时间：2023-11-13 13:58:33
1、极低密度脂蛋白高是指肝脏利用乳糜颗粒残粒、胆汁酸、脂肪酸、糖和蛋白质的中间代谢物与肝脏内合成的载脂蛋白组成的一种脂蛋白的密度高。低密度脂蛋白增高提示存在高脂血症，它是导致血管硬化、斑块形成的重要危险因素，血管的硬化及斑块形成使得血管狭窄，弹性减弱等最终导致高血压、冠心病、脑梗塞等。也会导致机体糖代谢紊乱出现血糖升高。总之它是引起机体尤其是心脑血管疾病的重要危险因子，所以需要积极的干预。
2、意见建议：治疗高脂血症的基础为：控制饮食+运动即节制饮食，饮食易清淡，少吃肥甘厚腻，多吃些蔬菜芹菜、黑木耳等，平时也可用山楂、枸杞、决明子、荷叶等泡茶喝有利于降血脂。平时要适度运动，也就是说只要管住嘴、迈开腿血脂一般可以自行降至正常范围。
（来源：文章屋网 ）
【摘要】目的 探讨糖尿病患者血脂及糖化低密度脂蛋自(G-LDL)水平与冠心病之间的关系。方法 测定60例糖尿病患者及60名健康人的血清G-LDL及常规血脂，包括三酰甘油（TC）、胆固醇（Chol）、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。结果 糖尿病组LDL-C与健康组比较无差异P> 0.O5，而糖尿病组血清G-LDL、TC、Chol水平明显高于健康组(P
【关键词】糖尿病；血清糖化低密度脂蛋自；冠心病
糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病，是由于胰岛素绝对或相对不足引起糖、脂肪、蛋白、水及电解质等代谢紊乱，出现高血糖和糖尿。也是一种全身代谢紊乱性疾病，易发冠心病，全球糖尿病患者并发冠心病高达72.3%糖尿病合并冠心病者一病死率很高。近年研究发现脂质修饰(氧化和糖化) 是冠心病的重要危险因素。研究发现动脉粥样硬化的形成和糖化低密度脂蛋白有关。我们通过检测糖尿病患者血脂及G-LDL水平，分析糖尿病患者发生冠心病的生化机制及其相关因素。
1 资料与方法
1.1一般资料:本文选择的60例糖尿病患者均为2009年10月至2010年10月我院住院及门诊确诊的患者，由于糖尿病患者年龄较大，在对照组样本采集时，尽量选择和患病组年龄接近的人群，其中男21例，平均年龄57.83岁（40～70岁）;女39例，平均年龄59.2岁（40～78岁），所有患者均采空腹血各5 mL。健康组年龄平均为47岁，其中男40名、女20名，均无心血管疾病、糖尿病及肾病，采空腹血各5 mL。样本采集后及时离心分离血清，置-70℃冰箱冷冻保存。
1.2试剂仪器 :G-LDL测定用沉淀法分离出血清，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)由华东师范大学化工厂提供。三酰甘油(TG),胆固醇（Chol）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂由Roche公司提供。仪器为OLYMPUS 5400全自动生化分析仪、E170电化学发光免疫分析仪和HLC 723 G7高效液相布谱分析仪。
1.3统计学方法采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，率的比较采用卡方检验。
2 结果
测定60例糖尿病患者及60名健康人的血清G-LDL及常规血脂，包括三酰甘油（TC）、胆固醇（Chol）、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。糖尿病组LDL-C与健康组比较无差异P> 0.O5，而糖尿病组血清G-LDL、TC、Chol水平明显高于健康组(P
3 讨论
糖尿病是一组发病机制还尚未完全明了的内分泌代谢性疾病，发病率仅仅低于心脑血管疾病和肿瘤。在我国糖尿病发病率为2%～3%。血糖测定只能表明患者即刻的血糖水平，来为我们提示患者当时的身体状况，并不能作为评价糖尿病疾病控制程度的指标［1］。近年来通过对冠心病的发病机制研究，发现冠心病的发生、发展不仅和脂代谢紊乱有关，特别是修饰化的脂质在动脉粥样硬化的形成中发挥了关键的作用。同时还包括内皮细胞的损伤、脂质的浸润、细胞的迁移、泡沫细胞的形成等。G-LDL和动脉粥样硬化的关系表现在两个方面:一方面由于LDL被糖化，更容易被氧化形成ox-LDL。另一方G-LDL和ox-LDL同属于修饰的脂蛋白，致动脉粥样硬化方面和ox-LDL有相同作用［2］。关于G-LDL的研究很少，对糖化脂蛋白的研究有望成为糖尿病并发冠心病的研究热点。
本文显示糖尿病患者G-LDL明显高于健康组，同时 TG, Chol水平也增高。由于糖尿病患者存在胰岛素抵抗及血糖利用障碍，导致脂代谢紊乱，脂分解加剧。在高Glu和高血脂存在的情况下，血液中高浓度存在的葡萄糖醛基与脂蛋白中载脂蛋白上的赖氨酸残基N端结合，形成糖化脂蛋白［3］。本研究结果也证实了糖尿病患者存在高浓度的G-LDL。
对糖尿病患者G-LDL的形成分析表明，G-LDL的形成和血糖浓度呈正相关，而与LDL-C水平无关，结果表明控制糖尿病患者血糖水平，可直接影响G-LDL的水平。有研究指出饮食对G-LDL的形成也很重要，糖尿病患者应适当控制饮食，减少脂类的摄入量。
参考文献
［1］ 龙健，曾智. 糖化低密度脂蛋白与动脉粥样硬化［J］.心脏杂志，2003，15 (1) :84-85
［2］ 刘爱华，谢淑萍，王拥军. 糖化低密度脂蛋白与颈动脉粥样硬化的关系研究［J］中华老年心脑血管病杂志，1999,1（1）:23-26
［3］ 潘长玉.2型糖尿病血糖控制的意义及实践.国外医学•内分泌分册，2003，23（4）:228-229.
