤发生、发展、演进的2种树模型：分枝树和距离数。他们利用CGH资料数据分析软件分析了116例肾透明细胞癌的CGH资料，并构建了肾透明细胞癌的2种树模型，结果分析与以前细胞遗传学研究的结果相吻合，如3p丢失是肾透明细胞癌发生的早期事件，根据树模型还提出了肾透明细胞癌发生发展过程中有意义的新假说［12］。这有力地说明构建基于CGH资料的肿瘤树模型对于研究肿瘤发生发展及其演进规律是非常有意义的。
尹志华［13］等利用CGH资料数据分析软件分析了收集到的127例结直肠癌的CGH资料，构建了结直肠癌发生发展的树模型，结果显示，树模型与Vogelstein的经典路径模型有一定的吻合度，如-18q先于-17p发生，而且使后者的发生可能性更大。两者差别也是明显的，与经典路径模型相比，树模型更体现了肿瘤的异质性及肿瘤发生发展的多途径模式，更符合现代关于肿瘤发生发展演进的理论，经典路径模型显得过于简单。
本研究利用CGH资料数据分析软件分析了58例宫颈癌CGH资料，构建了宫颈癌发生发展的树模型，模型各染色体臂改变的频率如下：+1q为36.2%；+3q为70.7%；+5p为20.0%；+17q为24.1%；+20q为15.5%；+20p为15.5%。Lazo等［14］研究发现，90%的浸润宫颈癌中发现有3q的扩增。Wilting等［15］研究发现，在宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌中常见20q拷贝数的扩增。树模型提示，+1q和+3q可能是宫颈癌癌变较早期事件，统计分析结果也证明了这一点，+1q、+3q和+17q在宫颈癌的发展演进过程的各个阶段中差异没有显著性（P＞0.05）。
Andersson等［16］研究发现，宫颈腺癌中，3q26上人端粒酶基因TERC常见扩增，并可作为宫颈腺癌的诊断指标。+5p和+20p在宫颈癌早期和进展期中，差异有显著性（P＜0.05），进展期高于早期，说明+5p和+20p是宫颈癌发展演进的晚期事件，+20q在宫颈癌发展演进中的确切作用有待扩大样本进一步确定。根据树模型可以推测，宫颈癌可能存在2种亚型：一种以+3q、+5p、+17q、+20p和+20q为标记，一种以+1q为标记；宫颈癌染色体改变以扩增为主。
总之，利用CGH资料数据分析软件构建基于CGH资料的肿瘤发生发展的树模型，对于挖掘蕴含在海量数据中的肿瘤发生发展演进规律具有重要意义。本研究提示+1q、+3q、+5p、+17q、+20p和+20q是宫颈癌发生发展演进过程中的非随机事件，提示在这些染色体臂上可能存在与宫颈癌发生发展密切相关的肿瘤基因，为后续相关研究指明了方向。
由于CGH技术存在敏感性低的缺点，小于10Mb的染色体改变检测不出［17］，一些染色体缺失11q23，2p,3p,18q21.3和11p15.5等未出现在树模型中［18，19］。但是,一次实验就能给出了一个肿瘤全基因组水平的遗传改变的全貌。基于CGH资料和数学模拟建立的肿瘤发生发展的进化树模型，科学地阐明了肿瘤发生发展的多基因、多步骤的演进过程，体现了肿瘤内在的异质性。深入分析宫颈癌进化树模型中的6个非随机染色体事件，对于发现与宫颈癌发生发展密切相关的肿瘤相关基因，阐明宫颈癌发病的分子机制等具有重要指导意义。
致谢：衷心感谢美国国立健康研究所（NIH）的DesperR和SchafferA为本分析CGH资料所提供的热情帮助。
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[关键词] 维生素D受体；FokⅠ位点多态性；结核；Meta分析
[中图分类号] R52[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）06（a）-0004-05
Association between FokⅠ-ff genotype of vitamin D receptor and tuberculosis susceptibility in Chinese population:a Meta-analysis
ZHAO Yan-xia
Center for Disease Control and Prevention of Pingmei Shenma Group,Pingdingshan 467099,China
[Abstract] Objective To analyze the association between FokⅠ-ff genotype of vitamin D receptor and the tuberculosis susceptibility in the Chinese population by means of meta-analysis. Methods Mantel-Haenszel (MH) method was applied in the data analysis for the included 10 case-control studies by using Rev Man 5.5.1 software,and funnel plot was used to estimate the publication bias. Results The cumulative cases and controls were 2892 and 3355,respectively.The consoladition effect value RR was 1.74 (95%CI:1.20-2.52).Significant publication bias was not found in the above literature. Conclusion FokⅠ-ff genotype of vitamin D receptor should be associated with susceptibility of tuberculosis among Chinese population.
