核酸检测方法范文

核酸检测方法篇1

关键词：抗酸染色；结核抗体；荧光定量PCR；结核分枝杆菌

相关医学文献报道，结核病多是由结核分支杆菌感染引起的，强化临床结核杆菌检测，可以有效确诊疾病，并提升临床结核杆菌检测水平[1]。本研究对近年医院收治30例结核病患者以及30例非结核呼吸系统疾病患者，分析荧光定量PCR与抗酸染色、结核抗体检测结核分枝杆菌结果。

1 资料与方法

1.1一般资料 针对在医院2014年1月～2015年1月收治30例结核病患者以及30例非结核呼吸系统疾病患者，患者均知情同意。患者年龄在50～80岁，平均年龄为（66.5±10.3）岁；可以根据检测方法的不同，将其分为研究组（60例）、观察组（60例）、对照组（60例）。

1.2方法 收集30例研究对象的呼吸道病原菌，呼吸道痰标本、上呼吸道咽拭子、支气管镜下抽吸灌洗液。同时，对照组检测中，应用结核抗体检测方法，以清晨的痰取样，直接涂厚片抗酸染色，应用显微镜下观察，做出检测。

观察组检测中，应用荧光定量PCR检测方法，可在患者痰标本中加入1MNaOH溶液混匀，使其液化后，取标本于试剂盒中，进行洗涤沉淀得到扩增的模板，并将其放置在PCR的反应管之中，在其中加入反应液、lUNG、Ll Taq酶、2Ll模板，可以把反应管放置在BIO-RAD iCycler荧光定量PCR检测仪之中，进行结核分枝杆菌检测。

研究组检测中，应用抗酸染色，并可取患者静脉血，分离血清，并结核抗体检测塑料板块中，加入患者血清标本50Ll，然后在清洁无油的玻片上涂开，等到涂片自然干燥之后，可以用片夹挟住玻片一端，以火焰固定，在涂抹面盖上滤纸片，并滴加石炭酸复红染液，确保滤纸片被完全染液浸湿，将试验玻片在小火上加温后，玻片冷，可以滴加3%的盐酸酒精脱色，并滴加30s吕氏美蓝染液，进行水洗，在吸干后进行镜检；其检测结果以阴、阳性表示。

1.3统计处理 针对本次的研究结果，应用统计SSPS20.0版本软件进行结果处理，其中对于计数资料用率来表示，进行χ2检验，且以结果P

2 结果

经研究组抗酸染色检测，结核抗体检测法特异性达到100%；经χ2检验后，在对照组、观察组中，其检测结核抗体特异性低于研究组抗酸染色检测法，有明显差异（P

3 讨论

研究指出，临床中应用痰涂片抗酸染色镜检测结核分枝杆菌，其得到的阳性率较高，在抗酸染色之中，针对多种群痰细菌数量检测，可以避免造成假阴性，提升检测阳性率[2]。并且，由于不同人群机体免疫力存在差异，应用抗酸染色检测，可以检测结核分枝杆菌[3]。本次研究中，研究组应用抗酸染色检测法，其特异性高达100%，结核分枝杆菌检测中，较对照组与观察组比较有显著差异（P

荧光定量PCR检测，作为Perkin Elmer公司研制的核酸定量技术，具有高灵敏性、重复性高的特点，其基本的原理，可以在PCR反应体系之中，设计特异性引物，并可在引物的3c端设计双荧光标记探针，构成能量传递。荧光定量PCR检测结核分枝杆菌，其采用密封系统，虽然可以扩增PCR[4]，但是结核分枝杆菌检测中，该方法成本较高。

结核分枝杆菌检测中，由于苯胺染料一般不易使结核分枝杆菌着色，应用抗酸染色方法，在通过加温以及延长染色时间使结核分枝杆菌着色后，应用3%盐酸酒精处理结核分枝杆菌也不易脱色，并且经抗酸染色后，结核分枝杆菌会呈红色，对于非抗酸菌以及细胞杂质就会呈蓝色，易于检测[5]。在结核分枝杆菌检测中，应用抗酸染色，能够有效清除样本干扰，提高检测结果的灵敏度，减少误差，临床检验效果更稳定。

本研究结果充分证实，针对临床结核分枝杆菌检测中，应用抗酸染色技术，敏感性高、特异性强，效果要好于荧光定量PCR、结核抗体检测，值得在实际中推广。

参考文献：

[1]方梅，陆巧荣，洪志强，等.分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其临床应用[J].四川大学学报（医学版），2010，41（1）：162-165.

[2]崔金环，杨光，苏锡康，等.荧光定量PCR技术检测石蜡包埋组织结核杆菌DNA的应用评价[J].广东医学，2011，32（20）：2695-2697.

[3]徐菊玲，徐伯赢，周洪昌，等.结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立[J].中国公共卫生，2011，27（10）：1250-1552.

[4]杨长绍，王丽，潘鑫艳，等.荧光定量PCR检测石蜡组织中结核分枝杆菌[J].临床与实验病理学杂志，2014，30（3）：321-323.