【关键词】 动脉粥样硬化；氧化低密度脂蛋白；氧化应激；综述文献
文章编号：1004-7484（2014）-02-0650-02
调查研究表明，血脂异常、年龄、肥胖、高血压、糖尿病、吸烟和高同型半胱氨酸血症等一系列致病危险因素在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发生、发展过程中起着重要作用。近来血脂异常中氧化低密度脂蛋（oxidized low-density lipoprotein，OX-LDL）致AS的作用越来越受到关注，许多研究提示OX-LDL作为一个独立的危险因素在AS的发生和发展中起着重要的作用。其中，OX-LDL通过结合凝集素样OX-LDL受体（lectin-like OX-LDL receptor-1，LOX-1）而引发的一系列生物效应尤其具有代表性，笔者就OX-LDL致AS的可能机制做一综述。
1 OX-LDL的生物化学特性
氧化低密度脂蛋白由血浆低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）氧化修饰而成。在活的有机体内，参与氧化修饰的酶包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、脂加氧酶、髓过氧化物酶及线粒体电子传递系统等，同时内皮细胞、平滑肌细胞、单核-巨噬细胞、中性粒细胞、纤维母细胞等细胞也参与这一氧化修饰过程。在体外适宜的培养基内，LDL可经5-10μMCu2+孵化8-16h修饰形成OX-LDL。在正常人体，OX-LDL与巨噬细胞及血管内皮细胞表面的清道夫受体（scavenger receptor，SR）结合后被清除[1]；在血脂异常情况下，增高的脂蛋白对动脉内膜产生功能型损伤，使内皮细胞和白细胞表面特性发生变化，单核细胞对动脉内皮的黏附力增加并通过趋化吸引更多单核细胞进入内膜，这些单核细胞在内膜转化成有清道夫作用的巨噬细胞，吞噬脂质，使得OX-LDL在内皮下大量沉积。沉积的OX-LDL中一系列的氧化产物通过促进内皮细胞粘附分子的分泌和特异性的化学趋化因子的释放引起单核细胞、淋巴细胞或血小板与内皮的粘附以及单核细胞-巨噬细胞在动脉内膜的聚集。沉积的OX-LDL也能促进血管平滑肌细胞的增殖、引起平滑肌细胞分泌大量的纤维蛋白以形成粥样斑块的纤维帽。
2 OX-LDL致AS的临床和实验室证据
近来大量的基础及临床研究资料证明OX-LDL引发的一系列病理生理改变是导致AS形成的关键，与AS患者病情严重程度密切相关。凝集素样OX-LDL受体是第一个被确定的参与内皮细胞功能失调、平滑肌细胞凋亡以及巨噬细胞泡沫化的关键受体被Sawamura等[2]于1997年首次在牛内皮细胞上发现，LOX-1属于E类清道夫家族成员，在AS发生发展过程中起着重要的作用。在研究中发现LOX-1可通过上调血管内转录基因促进细胞间黏附分子-1、血管细胞间黏附分子-1的产生而诱导巨噬细胞聚集[3]。另外，徐晓萍[4]等研究者也发现OX-LDL诱导清道夫受体CD36（SR-B）表达上调引起内皮损伤、促进AS斑块形成。有研究者发现，通过建立CD36缺陷大鼠动物模型发现其AS斑块体积缩小。Li等[5]研究发现，细胞中P-选择素、E-选择素以及ICAM-1、VCAM-1的基因和蛋白表达显著增加可能与OX-LDL结合LOX-1导致NF-κB激活，进而调节生物转录与生物合成有关。内皮细胞在OX-LDL的刺激下可以分泌特定趋化因子特异地作用于单核细胞并使之黏附于受损的内膜，诱导其迁入内皮下间隙，加剧内皮细胞的损伤。另一方面，大量临床研究证实降脂类药物，如：他汀类[6]及中药复方，能够降低OX-LDL含量，延缓AS的发生、发展。综上所述，大量临床和实验室证据证明，OX-LDL在AS的发生、发展中起着重要的作用。
3 OX-LDL致AS的可能机制
3.1 OX-LDL与血管内皮细胞功能受损 OX-LDL可以通过释放溶血卵磷脂改变内皮细胞对正常血压调节因子的反应，使其对一些舒血管因子刺激的反应下降；Chen等[7]通过建立ApoE-/-小鼠模型发现体内给予抗LOX-1抗体以及NADPH氧化酶（NADPH oxidase，Nox）抑制剂apocylin或DPI可恢复其冠脉血管内皮依赖性血管舒张，由此可见OX-LDL导致内皮依赖性冠脉舒张与功能紊乱可能由LOX-1和Nox介导。OX-LDL自身含有的脂质过氧化物可诱导血管内皮细胞、平滑肌细胞坏死，引起炎性反应并增强动脉壁对脂蛋白的通透性，容易引起脂蛋白在血管壁的沉积；OX-LDL与内皮细胞上的LOX-1结合后使得内皮细胞活化并释放活性氧、激活NF-kB，造成内皮细胞依赖的舒血管功能降低，内皮细胞凋亡坏死。这些作用进一步加剧了血管内皮的损伤，在AS早期内皮功能受损中发挥了重要作用。