[Key words] Vitamin D receptor;FokⅠ-ff genotype;Tuberculosis;Meta-analysis
结核病是全球成人传染病所致死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高负担国家之一。世界卫生组织制定的新的六点控制结核战略中强调要促进结核的科学研究，开发有效预防、诊断和治疗结核的新工具[1]。在该方面的研究中结核易感基因是相关研究者关注的焦点。目前已发现的结核病易感基因主要有两大类，人类白细胞抗原（HLA）基因和非HLA基因[2-4]。其中非HLA基因中的维生素D受体（VDR）基因是结核研究人员关注的遗传易感基因之一。
VDR基因包含多个基因多态性位点，其中其第二外显子处的C/T多态性位点可以产生三种不同基因型ff、Ff、FF[5]。不同的基因型决定了VDR活性不同，对结核的易感性也不同。国内外结核研究者针对VDR基因型FokⅠ-ff与结核易感性作了大量研究，结论存在分歧。本文旨在采用Meta分析的方法对有关VDR基因型FokⅠ-ff与结核易感性的相关文献进行综合分析，得出有关中国人中FokⅠ-ff基因型与结核易感性的更系统、更具针对性的结论。
1 材料与方法
1.1 检索策略
以"tuberculosis" or "TB" and "vitamin D receptor" or "vitamin D" or "vit D"为检索策略检索PubMed，Web of Knowledge，Medline，CNKI、CBM、VIP和万方数据库及Google学术网站从1980年1月~2014年2月收录的文献（CNKI）的英文文献；同时，以关键词“结核病”、“基因多态性”（或“遗传多态性”）、“等位基因”、“VDR”检索CNKI、CBM、VIP和万方数据库的中英文文献，并且论文和综述的参考文献也纳入检索文献范围。
1.2 文献纳入和剔除标准
纳入文献标准：1980年1月~2014年2月发表的文献；病例对照研究；数据资料完整；对照组基因分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律；病例组均按照《中国结核病分类法》[6]诊断标准确诊为结核的患者；针对同一研究人群重复报道的文献，选用质量较好的或样本量最大的文献。
1.3 统计学分析
用Hardy-Weinberg遗传平衡定理检验[7]各多态性位点基因型频率是否达到遗传平衡。将观察所得的等位基因位点频数代入基因型的平衡定律，对观察值和预期值进行χ2检验，若P>0.05，则认为基因型频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定理，所选人群具有群体代表性。
采用Cochrane协作网出品的Review Manager软件（Rev Man 5.1.1）进行Meta分析（http：///revman/download）。以相对危险度（RR）作为效应合并指标。因为考虑到不同研究之间均存在不同程度的异质性，所以本Meta分析选用随机效应模型（Mantel-Haenszel，M-H）法进行数据合并，绘制森林图和漏斗图。
2 结果
2.1 文献筛选结果
共摘录30篇中英文文献，因为对照组基因分布不符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律排除5篇文献，因为诊断标准不是依据《中国结核病分类法》的排除8篇，因数据不完整，重复报道等筛除7篇。共剩余10篇严格符合文献筛查标准的文献（表1）。
2.2 森林图
因为经过筛查后的10篇文献在人群种族、基因检测方法上有差异，同时在研究时间、地点、操作人员上难以控制的差异，本研究选用M-H法合并效应值。同质性检验显示P1时，认为VDR-ff基因型是中国人群结核的易感因子（图1）。
进一步挑选出统一应用PCR-RFLP进行基因检测的6篇研究进行Meta分析。同质性检验显示P
挑选出研究对象为汉族人群（不包括汉族儿童）的6项研究进行Meta分析。同质性检验P
2.3 发表偏倚的评估
采用漏斗图评价上述3项Meta分析结果中发表偏倚的大小，如图4A、4B所示，VDR-ff基因型（多种技术检测）与中国人群结核病易感性的Meta分析漏斗图基本对称，同样VDR-ff基因型（PCR-RFLP技术检测）与中国人群结核病易感性Meta分析的漏斗图同样基本对称，可以认为该研究的发表偏倚较小，可以接受。然而对针对汉族人群的Meta分析漏斗图不是很对称（图4C），这可能是因为纳入的研究较少，样本量太小造成的。
3 讨论