核酸检测方法篇2

[关键词] 分枝杆菌； 结核； 蛋白芯片； 诊断

[中图分类号] R52 [文献标识码] A [文章编号] 1005-0515（2011）-12-239-01

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病。全身各器官均可发生，但以肺结核最为多见。其病变特征是结核结节形成并伴有不同程度的干酪样坏死。结核病是一个严重威胁人类健康的疾病。全球现有活动性肺结核病人约2000万，其中95%在发展中国家。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患者人数居全球第二位。

早期结核病患者往往仅有低热、乏力、消瘦等一般性症状，特别是目前发病率越来越高的肺外结核，如肝结核、胰结核、肾结核、腹膜结核、骨结核等等，使传统的结核病诊断手段例如X-光检查、痰液微生物学检查等变得苍白无力，使大量结核病患者未能被及时诊断而延误了治疗时机，这是目前结核病死亡率急剧增高的重要原因。因此对临床上不明原因发热(热待查)或不明原因消耗性症状患者应警惕肺外结核的可能。常规地对上述就诊者群体进行结核抗体血清学检测，将能及时有效地检出这些患者，使他们及早得到治疗，是广大医务人员和结核病患者的迫切需求。

目前肺结核经典的诊断方法主要有：痰涂片、培养法、皮试法，有的时间长、有的检出率低，因此WHO要求世界各国进一步开发新的体外诊断方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 322例确诊为肺结核的患者血清和痰标本均来自于我院内科(肺结核科)疗区，男184例，女138例，年龄11-82岁间。

1.1.2 主要仪器和试剂 蛋白芯片检测仪、结核分枝杆菌蛋白芯片试剂盒均来自于南京大渊生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 抗酸菌涂片染色镜检法 ①染色方法：涂片自然干燥后放在染色架上；滴加石碳酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持5分钟，染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染液，加温时勿使染液沸腾；用流水冲去染色液，沥去标本上剩余的水；自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色3min，如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止；流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水；滴加亚甲蓝复染液，染色30s；流水自玻片一端轻缓冲洗冲去复染液，沥去玻片上剩余的水，待玻片干后镜检。②把通过抗酸菌染色后的玻片放在100×油镜下观察，结果报告标准如下：镜检100个事业内找到抗酸杆菌3-9条者，报告抗酸杆菌阳性(1+)；镜检10个视野内找到抗酸杆菌1-9条者，报告抗酸杆菌阳性(2+)；镜检每个视野内找到抗酸杆菌1-9条者，报告抗酸杆菌阳性(3+)；镜检每个视野内找到抗酸杆菌多于9条以上者，报告抗酸杆菌阳性(4+)；镜检300个视野未发现抗酸杆菌者，报告抗酸杆菌阴性(-)。

1.2.2 蛋白芯片法

1.2.2.1 检测原理 结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒(蛋白芯片)由芯片和试剂两部分组成。芯片以微孔滤膜为载体，同时将结核菌的特异性细胞壁脂多糖抗原LAM和经基因工程重组DNA技术生产纯化的结核菌16kD和38kD特异性抗原固定在特制的载体上，利用微孔滤膜的浓缩、凝集、渗滤作用，捕捉被检样品异性抗体，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，复合物再与胶体金标记的抗人IgG作用，在膜上形成紫红色的斑点。最后通过生物芯片识别仪进行结果分析。本品分别测定抗结核菌的特异性细胞壁脂多糖LAM抗体、16kD抗体和38kD抗体，如一种抗体阳性，则判断该患者抗结核分枝杆菌抗体阳性。判定结果用于结核菌感染的临床辅助诊断。

1.2.2.2 标本要求 静脉血清，体积不少于150μl；溶血样本和高脂血样本不宜；新鲜血样在2℃-8℃环境下存放不要超过48小时；长期保存的样本应在-20℃以下冻存，避免反复冻融。

1.2.2.3 检验方法 ①在芯片上标记好样品编号。②在芯片盒窗口内滴加200μl试剂A，使膜表面完全浸湿。③待完全渗入后，室温放置一分钟，加待检血清100μl。④待血清完全渗入后，及时滴加300μl试剂B。⑤待试剂B完全渗入后，滴加500μl试剂C。⑥待试剂C完全渗入后，最后滴加300μl试剂D。⑦反应完毕后，把芯片盒内的小光盘放入光驱，检测仪会自动进入“生物芯片检测软件”，然后按程序进行操作，由仪器打印出分析结果。

结核分枝杆菌蛋白芯片法试剂盒检测抗酸杆菌三种特异性抗体，即抗脂阿拉伯甘露醇(LAM)，16KDa及38KDa抗体。如果有一种抗体检测结果为阳性，则结果可判定为阳性；如果三种抗体检测结果均为阴性，则结果判定为阴性。整个检测过程不超过30min。

2 结果 1)抗酸涂片染色检测322例中，检测出抗酸杆菌阳性者为82例，其阳性检出率为25.5%，其中男性有208人，女性为114人。(1+)的有27人，占总阳性率的27/82为32.9%；(2+)的有39人，占总阳性率的39/82为47.6%；(3+-4+)的有16人，占总阳性率的16/82为19.5%。2)结核分枝杆菌蛋白芯片法，检测322例：检测出阳性者为188例，占总的阳性检出率的188/322为58.4%。以上三种结核菌抗原的抗体阳性率以抗LAM抗体的阳性率为最高162/188为86%，38KDa为130/188为69.1%，16KDa为40/188为21.3%，LAM、38KDa、16KDa均为阳性占18/188为9.6%。

3 讨论 结白芯片是利用结核菌的特异性细胞壁脂多糖抗原LAM和经基因工程重组DNA技术生产纯化的38KDa及16KDa特异性抗原固相于同一膜片上，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，再以免疫金作为标记物在膜上显色用于结核病的临床检测。