3.2 OX-LDL的氧化应激作用 OX-LDL通过抑制一氧化氮（nitric oxide，NO）合成酶、超氧化物歧化酶等的作用使NO合成减少，使得 LDL的氧化修饰进一步增多，从而加重氧化应激对血管内皮的损伤。研究者在实验中观察到OX-LDL能够取代内皮细胞质膜陷窝内的内皮型一氧化氮合成酶并降低此酶的活化。研究进一步表明，OX-LDL通过结合LOX-1增加活性氧含量而抑制NO对内皮细胞的作用，同时OX-LDL也能使尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶表达上调，最终导致细胞内活性氧增加，加剧细胞损伤。Y.Shi[8]等在研究中观察到，OX-LDL结合LOX-1后也能磷酸化激活线粒体中的p66shc酶，从而产生大量活性氧，增加氧化应激对细胞的损伤。将OX-LDL与人冠状动脉内皮细胞孵化后发现细胞内活性氧增加并可导致DNA氧化损伤。上述研究表明，由0X-LDL引发的氧化应激作用是AS的发生、发展重要机制之一。
3.3 OX-LDL增强细胞黏附作用 AS发生过程中，细胞黏附起着不可忽视的作用，血液中的单核细胞、淋巴细胞首先黏附到受损的内皮上，再迁移进入内皮下层。在内皮下层，单核细胞转化为具有吞噬能力的巨噬细胞从而摄取脂质转化为泡沫细胞，并向淋巴细胞提供抗原，触发局部免疫反应；已经在实验中观察到OX-LDL能增强循环中单核细胞和T淋巴细胞的黏附和迁移作用，诱导这些细胞黏附于内皮细胞，并刺激这些细胞分泌大量的炎性因子，直接作用于内皮细胞，造成局部的炎症反应，刺激血管内皮细胞、平滑肌细胞等增生，同时还刺激内皮细胞表达多种黏附分子诱导脂蛋白等物质沉积，加剧了血管局部的动脉粥样硬化形成。实验证实，将OX-LDL与内皮细胞共同培养后，内皮细胞单核细胞趋化因子MCP-1表达增多，单核细胞黏附内皮细胞的能力增强；此作用可以通过添加反义LOX-mRNA抑制。OX-LDL还通过结合LOX-1显著地上调内皮细胞表达P选择素、E选择素、血管细胞黏附分子-1及细胞间黏附分子-1使白细胞黏附力增强。D.Li[5]等通过实验证实，用他汀类药物或多聚肌苷酸预处理内皮细胞后，能够有效降低OX-LDL诱导的LOX-1表达同时减少内皮细胞表达细胞黏附分子。
3.4 OX-LDL参与泡沫细胞的形成 OX-LDL可以通过抵抗组蛋白酶而减少溶酶体对OX-LDL的降解，使其在细胞内堆积，此作用也可能是通过LOX-1介导。研究发现在早期动脉粥样硬化斑块中的内皮细胞和进展期斑块中的平滑肌细胞、巨噬细胞中可见LOX-1高度表达，表明OX-LDL可能通过结合LOX-1而促进平滑肌细胞和巨噬细胞吞噬脂质转化为泡沫细胞。
3.5 OX-LDL参与平滑肌细胞增殖和血小板活化 研究者在实验中观察到，体外培养的平滑肌细胞也能检测到LOX-1表达，且LOX-1的表达上调能被OX-LDL所诱导。在活体平滑肌组织，正常情况下不能检测到LOX-1，但是在血管损伤或血管球囊成形术后可检测到LOX-1高表达。这些实验结果提示：OX-LDL结合LOX-1可能在平滑肌细胞增殖、血管狭窄中起到了一定的作用。K.-C.Chen[9]等进一步研究发现OX-LDL结合LOX-1后通过上调转录因子Oct-1而反馈抑制MicroRNAlet-7g，使得MicroRNAlet-7g抑制LOX-1表达及平滑肌细胞迁移、增殖的作用减弱。同时，在病理情况下OX-LDL通过结合LOX-1调控Bax/Bcl-2造成平滑肌细胞凋亡坏死，最终可导致粥样斑块变得不稳定而引发一系列心血管急症。另外，OX-LDL也参与血小板活化，正常情况下，血小板表面也有清道夫受体表达。未活化的血小板通过CD36结合OX-LDL，一旦血小板被激活，其大量表达LOX-1。此时，OX-LDL既能通过结CD36也能结合LOX-1从而使血小板黏附内皮细胞的能力增加，引发炎症反应并导致血小板进一步聚集。
3.6 OX-LDL与AS斑块稳定性 有研究指出，在体外实验中OX-LDL可以上调人冠状动脉表达基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinaseMMPs）-1，MMPs-2同时发现，MMPs及其内源性抑制物金属蛋白酶组织抑制物1（tissue inhibitor of metal-loproteinase-1，TIMP-1）表达失衡是导致动脉粥样斑块不稳定的重要因素。不稳定斑块容易破裂出血，最终引发心血管急性事件。研究表明，OX-LDL诱导MMPs表达上调也是通过与LOX-1结合而发挥作用。
4 展 望
综上所述，OX-LDL参与了内皮细胞的损伤，并增加单核细胞黏附能力，使单核细胞更容易黏附于内皮细胞，加剧单核向内皮下趋化，进而导致泡沫细胞的形成增多，又可通过上调MMPs的表达及增加平滑肌细胞等的凋亡和增殖而影响斑块的稳定性，同时导致血小板活化而栓塞血管，并引发炎症与氧化应激，在AS的发生、发展过程中发挥了重要作用。OX-LDL作为动脉粥样硬化的独立的危险因素，其水平高低与疾病的发展、预后关系密切。临床上通过减少LDL氧化修饰而降低OX-LDL含量，对于动脉粥样硬化的防治有重要意义。同时，LOX-1可能成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。但现在临床上对于OX-LDL的监测及测定标准化等均有待进一步研究，OX-LDL的临床价值有进一步深挖的可能。
参考文献
[1] ITABE H，OBAMA T，KATO R.The Dynamics of Oxidized LDL during Atherogenesis[J].J Lipids，2011；2011：418313.