维生素D的代谢产物1，25-（OH）2维生素D3是重要的免疫调节因子，它通过激活巨噬细胞及影响免疫应答来增强细胞的噬菌能力，从而影响结核分枝杆菌的生物活性；另外有研究显示维生素D3能抑制巨噬细胞中结核分枝杆菌的生长，暗示维生素D对结核分枝杆菌有一定的抑制作用[12]。而维生素D的生理作用主要是通过与其受体VDR介导实现的，因而对VDR的研究成为近年来研究的热点。
VDR基因多态性与结核易感性的关系一直是相关研究者的关注焦点。研究结论也存在分歧，特别是对应限制性内切酶FokⅠ酶切位点的VDR基因多态性位点与结核易感性的关系分歧较大，尤其是FokⅠ-ff基因型是否为结核病易感基因型的分歧。Wilkinson等[19]2000年针对亚洲人群（印度亚裔人群）的研究发现FokⅠ-ff与结核的易感性没有显著性关联性[OR（95%CI）：1.03（0.10～10.4）]。Selvaraj等[20]2003针对印度人的研究[OR（95%CI）：0.41（0.13～1.2）]、Bornman等[21]对冈比利亚人的研究[OR（95%CI）：1.08（0.60～1.92）]、Roth等[22]针对秘鲁人的研究[OR（95%CI）：0.84（0.34～2.06）]均表明FokⅠ-ff与结核的易感性没有显著性关联性。然而，另一方面，也有大量研究支持FokⅠ-ff是结核的易感基因。刘玮等[8]经Logistic回归分析发现FokⅠ-ff基因型与结核发病显著关联。由牛津大学学者在伦敦进行的病例对照研究也得出相似结论[22]。陈雪融等[9]对我国藏族结核患者的研究表明VDR基因中FokⅠ-ff基因型与结核患者痰菌情况显著关联。针对该分歧，2005年和2006年的两篇[23-24]关于VDR基因多态性与结核易感性关系的Meta分析均表明尚不能认为VDR基因型FokⅠ-ff是结核病易感因子的结论。然而，该两项Meta分析均未纳入中文文献。我们认为关于FokⅠ-ff与结核易感性研究结论存在分歧的原因之一为研究人群的地域因素。分析大量研究不难发现，国外的研究大部分得出FokⅠ-ff与结核易感性无关的结论，而国内的文章却相反，大部分研究认为FokⅠ-ff可能为结核的易感基因。有研究将此归结为种族差异，我们更偏向于地域差异。因为针对汉族人群的国外和国内的研究结论是相悖的。这可能是因为国内和国外在结核诊断标准及基因检测技术水平等方面存在差异所致。
本研究中筛选出国内病例组均按照《中国结核病分类法》诊断标准确诊的研究进行Meta分析，结果显示合并效应值RR为1.74（95%CI：1.20～2.52），可信区间上、下限均>1，可认为VDR-ff基因型是结核的易感因子，说明在国内诊断分析的结核患者（不论何种民族：汉族、藏族或者回族），FokⅠ-ff基因型是结核的易感因子。值得注意的是，当针对汉族人群（包括一项针对汉族儿童的研究[10]）进行Meta分析，结果显示合并效应值RR为1.37（95%CI：0.98～1.90），说明VDR-ff基因型与结核发病无关。当将针对汉族儿童的研究筛除后，合并效应值RR为1.52（95%CI：1.01～2.29），VDR-ff基因型是汉族成人结核的易感因子，暗示了VDR-ff基因型在汉族成人和儿童结核中的基因作用机制不一样。当然，本项研究样本规模较小，共研究了一项针对汉族儿童的研究，病例样本量只有125例。为了得到更可靠的结论，需要分析更大样本、更大规模的相关研究。
尽管从目前的研究结论来看，尚不能明确认为VDR-ff基因型是结核的易感基因，但不可否认，VDR-ff基因型在结核的发病过程有不可忽视的作用（特别是对国内人群）。在未来结核易感基因的研究中仍然有很大的空间去开拓，全面研究结核发病过程FokⅠ-ff基因型与另外的潜在易感基因的交互作用及其与环境的交互作用，平衡各种混杂因素，为结核的个体化预防、诊断和治疗提供线索和依据。
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关键词：牛；抗病基因 研究进展
中图分类号：S823 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2013）-04-0282-2
0 前言
动物可能对一些传染性疾病存在完全或部分的抗性，即抗病性。抗病性大多是由遗传因素来决定和控制的，动物自身的遗传性状决定着疾病的发病率。[1]抗病基因是动物抗病性的遗传基础，它是在外来因素的刺激下能够抵抗疾病入侵、能使动物体内产生抗体，即动物对疾病产生抗性的基因。抗病基因按照效应大小分为三类：第一是单一主基因，这种基因的功能主要是控制抗性状的表达；第二是微效多基因，这种基因控制的抗病能力是由多个基因共同完成的；第三是独立的多基因，一般抗病能力多受到独立的多基因控制，而特殊抗病能力主要受到单个主基因位点的控制。[2]