LAM是分支杆菌属细胞壁的重要组成部分，属特异性抗原，具有较强的免疫原性，其检测的灵敏度较高，但除结核分枝杆菌外，其它分支杆菌也有LAM成分，因此其特异性相对较低。结核分枝杆菌的38KDa抗原和16KDa抗原是结核分枝杆菌所特有的抗原，它与其它非结核分枝杆菌不存在交叉反应，它诊断的特异性较高，而灵敏度较低。从以上结果可以看出，结核分枝杆菌蛋白芯片法检测结核的灵敏度为58.4%，较抗酸菌涂片法25.5%的灵敏度高一倍以上。

在结核病的临床诊断方法中，抗酸染色结果具有简便、快速、特异性高的优点，是目前最主要的结核确诊手段。但其阳性率较低，大约在25-35%，存在着65-75%涂片阴性或培养阴性可疑结核病的诊断问题，从结果可见，结核分枝杆菌蛋白芯片法阳性检出率为58.4%，显著高于抗酸菌镜检法25.5%，这表明蛋白芯片法结核抗体的检测对于不排痰的结核患者涂片镜检阴性的结核病人有重要意义，能显著提高检测灵敏度，使结核病患者早日诊断。

核酸检测方法篇3

关键词 核酸适体； 荧光； 汞离子； 检测

1 引 言

重金属元素的定性与定量检测在环境监测、废弃物管理、发育生物学及临床毒理学等领域中具有很大的应用价值，而目前重金属元素的检测主要采用光谱法，包括原子吸收光谱[1]、原子发射光谱法[2]、电感耦合等离子体质谱法[3]以及电化学法等方法[4，5]。但这些方法依赖于大型仪器和专人操作，并且需要繁琐的样品预处理和浓缩过程，在现场和野外检测中受到限制。因此研究无污染、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法进行微量金属离子的检测十分必要。

近年来，随着分子生物学的发展以及核酸适体的筛选应用，特别是SELEX技术的应用，已经获得对金属离子（如Ca2+， Zn2+， Ni2+等）具有活性的核酸适体[6～8]，以及基于核酸适体所建立的各种检测方法[9，10]，包括荧光法、电化学法和比色法等。本研究利用已公开发表的金属离子适体进行改造应用，建立更加简便、快速、灵敏的检测方法。

通过对Ni2+的RNA适体进行改造，期望获得两条原本针对Ni2+起作用的DNA适体，即DNA1-B（N1）。但实验表明，N1对Ni2+不起作用，对Hg2+却有较强的结合作用[8]。核酸适体标记有荧光基团FAM，再与标记有荧光猝灭基团DABCYL的一段互补序列结合，通过加入Hg2+与互补序列竞争结合适体而引起的荧光信号变化，可定量分析Hg2+[11，12]。据此可设计出多种寡核苷酸的Hg2+检测方法，如荧光信号转换法[12，13]、胶体金检测法[14]、荧光染料法[15]；但均是采用核苷酸链中的胸腺嘧啶（T）可与汞配位的原理构筑器件，其核苷酸一级序列单一，二级结构简单甚至无二级结构。本研究表明，与Hg2+有作用的适体N1与此前所使用的多数适体结构不同；对N1序列和结构进行改造，得到与Hg2+作用更灵敏的新适体N5。本方法只需将样品简单处理直接加样反应即可，且样品用量少，适用于实际样品中Hg2+的检测。

核酸检测方法篇4

关键词：酸雨；观测；考核

中图分类号： X517；P412.13 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/ki.jlny.2015.05.061

1 宜春市酸雨考核情况

酸雨是指因人类活动导致区域降水pH值小于5.60的大气降水，它对公众健康、工农业生产、生态环境以及全球气候变化都有着重要的影响。

2006年7月1日，宜春市基准站就开展了对酸雨的观测。从2007年第一次全国酸雨观测样品质量考核开始至 2014 年，每年都参加由中国气象局气象探测中心组织，中国气象局气象探测中心大气成分观测与服务中心负责实施的酸雨考核，至今一共参加了7次。根据《酸雨观测业务规范》规定的方法和标准，中国气象局对各酸雨观测站测量的水样pH值和K值按照优秀、合格和不合格3个等级。从这7年公布的通报来看，宜春市观测站酸雨考核样品 pH 、K值测量全为优秀，纯水测量除2008年为合格外，其他6年为优秀（酸雨观测站报告的水样pH值和K值在标准值±1倍标准差范围内得5分，在标准值±2倍标准差范围内得4分，在标准值±3倍标准差范围内得3分，超出3倍标准差者得0分。选取3个水样的考核评分中2个高分，累计为9或以上的，考核成绩为优秀，累计为6～8分的，考核成绩为合格，累计5分以下含5分的为不合格。纯水K值符合《酸雨观测业务规范》规定要求即不大于10μS/cm的，考核成绩为合格；纯水K值低于5μS/cm，考核成绩为优秀；大于10μS/cm的为不合格）。

2酸雨考核准备工作注意事项

2.1准备工作注意事项

酸雨观测质量样品考核要按照《酸雨观测业务规范》要求，在一周内完成水样的测量，并测量本站所用纯水的电导率，将测量结果和相关信息填入随水样下发的酸雨观测质量样品考核报告单中。所以台站在收到全国酸雨观测质量样品考核时候通知，要做好考核的准备工作，检查仪器工作状态，并注意要及时查收考核样品。台站接收水样后，可将水样冷藏箱内保存，并尽快组织考核水样的测量，以为防止微生物滋生导致水样变质。

2.2测量器皿的洗涤

测量使用的玻璃器皿，要按照先用自来水刷洗，再用6米的盐酸浸泡24小时，然后用自来水冲洗干净后用纯水涤荡的步骤进行洗涤，洗涤后检查洗涤效果（将洗涤后的玻璃器皿倒置，检查水流出后器壁不挂水珠）检查完后将洗净后的器皿置于无尘处倒置在洁净滤纸上，自然干燥。