[2] SAWAMURA T，KUME N，AOYAMA T，et al.An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein[J].Nature，1997，386（6620）：73-7.
[3] WHITE S J，SALA-NEWBY G B，NEWBY A C.Overexpression of scavenger receptor LOX-1 in endothelial cells promotes atherogenesis in the ApoE-/-mouse model[J].Cardiovascular Pathology，2011，20（6）：369-73.
[4] 徐娟萍，张晓峰.氧化低密度脂蛋白致血管内皮损伤机制及中药复方防治的研究进展[J].现代药物与临床，2011，26（3）：195-8.
[5] LI D，CHEN H，ROMEO F，et al.Statins modulate oxidized low-density lipoprotein-mediated adhesion molecule expression in human coronary artery endothelial cells：role of LOX-1[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2002，302（2）：601-5.
[6] CANGEMI R，LOFFREDO L，CARNEVALE R，et al.Early decrease of oxidative stress by atorvastatin in hypercholesterolaemic patients：effect on circulating vitamin E[J].European heart journal，2008，29（1）：54-62.
[7] CHEN X，ZHANG H，MCAFEE S，et al.The reciprocal relationship between adiponectin and LOX-1 in the regulation of endothelial dysfunction in ApoE knockout mice[J].American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2010，299（3）：H605-H12.
[8] SHI Y，COSENTINO F，CAMICI G G，et al.Oxidized low-density lipoprotein activates p66shc via lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，protein kinase C-beta，and c-Jun N-terminal kinase kinase in human endothelial cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31（9）：2090-7.
关键词：急性冠脉综合征；氧化低密度脂蛋白
动脉粥样硬化（AS）是一种严重影响人类健康的慢性炎性反应性疾病，是由一系列危险因素如年龄、性别、脂质代谢异常、高血压、吸烟、血糖代谢异常、环境及遗传因素等相互作用而形成。其中，血脂异常是AS非常重要的危险因素，总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白特别是氧化的低密度脂蛋白增高，高密度脂蛋白减低，载脂蛋白A降低和载脂蛋白B升高以及脂蛋白（a）增高都被认为是危险因素。动脉粥样硬化的发生与低密度脂蛋白受到氧化修饰有关，氧化修饰的LDL是泡沫细胞形成的主要原因[1]。有研究发现，血浆ox-LDL水平的增加与急性冠脉综合征（ACS）的严重程度呈正相关，提示ox-LDL的水平与冠脉AS斑块的不稳定性相关，但该研究没有进一步探讨血浆ox-LDL水平的增加是否反映了冠状动脉AS斑块的负担[2-3]。同时血浆ox-LDL对于急性冠脉综合征患者的影响尚未明确，文章将对此进行阐述，现报告如下。 1 资料与方法
1.1 一般资料：选取2008年1月～2011年6月进入我科住院的冠心病患者。其中稳定性冠心病患者96例，男66例，女30例；急性冠脉综合征患者104例，男72例，女32例。对入院的冠心病患者按病情分为急性冠脉综合征组及稳定性冠心病组。所有入选患者均签署知情同意书。入选标准：根据目前稳定性冠心病及急性冠脉综合征诊断标准，达到标准即可入选；排除肿瘤、严重肝功能不全、严重肾功能不全、严重脑血管疾病、严重感染患者。两组在性别方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。
1.2 诊断标准：稳定性冠心病患者包括缺血性心肌病、稳定性心绞痛、无症状性心急缺血，诊断标准按中华心血管杂志《2007中国慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南》。急性冠脉综合征患者包括不稳定性心绞痛、急性ST段抬高性心肌梗死、急性非ST段抬高性心肌梗死，诊断标准综合考虑2007年前各相关权威指南。
1.3 氧化低密度脂蛋白的测定：酶标多克隆抗体夹心的方法检测血清Ox-LDL含量，试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司提供的药盒。稳定性冠心病患者均空腹12 h以上肘静脉采血不超过2 ml，急性冠脉综合征患者入院即时抽取肘静脉血不超过2 ml放入预先放入样品保护剂试管中摇匀，离心后应用。
1.4 统计学分析：计量资料以均数±标准差（）表示，均数比较采用单因素方差分析，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
入选各组基线情况：两组比较，急性冠脉综合征患者组高血脂、早发冠心病家族史及吸烟患等危险因素多于稳定性冠心病组相（P＜0.05）；各组糖尿病患者、年龄、高血压患者差异无统计学意义（P＞0.05），急性冠脉综合征患者组血浆氧化低密度脂蛋白为（78.5±12.3）μg/dl；稳定性冠心病患者组血浆氧化低密度脂蛋白为（45.8±20.3）μg/dl。两组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。
表1 入选患者基线情况（例）
比较项目
稳定性冠心病组（n=96）
急性冠脉综合征组（n=104）
高血压患者
65
81
糖尿病患者
31
42
吸烟
58
95
高脂血症患者
61
90
早发冠心病家族史
22
46
年龄（，岁）
68.3±8.1
66.7±7.2
氧化低密度脂蛋白（，μg/dl）
45.8±20.3
78.5±12.3①
注：与稳定性冠心病组比较，①P＜0.01
3 讨论
低密度脂蛋白与动脉粥样硬化（AS）形成密切相关，但是近年来的基础研究表明，LDL经过氧化修饰后致动脉粥样硬化作用增强，因为ox-LDL既可以被巨噬细胞清道夫受体吞噬形成AS的早期病变泡沫细胞，又有刺激血管平滑肌细胞增殖及向内膜迁移，并激活血小板致血栓形成，促进细胞黏附分子在内皮细胞表达等多方面的作用。因此，ox-LDL可参与AS发生发展全过程。ox-LDL的致AS作用已被公认[4-5]。
急性冠脉综合征是近年来根据动脉粥样板块病理变化对不稳定冠心病的总称，包括不稳定性心绞痛、急性ST段抬高性心肌梗死、急性非ST段抬高性心肌梗死等冠心病。其共同具备的特点为动脉粥样斑块不稳定，在某种情况下可以诱发破裂导致急性血栓事件。对于不稳定粥样斑块的产生原因有多种原因，包括炎性反应细胞的浸润、斑块形态、纤维帽的厚度、脂核的大小等[6-7]。在本研究中发现在急性冠脉综合征患者中氧化低密度脂蛋白含量远远高于稳定性冠心病患者，由此可以推测，氧化低密度脂蛋白不仅参与动脉粥样硬化的进展，在粥样斑块向不稳定状态发展过程中也起着至关重要的作用，至于其发生机制有待进一步的研究。
4 参考文献
[1] Steinberg D,ewis A.onner Memorial Lecture:xidative modification of LDL and atherogenesis[J].Circulation,2000,9(5):1062.