虽然预防接种在动物疾病控制方面起到了重要的防治作用，但仍未能完全遏制传染病的流行。当前可以利用分子生物学技术，进而找寻抗病基因进行抗病育种，从根本上改变动物的遗传性状，已成为控制和减少一些疾病发生的有效途径。而利用分子遗传学方法，采用基因图谱和数量性状位点扫描技术寻找与抗病力相关的基因，进行间接选择也日渐成为了新的方法。[3]目前，已经发现的在牛体内与免疫相关的抗病候选基因数量逐渐增多，主要有主要组织相容性复合物（MHC），天然抗性巨噬结合蛋白1（NRAMP1），甘露糖结合凝集素（MBL），Toll样受体基因（TLR），干扰素（IFN）等，这些抗病候选基因有望成为动物抗病育种的新靶点。
1 主要的抗病候选基因
1.1 天然抗性巨噬结合蛋白1（NRAMP1）
NRAMP1基因是一个比较保守的基因，主要存在于吞噬细胞，嗜中性粒细胞以及外周血液细胞中，为特异性表达，会影响动物自身的固有免疫，所以是综合抗病能力较好的候选基因。NRAMP1基因最初在小鼠体内发现，是在网状内皮细胞中的巨噬细胞表达。NRAMP1基因的存在可以抵抗多种细胞内病原微生物的入侵，发挥着重要的免疫功能。[4]通过把小鼠的基因敲除发现，NRAMP1基因与一些细胞内菌，病原微生物菌，例如分枝杆菌中的结核分枝杆菌、沙门杆菌、利什曼菌等的抗性和易感性有关。牛的NRAMP1基因位于第2号染色体上，研究表明其对牛布鲁氏病、乳腺炎等疾病有抵抗作用。对NRAMP1基因功能的研究表明可能是通过消耗含有胞内病原微生物吞噬体中的二价金属离子，使病原微生物缺乏繁殖必需的金属离子而达到抵抗胞内病原微生物的作用[5]，但具体的作用机制目前尚不清楚。Ciro Estrada-Chavez，Ana L. Pereira-Suarez[6]等人发现在人体中，NRAMP1基因已被确定与结核易感性有关。
1.2 主要组织相容性复合物（MHC）
MHC是由连接紧密的多态性基因组成的，是一个与抗病性和免疫应答有着紧密相关性的基因家族，在免疫反应中对细菌、病毒、寄生虫等的控制和清除起着重要的作用。目前已经证实MHC与多种疾病间存在着密切的联系，牛的MHC物位于第23号染色体上，1978年牛的MHC基因得到了首次报道，命名为BoLA基因。有关BoLA基因和疾病的报道很多，Gilliespie，Sharif等人研究出BoLA-DRB3第2外显子与奶牛炎的高发病率有显著相关性。Wei Lei，Qinglong Liang等人研究了牛BoLA-DRB3基因和皖北FMDV与牛口蹄疫易感性之间的关联，采用BOLA-DRB3基因扩增的半巢式聚合酶链反应，分析基因频率和基因型频率在健康和感染口蹄疫牛之间的差异，发现等位基因Hae III A在皖北牛中与口蹄疫易感性显著相关，而Hae III C则对口蹄疫病毒具有很强的保护作用。[8]牛的BoLA基因与肠道寄生虫病、高酮症的易感性相关，牛的白血病与BoLA-AW16相关，牛的慢性后脊椎轻瘫与BoLA-A8相关，牛眼癌与W6相关，W14单倍型与牛结核病易感性相关。
1.3 Toll样受体基因（TLR）
TLR基因是一类普遍存在于哺乳动物中已经被鉴定出来的跨膜蛋白家族，主要存在于巨噬细胞、树突状细胞中，Toll样受体的作用是作为膜受体来识别侵袭机体的病原体含有的保守蛋白，还起着传递识别信号，激活核转录因子，转录相应的效应分子以及影响机体天然免疫等作用。[9]自从2006年牛的TLR基因mRNA序列在GenBank上公布，对TLR基因家族和牛疾病之间的相关性研究便迅速增多。Colleen A. Fisher， Eric K. Bhattarai[10]等人运用自定义下一代测序方法以及等位基因分型检测方法对牛的10个TLR基因变体的280双等位基因进行SNP检测和验证。采用验证牛TLR识别细菌配体基因的病例对照研究发现有6个SNP位点可能与结核分枝杆菌的易感性和奶牛感染副结核病的易感性相关。还有研究认为，TLR基因可能与牛呼吸性疾病、肠道性感染疾病、牛炎、口蹄疫病毒感染疾病、败血病及子宫内膜炎等。
1.4 甘露糖结合凝集素（MBL）