2.3 纯水和溶液的配制

在酸雨观测中常用的有纯水、标准缓冲溶液（邻苯二甲酸氢钾、混合磷酸盐）。常用的纯水制备方法有蒸馏法、离子交换法、过滤法等，但台站受条件限制一般采用购买的方法，从这几年使用的情况来看，纯水最好的是屈臣氏蒸馏水，所测得的K值稳定在2.00μs/cm以下，远低于规范要求的纯水K值；配制好的标准缓冲溶液理论上可以保存、使用3个月，但在考核时最好按配制标准缓冲溶液方法和步骤，现配现用。

3样品测量时的注意事项

酸雨样品的考核是台站测量水样样品的pH值与K值数据与标准值的标准差，同时检查台站所用纯水的K值是否符合要求。为做到测量数据准确，在测量时应做好以下几项工作。

3.1保证测量仪器所使用的电极在有效检定期内

规范上，规定复合电极的有效使用时间只有1年，超过使用时间的复合电极应及时更换；电导电极使用期为2年，到期必须更换。但在全国酸雨观测质量样品考核工作中最好对这两种电极进行更换，并按要求将新的复合电极浸泡在纯水中进行24小时以上活化。电导电极要注意检查标有电极常数的标签标示是否清楚，没有标签或不清楚的，不能进行业务使用。

3.2测量中的注意事项

在考核中要严格按照测量步骤对样品的pH值、K值进行测量。按规范要求样品的温度与校准所用标准缓冲溶液温度的温差要小于2℃，测量时要注意及时将考核样品取出。在操作过程中电极探头要完全浸泡在样品中，注意不要与玻璃器皿壁或底部碰触，轻轻摇晃杯子检查示值的稳定，待示值稳定后读数，如果读数不稳可延长读数的时间，但一次读数等待时间不超过2分钟。

3.3对测量的样品数据进行必要的复测

酸雨考核每个水样为100毫升，按照规范先测pH值再测量K值的方法只能测量一次，但按照先测K值再测pH值顺序可以满足台站2次的测量，所以台站在测量时可先由一人按照先测K值再测pH值方法测量一次，再换一人按照先测K值再测pH值方法再测量一次，2次测量的数据可进行对比分析。

3.4报告单的填写

观测站在填写酸雨观测质量样品考核报告单时，首先要认真阅读考核报告单中表格下面的注释说明，填写报告单时要做到数据真实，字迹清楚，无缺漏项，并在考核报告单抬头处加盖本站公章；避免因缺漏数据项，按要求加盖公章等填写原因影响考核成绩并按考核要求及时寄出考核报告单（中国气象局气象探测中心大气成分中心酸雨组收集各站报送考核报告单的最后截止日期是大气成分中心酸雨组收到考核报告单的日期，不是台站寄出考核报告单的日期）。

4结语

每年的全国酸雨观测质量样品考核工作既是中国气象局业务主管部门对台站酸雨观测仪测量精度的检验，也是对观测员测量分析能力及操作规程把握程度的综合测试，台站只有平时严格按规范来操作，注重日常酸雨观测工作细节，认真对待每一次样品测量，才能保证在考核时的数据准确。

参考文献

[1]中国气象局.酸雨观测业务规范[M].北京：气象出版社，2005.

核酸检测方法篇5

[关键词] 血液中心；核酸标本；运输与保存；冰源

[中图分类号] R446.11 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）07-128-03

The method and effect analysis of cold chain transportation of

nucleic acid sieve

YAO Junqing YE Huifen

Dongguan Blood Center， Dongguan 523000， China

[Abstract] Objective To investigate the ways and effects of blood sample cold chain transportation preservation in the blood center. Methods According to the requirements of Blood Stations Technology Operation Procedures （2015 edition）， the holding time of the samples in the transport cases （the time of samples transport temperature holding between 2 to 10℃） were tested by different preservation methods， simulated the condition of transportation by vehicles. The samples were divided into three groups. The first group were used one piece of cold source plate at the bottom of the transport cases .The second groups were used three pieces of cold source plate， one piece were placed at the bottom， and the others were placed at two sides selected randomly. The third groups were used five pieces， one placed at the bottom， and the others were placed at each side. Results To simulate the condition in vehicles with air condition to regulate the temperature of a laboratory to 23-27℃， humidity to 30%-70%，the holding time in the first， the second and the third groups were （0.16±0.02）h、（6.16±0.37）h and （13.78±0.71）h， respectively. There was significant difference between the two groups （F=2197.474， P

[Key words] Blood center； Nucleic acid samples； Transportation and preservation； Cold source.