[2] 张家明,王朝晖.急性冠状动脉综合征患者氧化低密度脂蛋白与细胞因子的变化及其相关性[J].临床心血管病杂志,2005,21(1):4.
[3] 冯忠军,金玉怀,戴 华.冠心病患者血浆氧化修饰型低密度脂蛋白的检测[J].河北医药,2003,25(1):12.
[4] Murugesan G,Chisolm GM,Fox PL.Oxidized low den-sity lipoprotein inhibits the migration of aortic endothelial cells in vitro[J].J Cell Biol,1993,12(7):1011.
[5] Holvost P,Donck J,Landsloos M,et al.Corre-Lation between oxidized low densit ylipoprotein and von Willebrand factor in chronic renal failure[J].Thromb Haemost,1996,7(3):663.
[6] 汪德闲,欧阳福珍,毕 艳.颈动脉粥样硬化患者的血压昼夜节律分析[J].中国介入心脏病学杂志,2000,8(2):84.
[关键词]低密度脂蛋白胆固醇;直接测定法;间接换算法;偏差
[中图分类号]R446
[文献标识码]B
[文章编号]1006-1959(2009)12-0223-02
血液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高是导致动脉硬化、冠心病的一个主要危险因素。目前临床测定LDL-C水平的常用方法有直接测定法和间接换算法。我们观察到这两种方法的测定结果存在偏差,可能会导致分析偏倚甚至判断失误。
1 材料与方法
1.1 资料和分组:从我院2008年对657名离休老干部进行体检所收集的血脂测定数据,包括TC、TG、LDL-C和HDL-C的测定值。在TG
1.2 血脂测定方法:TC、TG采用氧化酶法测定,试剂来自日本协和株式会社;HDL-C采用化学修饰酶法测定,LDL-C采用直接法测定,试剂来自日本第一化学株式会社。Lp(a)采用免疫比浊法测定,试剂来自上海申峰公司。同时,利用TC、TG和HDL-C的测定结果,按Friedewald公式计算得出同一份血清的LDL-C值,换算公式为:LDL-C(mmol/L)=TC-HDL-C-TG/2.2。所有标本血脂水平的直接测定用欧宝XL-600全自动生化分析仪完成,质控满意。
1.3 统计分析:计量资料用(±s)表示,用SPSS11.5软件进行统计分析,组间比较用配对资料的t检验,P
2 结果
在TG
3 讨论
流行病学研究、多中心协作调查及临床疗效观察需要对不同人群的血脂水平作比较,临床上需要制订和实施统一的高脂血症防治指南,这些都必须在血脂测定标准化的基础上进行。血脂测定标准化要求实验室之间对血脂项目的测定结果具有横向和纵向的可比性,要求技术指标如不准确度、不精确度和总误差等达到规定的目标。我国中华医学检验学会于1996年制订了相应的规范,保证测定结果的准确性,这样才能为诊治血脂异常提供可靠的依据。
直接法测定和间接换算血清LDL-C的含量,这两种方法均是目前临床测定LDL-C水平的常用方法。按照标准化地要求,当血TG水平低于4.52mmol/L,两种方法均可以选择。我们观察到这两种方法的同步测定结果存在明显的偏差。对于同一份血样的测定结果,因为这两种不同方法测定值的偏差而导致对高脂血症的判断出线不一致。
在理论上,LDL-C的间接换算只包括Lp(a)中胆固醇的含量,于是Gotto等[3]曾对FriedeWaId公式进行校正,即从原公式换算值减去三分之一的Lp(a)含量。本研究观察到按FriedeWaId公式间接换算的LDL-C值基本低于其直接测定值,且在Lp(a)升高的情况下,其差值有赠大的趋势,这不能从以上理论来解释这种偏差。当TG水平高于4.52mmol/L,LDL-C的间接换算值明显偏离其直接测定值,与以往的认识相符。FriedeWaId公式的应用是以极低密度脂蛋白组成恒定的假设为前提,按照mmol/L为单位估计,其中胆固醇的含量是TG的1/2.2.除TG或Lp(a)明显升高的情况以外,Ⅲ型高脂血症、载脂蛋白E2/2型血脂状态也对LDL-C的间接换算值有明显的干扰。在这些情况下,LDL-C值不宜采用FriedeWaId公式来间接换算,宜按标准化地要求采用直接法测定。
［关键词］ 溶血磷脂酸；氧化低密度脂蛋白；脑卒中
中图分类号：R743.3 文献标识 码：A 文章编号：1009-816X(2007)03-0148-03
The Significance of Plasma Lysophosphatidic Acid and Low Density Lipo protein in Patients with Stroke. CHEN Xin-jun, GONG Ai-ping, RONG Lia ng-qun. Centre of Clinical Laboratory, The Second Affiliated Hospital of Xuzhou
Medical College, Jiangsu 221006, China
［Abstract］ Objective To investigate the relationship between p lasma lysophosphatidic acid (LPA) and low density lipoprotein (LDL), and the val ue in diagnosing early stroke. Methods Enzymatic cycling method
was used to detect the content of plasma LPA, serum LDL, and Ox-LDL in 32 patien ts with short brain ischemia, 31 patients with brain infarction and 30 healthy p eople (control group). Results the contents of plasma LPA, serum
Ox-LDL in the group with short brain ischemia and the group with brain infarcti on were significantly higher than those in control group (P＜0.01). A posit ive correlation was found between LPA and Ox-LDL in both patient's groups (r=0. 623, r=0.650， respectively). Conclusions There was a positive
correlation between LPA and Ox-LDL in patients with stroke. Both LPA and Ox-LDL
may serve as an early prediction marker to diagnose stroke.