MBL基因是人体和动物体内重要的天然抗感染免疫分子，是由肝脏合成后分泌到血液中的，在抗原抗体发生特异性免疫反应前，其可以诱导并激活机体的固有免疫反应。MBL基因与免疫调节、补体活化的介导等生物学效应有着紧密的关联，同时又是临床上介导多种疾病发生的基础结构，MBL基因在防御病原微生物侵袭的天然免疫中起着抗感染分子的作用。[11]研究发现MBL基因的多态性和免疫缺陷性疾病、病毒性疾病、类风湿性关节炎、细菌性疾病、真菌性疾病以及寄生虫性疾病等均有相关性。根据Gen Bank的数据，牛具有MBL1与MBL2两种基因，Andersen等人通过亲和层析法从牛的血清中得到了纯化的MBL基因。Kawai等人采用编码人MBL基因的胶原区、颈区及糖识别区域探针的方法，从牛肝cDNA文库中筛选编码牛MBL基因的cDNA克隆，同时从牛血清中分离得到了MBL基因。Capparelli R[12]等人研究发现MBL基因多态性与水牛抗布鲁杆菌病的能力密切相关，其作用机理为MBL基因突变导致甘露糖结合凝集素血清水平下降，影响了正常的免疫功能。Liu J， Ju Z， Li Q等人选择了MBL基因启动子区域的三个新SNP位点和两个已报道的MBL1基因外显子2的位点进行检测，采用PCR单链构象技术在中国奶牛的三个不同品种中进行性多态性分析，分析其基因型和单倍型频率，血清MBL-A的水平，补体活性等，结果表明MBL1基因与抗奶牛乳腺炎存在相关性。[13]
1.5 干扰素基因（IFN）
由于IFN具有抑制肿瘤细胞生长、抵抗病毒感染及调节机体免疫功能的作用，因此成为病毒学、遗传学、免疫学、以及分子生物学比较活跃的研究领域。IFN-γ在调节机体免疫系统功能、增加巨噬细胞杀菌力、影响细胞的增殖与凋亡等方面具有重要的研究意义，其主要是通过刺激或抑制相应的基因发挥作用。[14]孙仰峰等人2008年对牛IFN-α基因高效表达及纯化进行了研究。[15]张永红等人研究鲁西黄牛BoIFN-α基因，并获得了具有较高抗病毒活性的重组干扰素产物。[16]蔡进忠从我国环湖型牦牛和野牦牛基因组DNA中克隆了α干扰素基因，重组后的BoIFN-α基因对牛传染性鼻气管炎病毒具有一定的抑制作用。[17]Sweeney RW， Jones DE等人选取5只未受感染的成年荷斯坦奶牛，7只自然感染结核分枝杆菌的成年荷斯坦奶牛，屠宰时从每只牛体内取回肠和盲肠的淋巴结样品，运用逆转录-聚合酶链反应法测定IFN-γ和白细胞介素4在每个样品mRNA表达量。结果感染结核的牛IFN-γ基因的表达量显著高于未感染牛，因此，IFN -γ的表达量增加，可能会增强牛的抗感染性。[18]
2 抗病基因应用于动物抗病育种时可能存在的问题与前景展望
2.1 存在的问题
动物抗病能力的遗传机制很复杂，还有环境的影响也很大。病原微生物的遗传特性与宿主动物的关系也很复杂，同时对抗病性和易感性指标的测定也没有统一的规定，而且还缺乏用于选择的可靠性标记。研究表明抗病性性状是由微效多种基因所控制的，但基因之间还会存在相互的作用，单纯的使用某种标记辅助选择达不到全面性效果，基因工程育种虽然有很强的针对性，但成功率却极低，而且需要的花费也相当巨大，很难实现大规模的操作。[19]因此，单独应用某一种抗病育种技术都会呈现出很多方面的局限性，还有抗病性与生产性状之间存在着负相关作用，不同的疾病间也会存在拮抗作用，目前除了一些已知的疾病外，大多数疾病在抗性选择方面可以参考的数据还很少，抗病机理也不是很明确和清楚，这些问题也同样在制约和阻碍着抗病育种的发展和应用。
2.2 前景展望
抗病育种并不是育种的最终目的，还需要与动物的生产性能、疾病的生理学特征、流行病学、免疫机制等多方面的综合因素相结合考虑，才能产生最适合经济需要的效果。在目前畜牧业抗病育种的方法中，应当充分将常规的表型选择和标记型的辅助选择有效的结合起来，让两者的优势得到互补，有效的提高家畜机体的一般抗病能力和特殊抗病能力。[20]对此，应该将分子学技术与抗病基因结合，开展动物基因组的基础研究工作，采用现代生物学技术和转基因工程技术系统地对基因的结构和功能进行全面性的研究。随着抗病基因作用机制研究不断的深入，抗病育种进展缓慢的局面将会得到逐渐的改善，综合性抗病育种研究将对我国畜牧业发展产生巨大的推动力。
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【关键词】 TB-DNA；支气管灌洗液；结核
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.09.057 文章编号：1004-7484（2013）-09-4840-01
临床上菌阴肺结核病人因其临床症状及影像学不典型、多变且无特异性，容易误诊、漏诊，给临床诊断带来困难，为此我们对我院2009——2011年160例菌阴肺结核病人行纤支镜支气管肺泡灌洗液（BALF）中TB-DNA测定，探讨支气管肺泡灌洗液（BALF）中TB-DNA测定对菌阴肺结核的临床诊断意义。
1 资料和方法