目前我血站输血相关传染性疾病的血液筛查普遍采用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法，该方法的灵敏度和特异性虽然在不断地改进和提高，但由于方法学本身的局限性，感染者“窗口期”献血、病毒变异、隐匿性感染及其他因素仍然可能引起输血后HBV、HCV和HIV等病原微生物感染[1]。核酸扩增检测技术（nucleic acid amplification technologies，NAT）可以缩短病毒特异抗原和抗体免疫测定的“窗口期”[2-3]，是提高血液安全的有效措施[4-7]。但是核酸检测与ELISA相比在检测过程的各个环节上均有其特殊之处，这些环节若缺乏严格的质量控制，会导致血液核酸检测结果不准确。

根据《血站技术操作规程（2015版）》中标本运输的规定，核酸标本的运输温度要求为2～10℃[8]，核酸标本的保存温度和时间会对标本的检测结果产生一定的影响[9]。为了保证核酸标本的质量，满足核酸检测的要求，本研究探讨了东莞市中心血站的核酸标本运输与保存的效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本运输箱

采用深圳市淳德科技有限公司生产的专用标本运输箱，型号：LX-25A，外尺寸：400mm×310mm ×360mm，内尺寸：340mm×250mm×300mm。

1.2 冷源板

采用深圳市淳德科技有限公司生产的冷链专用4℃冷源板（又名冰盒），规格：263mm×183mm×23mm，预先放置于-30℃低温冰箱冷冻保存10～24h，保证内部完全结冰，使用前在室温下解冻1～3min。

1.3 核酸标本

采用BD Vacutainer一次性使用真空静脉血样采集容器采集标本，而本研究采用本站已经超过国家要求保留时间，需要销毁的核酸标本，标本按照要求，保存在标本专用冰箱里，保存温度在2～8℃。标本血容量符合采血管标注的采集量，即5mL，无严重溶血、脂血、黄疸、凝血、渗漏、稀释。标签条形码清晰，无血渍、无划痕，粘贴符合要求，标本血浆和红细胞被分离胶隔离。

1.4 温度记录仪

选择Elitech RC-5 U盘温度记录仪（江苏精创电气股份有限公司），温度检测范围-30℃～+70℃；精度±0.5℃。RC-5 U盘温度记录仪在使用之前经过华南国家计量测试中心广东省计量科学研究院计量校准。校准合格后使用。该温度记录仪设定每1min自动记录一次温度。

1.5 温度监测方法

第1组：标本运输箱底部放置一块4℃冷源板；第2组：标本运输箱底部放置一块冷源板，四周随机选取两面各放一块冷源板，共三块冷源板；第3组：标本箱底部放一块冷源板，四周各放一块冷源板，共五块冷源板。

冷源板放进标本箱后，监测标本箱内温度，直到标本箱内温度低于10℃，放入核酸标本50支，标本和冷源之间用隔离网垫隔开，开始监测箱内温度变化。

Elitech RC-5 U盘温度记录仪设定每1min自动记录一次温度，直到标本箱内温度超过10℃，三组方法各监测10次，读取记录标本箱温度在2～10℃的保温时间，最后导出数据整理结果。

1.6 环境要求

模拟运输标本的血液运输车环境，调节室内温度和湿度，保持室温在23～27℃，湿度在30%～70%。

1.7 统计学方法

选择SPSS17.0软件进行分析，计量数据选择（）表示，三组整体对比采用方差分析，两组比较采用t检验，P

2 结果

2.1 核酸标本检查

RNA易受外界h境的影响，标本保存过程中不能发生溶血等现象，观察放在三组标本运输箱中的核酸标本外观，上清液清亮无重度溶血，重度脂血，黄疸，稀释等，符合接收要求。

2.2 三组标本运输箱的保温时间比较

第1、2、3组标本运输箱保温时间（即箱内温度在2～10℃范围内的时间），第3组和第2组明显长于第1组，结果见表1。

3 讨论

随着我国对采供血工作的重视，社会对输血安全的关注程度越来越高，各种相关法律、法规与标准相继出台，这对血站的管理提出了更高的要求[10]。冷链是一套用于血液和检测标本储存和运输的系统，冷链管理要为血液质量和标本检测结果有效性提供保障，其中核酸标本的运输和保存直接影响标本质量和检测结果，是冷链管理的一个关键控制点。

由于核酸检测对象的特殊性，即检测的靶核酸DNA、RNA不稳定、极易降解，在核酸检测中，标本的采集、运输和保存对检验结果有决定性的影响[11]，核酸检测结果的可靠性有赖于采集足量的样本和正确的运输。有研究表明[12]，标本在室温放置一段时间后，病毒的检出率较存放于4℃环境时，有一定比例的下降，所以一般要求样本在4℃保存条件下6h内进行检测，然而现行常规采血流程使血站各采血点的标本在当天晚上才能送达实验室，从采集到检测，中间相隔11～12h，其中运输时间约为2～3h，难以满足上述要求，在此情况下，为保证标本质量，运输和保存的冷链非常重要。

本研究显示，第1组标本运输箱保温时间为（0.16±0.02）h，没有达到运输时间2～3h的要求，所以我们不能采取放置一块冰源的方法来运输核酸标本；第2、3组标本运输箱保温时间分别为（6.16±0.37）h和（13.78±0.71）h，两两比较差异均有统计学意义（P

核酸标本的运输与保存对于检测结果的可靠性具有重要的意义，不过我国很多血站很少采用全程的温度监控设备来自动进行温度记录，温度监控记录和核酸标本交接记录大多为人工填写，血站对于核酸标本的运输缺少有效的监督和管理机制，冷链上并没有形成完善、真实的一体化管理。因此，在核酸标本的运输与保存冷链管理对策中，要根据《血站核酸检测实验室质量控制指南》和自身的采血流程制定一系列措施。标本在采血现场保存在血液专用保存冰箱内，温度控制在2～6℃范围内，采集后的标本在4h内实施离心，分离红细胞和血浆；参考国内外经验，利用移动式温度监控设备进行连续自动全程监控[13]；同时尽量缩短运输时间，合理规划路线，做好标本交接工作，并记录时间和温度等原始数据。