［Key words］ Stroke; Lysophosphatidic acid; Low density lipopro tein
随着缺血性脑血管疾病发生率的逐年上升，对于该病的预防和预警工作 已日益受到临床工作者的重视。溶血磷脂酸与氧化低密度脂蛋白在该病中的临床应用价值已 引起人们的重视，研究表明，溶血磷脂酸(LPA)来源于活化的血小板及轻度氧化的低密度脂 蛋白［1］，但本文通过测定短暂脑缺血发作患者及脑梗死患者血浆中的LPA、血清LD L和Ox-LDL水平，观察其水平及其相关性，旨在探讨脑卒中早期预警的可靠指标。
1 资料与方法
1.1 一般资料：选择2003年5月至2005年5月在本院住院及门诊患者，根据中华医学会1995 制定的脑血管疾病诊断标准［4］，结合CT或MR检查结果进行分组，短暂脑缺血 发作组32例，其中男17例，女15例，年龄34～62(平均48±14)岁；脑梗死组31例，其中男16 例 ，女12例，年龄41～75(58±17)岁，排除出血性脑梗死及卵巢肿瘤患者。所有病人均未服用 过维生素E等抗氧化剂，采血时间为发病后1～4d。对照组共30名，其中男18名，女12名，年 龄35～52(43±9)岁，均为我院体检健康者，经详细询问病史、体格检查及必要的辅助检查 ，无心脑血管病史、糖尿病和高血压病史。
1.2 材料与设备：
1.2.1 仪器：全自动生化分析仪为日立BM717，半自动生化分析仪，购自法国SECOMAM公 司；水平离心机，购自安徽中大，酶标仪、洗板机为美国伯乐(bio-rad)公司。
1.2.2 试剂：溶血磷脂酸测定套试剂，购自北京泰福仕科技开发公司，其余为国产分析 纯试剂。氧化低密度脂蛋白试剂，试剂购自上海船夫生物公司(美国进口成套试剂)。低密度 脂蛋白试剂购自上海合富公司。
1.3 方法：
1.3.1 标本采集：患者组发病3天内采集静脉血，对照组于体检时取静脉血。采血标 准为早晨、空腹、静卧。
1.3.2 LPA测定方法：具体操作按试剂说明书进行。基本步骤为：取静脉血3.5ml， 充分抗凝后离心，准确取血浆1.0ml，抽提磷脂成分，浓缩分离，与标准管、对照管分别加 显色剂于90℃水浴90分钟，取出置室温下冷却35分钟，在636nm波长下测定吸光度，再计算 其浓度。
1.3.3 Ox-LDL测定方法：采用ELISA双抗体夹心法。将特异性单克隆抗体包被固相载体， 与待测血浆样品中OXLDL结合，再加入酶标记特异性抗体，然后加入底物显色。用酶标仪在4 92nm处测定。标准血清浓度与OD值进行回归后计算样品浓度。
1.3.4 LDL在全自动生化分析仪上测定，严格按要求操作。
1.4 统计学方法：所有资料均采用SPSS10.0软件进行分析，数据以均数±标准差(x－±s)表示，经方差齐性检验后，多组间比较 采用方差齐性分析，两两比较采用q检验。LPA与LDL、OXLDL相关性比较采用定量资料直线相 关分析。以P＜0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 各组结果：见表1。
2.2 LPA与OXLDL、LDL的相关性分析：短暂脑缺血组LPA与Ox-LDL相关系数为r=0.623， 脑梗死组LPA与Ox-LDL相关系数为r=0.65；正常对照组LPA与Ox-LDL相关系数为r=0.33，LP A与LDL相关系数为r=0.288，都呈正相关；LPA、Ox-LDL与LDL相关系数分别为r=0.35和0. 36亦呈正相关。
3 讨论
溶血磷脂酸(LPA)是目前已知所有磷脂中最小、最简单的分子。关于LPA的生成有两种可能的 机制：(1)血浆中溶血磷脂酶D(LPD)激活后催化溶血磷脂酰胆碱(LPC)生成LPA；(2)血小板中 磷脂酶A2(PLA2)激活后催化磷脂酸(PA)生成LPA［2］。目前认为血小板产生的LPA是 血液中LPA的主要来源。当血浆中LPA明显增高时，就标志着血小板活化，凝血过程开始，预 示有形成血栓的可能，因此LPA可标志血小板处于活化状态，有形成血栓的危险［3］ 。本组资料显示脑梗死组、短暂脑缺血组与对照组比较有显著性差异。短暂脑缺血组血浆LP A浓度最高，这可能是短暂脑缺血患者取血时处于发病期，是微小血栓形成的时期，而LPA正 是在血液凝固和血栓形成时产生和释放，故LPA浓度最多，脑梗死组LPA水平较短暂脑缺血组 组低，可能是脑梗死患者入院后诊断取血时脑血栓形成已经有一段时间，血栓形成的过程趋 于结束，血小板产生LPA释放到血浆中的浓度开始下降。
氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是动脉粥样硬化(AS)斑块有的成分。动脉壁中的内皮细胞(V EC)、平滑肌细胞(VSMC)和巨噬细胞都可氧化修饰LDL，使之转化为Ox-LDL。单核细胞氧化可 LDL为Ox-LDL且无需蛋白受体的参与［4］。在AS斑块形成过程中，LDL的摄入不受细 胞内胆固醇的调节，LDL不受限制地进入VEC，并堆积其下，被巨噬细胞、单核细胞或平滑肌 细胞摄入，LDL中脂质氧化形成Ox-LDL。Ox-LDL在As中的作用首先是促进泡沫细胞的形成［5］，其次是Ox-LDL对VEC、VSMC具高度的细胞毒性，可损伤VEC。另外Ox-LDL可致敏 特定的T细胞株，并分泌一系列细胞因子，如1L-1可促进血管内皮细胞(VEC)及血管平滑肌细 (VSMC)增生，VEC进而生成单核细胞激活物，促进单核细胞及巨噬细胞向AS斑块趋化，产生 细胞毒性。Ox-LDL还可刺激特异性自身抗体产生，诱发体液免疫反应参与［6］。本 研 究中观察到短暂脑出血组及脑梗死组血清Ox-LDL浓度明显增高，说明二者的发病确定与Ox-L DL升高有关。但在短暂脑出血组与脑梗死组之间血Ox-LDL比较，两者无显著差异，提示Ox-L DL在脑梗死、脑出血致病机制方面无明显差异。