1.1 临床资料 160例研究对象系我院2009——2011年住院病人，均为不明原因肺部阴影，既往无结核病史。均行纤支镜支气管肺泡灌洗液（BALF）中TB-DNA测定，男性90例，女性70例，年龄16-68岁，平均年龄42岁。分别为咳嗽、无痰及体检发现肺部阴影就诊，且不具备结核病临床表现，胸部CT可见阴影，均不在肺部结核病好发部位（如上叶尖后段、下叶背段），经6次痰涂片找结核菌阴性，PPD阴性，痰结核菌培养阴性，为明确诊断均行纤支镜检查，进行活检、BALF培养结核杆菌及BALF行TB-DNA定性测定。
1.2 方法
1.2.1 纤支镜取材及标本处理方法 纤支镜常规进行，依据胸部CT确定部位，纤支镜下观察气管、支气管情况，参照影像学所示的病灶位置，在相应的段或亚段TBLB夹取3-5块组织，用10%福尔马林液固定送病理检查，后再以37℃无菌生理盐水20ml分3次在相应的肺段灌洗，随后负压吸引，回收量应达30%以上。收集的BALF做结核菌培养及TB-DNA定性测定。
1.2.2 PCR法检测 试剂采用中山大学达安基因股份有限公司PCR检测试剂盒，仪器采用美国ABI-7500PCR分析仪器，操作步骤严格按说明进行。
1.3 病例诊断标准 刷检、术后痰涂片抗酸染色查结核菌、灌洗液结核菌培养、病理活检，至少1项阳性者，诊断为肺结核。
1.4 统计学方法 采用x2检验，P
2 结果
160例经纤支镜BALF培养结核杆菌（101/160）、BALF行TB-DNA测定阳性（131/160）的检出率分别是63.33%和81.67%，见表1，BALF行TB-DNA测定阳性率高于纤支镜BALF培养结核杆菌（x2=28.03，P
3 讨论
自20世纪80年代中期以来，结核病出现全球性恶化趋势，大多数结核病疫情很低的发达国家结核病卷土重来，众多发展中国家的结核病疫情出现明显回升，全球约有三分之一的人曾受到结核分枝杆菌的感染，每年有800-1000万新发病例及300万人死于该病，结核病再度成为危害人类健康的重大公共卫生问题，故早期诊断对结核病的防治意义重大。痰涂片抗酸杆菌和结核菌培养是目前诊断肺结核的金标准。涂片法简单、快速、经济，但灵敏性差，检出率低，通常5000-10000条菌/ml才能得到阳性结果，且不能将结核杆菌与其他分支杆菌区分开来[1]。培养法一般要4-8周，快速培养也要2周。这些均影响结核病的诊断和防治工作。要控制结核的发生和流行，准确及时地诊断结核病，对菌阴肺结核的诊断是重要的一环。但菌阴肺结核的诊断缺乏金标准[2]，其中大多数的诊断主要依据仍然是临床表现和影像学特征，误诊和漏诊现象时有发生，是结核病防治工作中的棘手问题。
1985年Mullis创建了PCR技术，1989年Hance等首先将该技术应用于检测分枝杆菌，从而开辟了以PCR为代表的分子生物学技术检测结核分枝杆菌阶段。PCR技术高灵敏度，高特异性，可检测1-100fg纯化结核分枝杆菌DNA，为菌阴肺结核患者的诊断提供了良好的前景。但由于常规PCR技术存在扩增产物污染带来的假阳性和不能定量的问题，使其难以发挥有效作用。本文使用的方法为荧光定量PCR（FQ-PCR）技术，其集PCR和DNA探针杂交技术的优点为一体，直接探测PCR过程中的荧光变化，获得DNA模板的准确定量结果。整个过程在闭管状态下进行，避免了因污染而导致的假阳性，使结果准确可靠，具有高敏感性、高特异性、高精确性特点[3]。李素华等[4]的研究显示使用实时荧光定量PCR法对临床192例各检样进行TB-DNA检测，其中脓液、肺泡灌洗液、痰液和胸水中的阳性率最高，分别达到47.4%、25.7%、30.4%、8.7%。本文显示支气管肺泡灌洗液结核DNA检测阳性率均高于纤支镜BALF培养结核杆菌及纤支镜活检阳性率，且由于BALF直接取自病灶处支气管肺泡内，细菌浓度高，污染几率低，且无痰患者也可以检测，使阳性率大大提高，从而进一步增加了PCR检测肺结核的敏感性和特异性，且行肺泡灌洗的病例纤支镜术后出血、气胸等的并发症低于纤支镜活检。
总之，支气管肺泡灌洗液直接取材于病变部位，通过纤支镜负压吸出，避免了其他菌的污染，准确性高[5]。检测肺泡灌洗液TB-DNA是快速诊断结核感染的一种方法，尤其是为菌阴肺结核的诊断和鉴别诊断提供了有力证据。但PCR不能区分死菌与活菌，对于治愈的肺结核，如果肺内有死的结核杆菌，PCR检测仍可为阳性，因此对病情的判断还应结合临床其他检查结果综合判断。
参考文献
[1] 张翊，卢建平，叶淼.四种结核分枝杆菌检测方法的临床应用评价.中国防痨杂志，2006，28（1）：14-17.
[2] 周林，成诗明，黄飞，等.县级结核病防治机构胸部X线诊断现状分析.中国健康教育，2006，22（8）：587-588.