本次模拟测试使用专用标本运输箱和4℃冷源板来运输和保存标本，是因其性能稳定、密封性较好，既能保证标本运输和保存的温度要求，又能满足防水、防破损、防外泄、易于消毒处理等生物安全要求，值得在血站推广应用[14]。当然，由于国家没有统一要求，全国各地血站的具体情况不同，大家使用的运输箱和冷源各不相同，也曾有报道应用自行研制的标本运输箱能满足核酸标本运输的要求，而且取得很好的保温效果[15]，因此各地血站可以根据自身的采血模式、当地气候和环境以及标本运输和保存的实际需求制定适合自己的标本冷链管理。总之，核酸标本的保存和运输要求非常严格，正确的标本保存对于检测结果准确性意义重大，为此笔者认为要对冷链管理进行不断改进，确保核酸标本的质量，从而为临床用血提供安全保障。

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核酸检测方法篇6

输血相关传染病的预防和控制已成为全社会关注的焦点，随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性大大降低，目前酶免疫检测(ELTSA)技术已经广泛应用于血液筛查，但每年仍有少量新发输血后肝火病例报道，如美国无偿献血者每单位供血传播HBV的危险性为1／6.3万。这些危险主要来自病毒感染者“窗口期”献血、病毒变异、低病毒载量感染及人工操作失误等，其中“窗口期”漏检是影响血液安全性的主要问题。核酸扩增技术(NAT)可直接检测病毒核酸，大大缩短病毒ELISA检测的窗口期及检出变异株，发达国家已陆续将其纳入献血者的常规筛查项目，并取得一定的成效。但由于进口 NAT试剂成本很高，取制了该技术在我国血液常规筛查中的推广应用。为了进一步提高血液的安全性，降低血液核酸筛查的成本，笔者尝试将国产NAT试剂应用到血液HBV DNA筛查中，并对在献血者HBV DNA检测中建立一套适合中国国情的筛查检测体系的可行性进行了探讨。

1 材料和方法

1.1材料

RSP-200(瑞士TECAN)及STAR2000全自动上海加样仪(瑞士HAMILTON)，Microlab FAME(瑞士HAMILTON)和DADE Behring全自动酶免分析仪(德国DADE)，KHB-DP1000磁珠分离仪(上海科华)，MJ Opficon2核酸扩增检测仪(美国Biorad)，专用耗材-96Plate，专用耗材-96Tip Comb，核酸提取试剂盒(上海的华)，HBV检测试剂盒，HBV DNA国家标准品(卫生部临检中心，浓度3600IU／ml)， HBsAgELISA国产试剂(上海科华)和进口试剂(美国Abbott)，乙肝两对半试剂(厦门新创)。

1.2检测对象

2008年8月～2009年12月无偿献血者标本共9239份。NAT筛查的标本用真空EDTA抗凝留取血样5ml，于8h内分离血清。

1.3血液的ELISA常规检测

所有标本均经乙肝金标试纸条和ALT试纸条筛查合格后，再进行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV国产和进口试剂两遍ELISA筛查及梅毒、ALT检测。

1.4标本的汇集

将采集的5mlEDTA抗凝的全血室温离心3min(3600g)，保存2～4℃冰箱中，待血液标本ELISA常规筛查合格后，应用STAR2000，启动全自动汇集程序，按试剂盒要求进行8人份标本汇集，将每个汇集池的标本知码文件储存并输出以备追溯和确认使用。若汇集样经检检测为阳性，进行单个标本检测，以最终确认阳性标本。

1.5标本的浓缩

往每个汇集池中加入浓缩液40μl和促沉剂50μl，充分混匀后在Eppendort离心机以4℃离心1小时(25000～26000g)，留底部110μl左右样震荡混匀备用。

1.6核酸的提取

采用核酸提取试剂盒，在标本处理区按试剂盒要求准备六块板①～⑥，板①加去抑制剂20μl、浓缩样100μl、裂解液100μl及专用耗材-96Tip Comb，板②加磁珠溶液100μl，板③～⑤分别加洗涤液A、B、C200μl，板⑥加洗况液80μl，然后在KHB-DP1000磁珠分离仪上按程序说明逐步完成核酸提取。

1.7核酸扩增及检测

用全自动核酸扩增仪检测，按检测试剂盒要求准备PCR反应液(HBV PCR反应液A：HBV PCR反应液B：HBV PCR反诮液C：内标=8：6：1：0.2)，往反应管中加15μl PCR反应液及15μl已提取的核酸，置入核酸扩增检测仪上，按程序操作。内标阳性，样本阳性者报阳性。

2 结果

2.1灵敏度考评

将已知浓度的标准品用阴性血清于不同时间配制成不同拷贝数的应用标准液，进行重复核酸提取、扩增及检测，结果见表1。

应用Probit概率统计(SAS9.0)计算95％检测限量及可信限范围。本方法检测HBV DNA95％检测限量为98.0IU／ml，可信限范围为[55.8，548]。

2.2已知HBV DNA阳性标本检测结果对7份

已知HBV DNA阳性的保存标本(经Roche试剂检测阳性)分别取样1200μl离心浓缩后进行核酸提取扩增检测和100μl直接进行核酸提取扩增检测，结果分别检也HBV DNA阳性6例和5例，检出率分别为85.7％、72.4％。采用随机双盲法混合了7份阳性血清(经单人份检测阴性)，进行混样检没，7例混样中共检出HBV DNA阳性2例，检出为28.6％，见表2。

阳性、定量测定无结果

2.3检测系统的精密性

对68次扩增实验的质控的CT值进行统计分析：计算前20个质控点：均值x-=30.081，SD=1.051，CV=3.49％。除了一次实验失控，CT值．CT值过高可能是质控样提取的核酸不足，导致扩增循环次数增加所致，其他实验质控艾在x-±2S范围内，见图1。