相关分析结果显示LPA与Ox-LDL、LDL之间相关性分析为正相关，在短暂脑缺血组和脑梗死组 L PA与Ox-LDL者之间亦为正相关，相关系数为0.623和0.65，说明二者之间相关程度密切， 在 正常对照组相关系数为0.33，说明正常对照组二者之间相关密切程度不如短暂脑缺血组和 脑梗死组。这是因为Ox-LDL也可产生具有生物活性的LPA［7，8］，且主要积聚在动 脉粥样硬化斑块脂质核心中，并易导致斑块破裂脱落［9］。而斑块破裂释放大量的L PA，同时可表现为脑梗死。LPA、Ox-LDL与LDL之间相关性分析显示相关系数为0.35、0.36 ，说明LPA、Ox-LDL与LDL之间有相关性，但相关密切程度较弱，所以临床仅检查LDL只能反 应 患者易患动脉硬化，不能反应是否有动脉粥样硬化，及是否已处于脑缺血的边缘。本文显示 ，LPA与Ox-LDL可作为脑卒中早期预警的可靠指标。
参考文献
［1］Tokumura A. Physiological and pathophysiological roles of lysophosp hatidic acids produced by secretory lysophospholipase D in body fluids［J］. Bi ochim biophys Acta, 2002, 158(2):18-25.
［2］Rother E, Brandl R, Baker DL, et al. Subtype-selective an tagon is of lysop hosphatidic Acid receptors inhibit platelet activation triggered by the lipid co re of atherosclerotic plaques［J］. Circulation, 2003, 108(3):741-747.
［3］Spector AA. Plaque rupture, lysophosphatidic acid, and thrombosis［J］. Ci rculation, 2003, 108(3): 641-643.
［4］Cathcart M K, Li Q, Chisoim G M. Lipoprotein receptor interactions are not
required for monocyte oxidation of LDL［J］. Lipid Res, 1995, 36(9):1875-1865.
［5］Landmesser U, Harrison DG. Oxidant stress as a maker for cardiovascular eve nts［J］. Circulation, 2001, 104(4): 831-842.
［6］Sampath P, Nalini S, Nathalie A. Oxidizd Low density Lipoprotein, A Two-Fac ed Janus in Coronary Artery Disease［J］. Biochemica Pharmacology, 1998, 56(6):
279-284.
［7］Relou I A, Hackeng C M, Akkerman J W, et al. Low-density lipoprotein and it s effect on human blood platelets［J］. Cell Mol Life Sci, 2003, 60(5): 961-971 .
［8］Siess W, Zangl KJ, Essler M, et al. Lysophosphatidic Acid mediates the rapi d activation of platelets and endothelial cells By mildly oxidized low density l ipoprotein and accumulates in Human atherosclerotic lesions［J］. Proc Natl Aca d Sci U S A, 1999, 96(12): 6931-6936.
［9］Siess W.A the ro-and thrombogenic actions of lysophosphatidic acid and sphi ngosine-1-phosphate［J］. Biochim Biophys Acta, 2002, 1582: 204-215.