[3] 韩俊英，曾瑞萍.荧光定量PCR技术及其应用[J].国外遗传学分册，2000，3（23）：117-120.
[4] 李素华，陈莉，王欢.荧光定量PCR检测TB-DNA在各类检样中的阳性率分析，2007，17（6）：752-753.
据记者了解，这十大进展经该学会联合体的18个成员学会推荐，并且各自在《科学》《自然》等国际知名期刊上发表相关论文，由生命科学领域同行专家审核与评选，是我国2016年在这一领域所取得的具有世界影响力的研究成果的集中展示。其中既有“植物雌雄配子体识别的分子机制”“线粒体呼吸链超级复合物的结构与功能”等基础研究的成果，也不乏“内源性干细胞介导功能性晶状体再生治疗婴幼儿白内障”等可治疗疾病的临床应用成果。
中国科协生命科学学会联合体十大进展（排名不分先后）内容如下。
植物分枝激素独脚金内酯的感知机制
植物激素调控植物的繁衍生息，与人类生存环境和粮食安全息息相关。独脚金内酯作为新型植物激素，调控植物分枝、决定植物株型、影响作物产量。清华大学谢道昕、饶子和及娄智勇等合作发现了独脚金内酯的受体感知机制，揭示了“受体-配体”不可逆识别的新规律，发现受体D14参与激素活性分子的合成和不可逆结合，进而触发信号传导链，调控植物分枝。这一发现丰富了生物学领域过去百年建立的配体可逆地结合受体并循环地触发传导链的“配w-受体”识别理论，为创立生物受体与配体不可逆识别的新理论奠定了重要基础，并对植物株型遗传改良和寄生杂草防治具有重要指导作用。该成果发表于《自然》杂志（Nature，2016 ，536：469-474）。
组蛋白甲基化修饰在早期胚胎发育中的建立与调控
组蛋白修饰对基因表达与沉默发挥重要调控作用，在早期胚胎发育过程中， 异常的组蛋白修饰会导致胚胎发育停滞。哺乳动物植入前胚胎全基因组水平组蛋白修饰的建立与调控是发育生物学领域一个亟待解决的科学问题。同济大学高绍荣团队首次利用微量细胞染色体免疫共沉淀技术揭示了H3K4me3和H3K27me3两种重要组蛋白修饰在早期胚胎中的分布特点以及对早期胚胎发育独特的调控机制，发现宽的H3K4me3修饰在早期胚胎大量存在并在基因表达调控和胚胎发育第一次细胞命运决定中发挥重要作用。该成果发表在《自然》（Nature，2016，537：558-562）杂志上，其意义为揭示了组蛋白修饰在植入前胚胎发育以及早期细胞分化过程中的特异性调控模式，对研究胚胎发育异常、提高辅助生殖技术的成功率具有重要意义。
基于胆固醇代谢调控的肿瘤免疫治疗新方法
T细胞介导的肿瘤免疫治疗是治疗肿瘤的重要武器，在临床上已取得了巨大的成功。但现有的基于信号转导调控的肿瘤免疫治疗手段只对部分病人有效，因此急需发展新的方法让更多的病人受益。中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所许琛琦、李伯良与合作者从代谢调控这一全新的角度去研究T细胞肿瘤免疫反应。鉴定了胆固醇酯化酶ACAT1是调控肿瘤免疫应答的代谢检查点，抑制其活性可以增强CD8+ T细胞的肿瘤杀伤能力。同时发现ACAT1抑制剂Avasimibe（辉瑞公司开发的用于治疗动脉粥样硬化的药物，进行了III期临床试验），具有很好的抗肿瘤效应，并且能与现有的临床药物PD-1抗体进行联合治疗。该项研究开辟肿瘤免疫治疗研究的一个全新领域；同时发现ACAT1这一药物靶点及其小分子抑制剂的应用前景，发展了新的肿瘤免疫治疗方法。该研究在《自然》（Nature，2016，531：651-655）杂志上。
内源性干细胞介导功能性晶状体再生治疗婴幼儿白内障
中山大学中山眼科中心刘奕志教授带领团队，历经18年研究，发现了晶状体上皮干细胞；为了利用干细胞的再生潜能实现组织修复，设计并创建了一种新的微创白内障手术方法，保留了自体晶状体干细胞及其再生的微环境，长出了功能性的晶状体，已用于临床治疗婴幼儿白内障，提高了患儿视力，降低了并发症。该研究不仅为白内障治疗提供了全新的策略，也首次实现了自体干细胞介导的实体组织器官的再生，开辟了组织再生及干细胞临床应用的新方向。在《Nature》杂志（Nature， 2016，531：323-328）。
MECP2转基因猴的类自闭症行为表征与种系传递
中国科学院上海神经科学研究所仇子龙研究员等通过构建携带人类自闭症基因MECP2的转基因猴模型及对MECP2转基因猴进行分子遗传学与行为学分析，发现MECP2转基因猴表现出类人类自闭症的刻板行为与社交障碍等行为。此研究首次建立了携带人类自闭症基因的非人灵长类动物模型，为深入研究自闭症的病理与探索可能的治疗干预方法提供了重要基础。