2.4质量控制

为监控实验进行，对整个实验进行有效控制，在每次检测过程依靠阴性、阳性对照、质控及内标进行监控。阳性质控品用来监测试剂以及实验室环境是否存在污染等可引起假阳性的系统误差及系统错误，以减少假阳性。阳性质控品用来监测试剂及整个实验过程产生假阴性的系统误差及系统性错误，以减少假阴性。内标是相当于加入每管中的阳性质控，监测每个反应体系产生假阳性的偶然误差及个体性错误，以减少标本的假阴性。阴性对照采用科华公司提供的阴性稀释血浆，质控品由科华公司提供(5×104拷贝／ml)，以阴性血浆稀释成150拷贝／ml，随样本一起检测，内标能被扩增出来，阳性对照、质控均能定性检出阳性。

2.5 NAT检测结果

共对血清学筛查合格血液9239人份计1157个汇集标本进行扩增检测，初检发现HBV DNA阳性汇集标本6个，对所有初检阳性的汇集标本进行复检，结果全部阴性，假阳性率为0.52％，本次实验未检出 HBV DNA阳性标本。从检测阴性谍集标本中随机进行单份检测(1400μl上样浓缩)，共检测234份，亦未检出HBV DNA阳性标本，见表3。

*1157个汇集池中有6个汇集池不是按8×150μl方案汇集，其中3个汇集池是4×150μl，另外3个分别是6×150μl、3×150μl、2×150μl。在进行HBV DNA检测，有1个内标检出失败。

2.6 HBsAg ELISA阳性献血者中HBV DNA检测结果

对同期经ELISA筛查HBsAg阳性的标本共计36份进行检测，检出HBV DNA阳性22例，阳性率61.1％，对所有HBsAg阳性标本进行两对半检测，结果见表4。同时对初检单试剂(ABBOTY)检测HB-sAg阳性的11份标本做确认实验，结果均呈阳性反应。

3　讨论

血液HBV筛查模式的选择取决于该地区HBV的流行率，一般流行率较低的地区如欧洲、美国(

我国是乙型肝炎的高度流行区，最近两年调查数据显示，人群中HBsAg携带率已上升至10.12％，在这种乙肝高流行区人群中征集健康它全的医疗用血是相当困难的，目前我国血站的血液筛查都是使用 ELISA方法，而我国的抗-HBc阳性率高达60％，对献血员的筛查主要检测HBsAg和ALT两项，由于该方法的灵敏度较低(国产试剂盒灵敏度为0.5-1.0ng／ml)及病毒“窗口期”变异等原因，使得血液筛查存在一定程度的漏检，给临床用血安全带来极大的威胁。NAT技术可直接检测病毒核酸，能缩短“窗品期”和检测病毒变异株，大大降低了HBV的漏检率。

血清学检测HBsAg阴性不能排除HBV感染已经成为共识，1978年Hooftingle等首次报告抗-HBc阳性、HBsAg阴性的供血者可导致受血者HBV感染以后，大量文献报道证明了这种现象确实存在，引起输血传播HBV的主要是HBsAg阴性、HBV DNA阳性的献血者，有研究报告在HBV暴露率高达70％～90％的地区，献血员中有7％～19％为HBsAg阴性HBV感染者，而在HBV暴露率低的西方国家如美国约5％，献血员中仅0％～9％为HBsAg阴性HBV感染者。HBsAg阴性HBV感染者的血清病毒一般保持低水平复制，抗原表达量低，HBV DNA通常

本实验对经过ELISA筛查合格的献血者9239份标本共计1157汇集样进行HBV DNA检测，结果未检出阳性标本，对从阴性谍集标本中随面拆分的234份标本进行单份检测，结果亦未检出HBV DNA阳性标本。原因可能有几个因素；①无尝献血的组织动员工作保证了从低危人群中采血，血源质量高，不仅已实现100％无尝献血，而且定期献血者占献血人数50％以上，占采血量64％，②是严格实施了免疫筛查，两次ELISA检测分别采用国产和灵敏度很高的进口度剂；③是所采用的NAT试剂灵敏度与国际同等水平相比较低，日本红十字会与Roche合作利用TaqMan PCR，建立的全自动血液核酸常规筛查，其报告的HBV DNA灵敏度为30拷贝／ml。本实验对7份已知HBV DNA阳性的标本按浓缩和不浓缩进行检测，检出率分别为85.7％、72.4％，采用随机双盲法混合7份阴性血清进行混样检测，检出率仅为28.6％，用国家标准品进行灵敏度考评，结果HBV DNA95％检测限量为98.01U／ml；④所采用NAT试剂的特异性尚需提高，对9239份样本计1157个汇集样进行检测，初检假阳性率达0.52％。⑤核酸提取效率需进一步提高，对7份已知HBV DNA阳性标本取150μl与阴性血清混样检测，离心浓缩后再提取，其检出率仅为28.6％，而直接取100μl进行提取，其检出率为72.4％，显然离心浓缩病毒的作用并不大。目前国外所采用的NAT技术多为全自动检测系统，在核酸提取过程中加入“离心浓缩”一步，不利于整个检测系统的自动化，而且实验证明离心浓缩病毒的效果并不明显，国产NAT技术在病毒提取方面还有待改进。

当前我国HBV感染情况严峻，每年报告乙型肝炎新发病倒数红为50万，为保障血液安全，预防输血感染HBV，应考虑在血液常规筛查中增加HBV DNA检测。国外对血液HBV DNA检测研究探讨较早，积累不少经验，NAT技术较成熟，但由于试剂成本原因难以在国内得到推广应用。建立一套适合中国国情的血液核酸筛查检测体系，特别是HBV DNA检测体系，对我国这样一个乙肝大国尤其重要。近年来虽然许多国内生物技术公司已开发出较成熟的HBV DNA检测产品，如深圳匹基、上海科华等，但这些产品目前只适用于临床诊断，而血液筛查和临床诊断是两个不同的领域，血液筛查对试剂的灵敏度、特异性要求比临床要求高得多。目前国产核酸试剂用于血液HBV DNA筛查尚处于开始阶段，需进一步积累经验，从样吕制备、扩增、检测多方面进行改进，而提高试剂灵敏度及特异性。

参 考 文 献

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核酸检测方法篇7

1材料和方法

1.1材料：选取我院临床初筛检测病例72例，其中男性40例，女性32例。年龄28-63岁，平均39岁。

1.2临床症状：初期的开始症状像伤风、流感、全身疲劳无力、食欲减退、发热、体重减少、随着病情的加重，症状日见增多，如皮肤、粘肤出现白色念球菌感染，单纯疱疹、带状疱疹、紫斑、血肿、血疱、滞血斑、皮肤容易损伤，伤后出血不止等。

1.3方法：目前作为诊断手段使用的检测主要包括抗HIV病毒抗体检测、核酸检测和抗原检测。其中对病毒抗体的检测是艾滋病初筛实验室常规使用的方法

1.3.1酶联免疫吸附试验（ELISA）：目前应用的ELISA法有8种之多。它们的特异性和敏感性超过99%。在一些特殊情况下，当抗体检测无法满足HIV感染诊断的需要时，病毒分离及测定、核酸检测、抗原检测可作为辅助手段使用，这包括对非典型血清学反应样品的诊断、HIV感染的窗口期诊断、新生儿早期诊断和对特殊样品的诊断。

1.3.2明胶颗粒凝集法（PA）：它是快速、简便的一种筛选方法。PA的基本过程是先将样品稀释，然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒，混匀后保温(一般为室温)。当血清中有HIV抗体存在时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便，无需特殊仪器设备，适合对少量标本的检测。是对大量人群初筛实验使用的方法，例公民义务献血的初筛检测。

1.3.3免疫荧光试验(IFA)：基本原理为应用H9或HUT78培养细胞作为载体，用HIV感染细胞，该细胞内就会含有HIV抗原，将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上固定，制备为抗原片，加入待检血清，待检血清中的抗 HIV抗体与抗原结合后，再与荧光素标记的抗人Ig结合，在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。

1.3.4免疫印迹试验：主要用于确认试验，基本原理是HIV全病毒抗原经过SDSPAGE电泳，将分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状，每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100，再把它直接加到硝酸纤维素膜上，恒温震荡，使其充分接触反应，血清中若含有抗HIV抗体，就会与膜条上的抗原带相结合并呈现紫褐色。此确认实验室是初筛阳性的标本送检省疾控的HIV确认实验室或市疾控的HIV中心实验室进行的。

1.3.5病毒核酸检测：是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，具有很高的灵敏度，使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。使用高灵敏度的适时荧光PCR技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。此种检测是在HIV感染确诊之后，判定使用抗病毒药物的检测指标，现在可有省疾控中心的艾滋病检测实验室完成。

2结果

经过我院的检测和分析后，14例送检经确认实验，未确诊艾滋病感染。

3讨论

近年来，HIV检测技术取得了很大进展，但是仍有不足的地方。例如ELISA法第四代试剂增加了P24抗原的检测， p24抗原检测能够在病毒开始复制后检测到血液中的可溶性p24抗原，但易出现假阳性。因此，阳性结果必须经中和试验确认，该结果才可作为HIV感染的辅助诊断依据。还有病毒核酸检测方法具有很高的灵敏度，对疾病进展的监测、抗病毒疗效观察和耐药性监测非常重要。但是，由于HIV基因的多样性，没有一套引物可以覆盖所有的HIV序列，使检测的敏感性又受到限制。

HIV感染的诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分，建立敏感实用的检测方法对于监测、诊断或血液筛查，控制艾滋病的流行显得尤为重要。总结以上讨论的检测方法，我们得出的结论是，既要提高检测的敏感性、特异性，缩短窗口期，又要简便、快速和降低成本已成为HIV检测技术发展的要求和方向，很多的研究正致力于寻找病毒检测的替代技术。

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[2]沈霞

艾滋病的实验室诊断

核酸检测方法篇8

2022年元旦去杭州做核酸检测吗 元旦出入杭州是否需要出示核酸证明，目前还没有相关消息。

元旦去杭州不要做核酸检测，前提是低风险区，但具体以你所在的地区为准。元旦去杭州要不要做核酸检测，主要看你个人所在地区。毕竟根据各地的防疫规定，从外省回家的人原则上需要做核酸检测。回家前需要提前打电话给要回的社区(街道、村庄)报告。报告内容包括姓名、电话、返回地点、到达地点等。，并根据对方要求检查是否需要核酸检测，以及核酸检测的位置和方法。

目前杭州疫情防控规定，对于国内疫情中高风险地区的人员，实施14+7健康管理措施，即先实施14天集中隔离医学观察，继续实施7天居家健康观察;对于全球封闭管理区域同时伴随空间的人员，参照实施14+7健康管理措施。

以上就是2022元旦出入杭州要不要核酸检测介绍了。希望对大家有所帮助。