在该研究中，研究人员通过精巢异种移植，将幼年食蟹猴的精巢移植到裸鼠的背部，实现了食蟹猴精巢提早成熟，并利用移植精巢组织内生成的成功获得了健康的F1代MECP2转基因食蟹猴后代。该工作加速了食蟹猴的生成速度，缩短了食蟹猴的繁殖周期，对于推动非人灵长类动物模型的应用具有重大意义。该研究成果发表于《自然》（Nature， 2016，530：98C102）杂志上。
线粒体呼吸链超级复合物的结构与功能
呼吸作用是生命体最基础的生命活动之一，由位于线粒体内膜的氧化磷酸化系统完成，为细胞提供能量。人类线粒体呼吸链氧化磷酸化系统异常会导致多种疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、少年脊髓型共济失调以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症等。哺乳动物呼吸体是由包括44个膜蛋白在内的81个蛋白亚基（69种不同蛋白分子）所构成的分子量高达1.7兆道尔顿的超级膜蛋白分子机器。清华大学杨茂君研究组先后在《自然》（Nature， 2016， 537： 639C643）和《细胞》（Cell， 2016，167：1598C1609）杂志发文，报道了呼吸链超级复合物结构。该结构是目前所解析的最复杂的非对称性膜蛋白超级分子机器的结构（图A，B），为进一步理解哺乳动物呼吸链超级复合物的组织形式、分子机理，以及治疗细胞呼吸相关的疾病提供了重要的结构基础。
活性RAG型转座子的发现揭示抗体V（D）J重组的起源
以免疫记忆与疫苗产生为核心的人类适应性免疫的关键机制就是RAG介导的抗体重排，所以，RAG基因的起源一直是免疫形成揭秘的关键问题。为此，诺贝尔奖获得者利根川进（Tonegawa）1979年提出了转座子起源假说，此后围绕RAG的起源与功能，展开了激烈的学术争论，直到该成果发表前， 转座子起源假说并未得到证实，成为免疫学一个经典谜题。
北京中医药大学徐安龙研究组以有活化石之称的文昌鱼为研究对象，发现了具有介导V（D）J重排功能的原始RAG转座子，证实了利根川进的假说。该发现不仅改写免疫教科书中关于适应性免疫起源的观点：将适应性免疫的起源由脊椎动物推前近1亿年到无脊椎动物，而且可能为未来利用重排机制设计新的免疫抗体/基因提供湫碌幕因编辑思路和技术。相关研究在《细胞》 [Cell166（1）：102―114，2016]上。
植物雌雄配子体识别的分子机制
受精需要和卵细胞的结合，而能否被及时传递到卵子是受精的关键。在被子植物中，是通过花粉管来传递的，但花粉管是如何将传递到卵子的呢？这一问题是植物生殖生物学几十年来关注的主要问题之一，这个过程也是植物生殖隔离及物种多样性维持的重要因素之一。中科院遗传发育所杨维才研究组首次分离了拟南芥中花粉管识别雌性吸引信号的受体蛋白复合体，并揭示了信号识别和激活的分子机制。通过转基因手段将其中一个信号受体导入荠菜中，并与拟南芥进行杂交，转基因荠菜的花粉管识别拟南芥胚囊的效率得到明显提高。该研究通过基因工程手段建立了利用关键基因打破生殖隔离的方法，为克服杂交育种中杂交不亲和性提供了重要理论依据。
该研究成果发表在《自然》杂志上（Nature， 2016，531：241-4）。
tsRNAs可作为记忆载体介导获得性性状跨代遗传
研究发现父亲的某些获得性性状，如饮食诱导的代谢紊乱，可通过表观遗传的方式“记忆”在中并遗传给下一代，这对人类健康和繁衍具有深远的影响。中国科学院动物研究所周琪、段恩奎与上海生命科学研究院营养科学研究所翟琦巍研究员合作团队基于父系高脂饮食小鼠模型，发现中一类来源于tRNA的小RNA （tsRNAs） 在高脂饮食下表达谱和RNA修饰谱均发生显著改变，且将高脂小鼠中的tsRNAs片段注射到正常受精卵内可诱导F1代产生代谢性疾病。tsRNAs进入受精卵后可导致早期胚胎及后代小鼠胰岛中代谢通路基因发生显著改变。本研究从RNA角度，为研究获得性性状跨代遗传开拓了全新的视角，提出tsRNAs是一类新的父本表观遗传因子，可介导获得性代谢疾病的跨代遗传。文章发表后被国际重要刊物广泛引用和评价，也引起国际各大媒体的关注。该在《科学》（Science，2016，351（6271）： 397―400 ）上。
埃博拉病毒入侵机制研究