收稿日期：2007-1-29；修回日期：2007-3-8
关键词：高脂血症 肝肾阴虚 低密度脂蛋白受体mRNA 实验研究
中图分类号：R333.4 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2010）11-0008-03
建瓴汤出自张锡纯的《医学衷中参西录》，具有补益肝肾、滋阴潜阳之功，善疗肾阴虚于下，肝阳亢于上诸证，临床上常用于治疗高血压病、冠心病、脑血管意外等疾病。临床观察表明，建瓴汤治疗上述疾病同时，对患者合并的高脂血症及其合并症有较好疗效。前期的动物实验研究结果表明， 建瓴汤可以显著降低高脂血症大鼠血清TC、TG、LDL-C水平，升高血清HDL-C，具有较好的降脂作用[1]。为了从更深层次揭示建瓴汤降脂作用机理， 本实验采用原位杂交法测定研究该方对肝肾阴虚型高脂血症大鼠肝细胞低密度脂蛋白受体信使 RNA（LDLRmRNA ）表达，旨从分子水平揭示该方的降脂作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 取体重为160～180g 雄性SD大鼠84只，180¬～210 g，由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供，许可证号：scxk（湘）2006-0001。大鼠分笼饲养，置于温度（25±2）℃，湿度50%～60%的饲养室。动物均自由饮水。
1.1.2 药品 建瓴汤所用中药饮片均购自广西区人民医院门诊，按照制生地黄、白芍、山药、柏子仁各30g，淮牛膝15g，生龙骨，生牡蛎、代赭石各30g（先煎）的比例，药材洗净后一煎加8倍水煎煮40分钟，过滤煎液，二煎加6倍水，煎煮40分钟，过滤煎液，将两次滤液合并，浓缩成每毫升生药含量1.2g，4℃冰箱保存备用；辛伐他汀片购自广西区人民医院门诊，由浙江海正药业股份有限公司生产；降脂灵片购自广西区人民医院门诊，系湖南德海制药有限公司生产；高胆固醇饲料由普通饲料88.7%、胆固醇1%、猪油10%和胆酸钠0.3%组成。由广西中医学院动物实验中心提供。LDLR原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及给药
实验分组与处理取10周龄健康雄性SD大鼠84只，按随机数字表法进行完全随机分成空白对照组、模型对照组、建瓴汤低剂量组、中剂量组、高剂量组、辛伐他汀组、降脂灵片组7 组，每组12只，各组平均体重比较差异无显著性（见表1）。正常组大鼠喂饲普通饲料，其余组喂饲高胆固醇饲料（高胆固醇饲料由普通饲料88.7%、胆固醇1%、猪油10%和胆酸钠0.3%组成）。
1.2.2 动物模型制作
除空白对照组外，其余各组从实验第1天起同时采用长期激怒法[2]造成肝肾阴虚证。在模型复制成功的基础上每日上午模型组、建瓴汤组、降脂灵片组及辛伐他汀组继续给予高脂饮食喂饲并采用长期激怒法，每日下午各给药组按2 ml/100g体重折算。分别予建瓴汤3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg，降脂灵片混悬液0.108 g/kg，辛伐他汀混悬液0.0037 g/kg灌胃，其余两组给予同等剂量的蒸馏水，连续灌胃30天。
1.2.3 指标检测
按照原位杂交的取材操作规程将新鲜的肝组织切成不超过 4mm 的小块，及时固定、脱水、浸蜡、包埋，切片。按照试剂盒说明书操作进行脱蜡、 暴露mRNA核酸片段、后固定、预杂交、杂交等操作，DAB显色、苏木素复染，二甲苯透明，封片。
以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性。每张切片随机取5个高倍镜视野（400倍）， 用北航医学图像分析系统（4.0版本）进行分析，测定原位杂交阳性率（%）。
1.3 统计学处理
数据以均数±标准差（ ）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间比较用q检验，以P
2 实验结果
注：空白组与模型对照组比较 *P
表1可见，空白对照组 LDLRmRNA表达阳性肝细胞较多。模型对照组表达阳性肝细胞少见，与空白对照组、建瓴汤高剂量组、建瓴汤中剂量组、建瓴汤低剂量组、辛伐他汀组、降脂灵片组比较有显著差异（P
3 讨论
高脂血症是指血浆脂质的一种或多种成分的浓度超过正常高限时的病理表现，是一种发病率高、人群分布广和危害性大的代谢性疾病，它常是动脉硬化和冠心病的前奏。而心脑血管疾病又是当今人类健康危害最大的杀手，居所有疾病的死亡率之首，所以加强对高脂血症的防治研究就显得至关重要。
中医学无“高脂血症”这一名称，但对其早有认识，其内容散见于“痰浊”、“肥人”、“中风”、“眩晕”及“消瘅”等病。高脂血症病机可由肝肾阴亏，肝阴不足，阴不制阳，以致肝阳上亢；而肾水不足，水不涵木，也常致肝阳上亢。肝阳化火，煎熬津液而成痰浊，也能引发本病。建瓴汤有滋阴和肾、平肝潜阳之功，正切中病机。研究建瓴汤降脂作用机理尚处在起步阶段。
LDLR基因表达异常是体内血脂增高尤其是胆固醇升高的重要原因，也是动脉粥样硬化和冠心病的主要危险因素。人类的低密度脂蛋白受体基因全长超过46kb，由18个外显子和17个内含子组成，其中第18号外显子的长度为2535bp。LDLR功能缺陷是引起高胆固醇血症及动脉粥样硬化（Atheroscleros，AS，）的主要原因之一。LDLR是一种跨膜糖蛋白，在维持血浆胆固醇水平恒定中发挥重要作用， LDLR数量、结构及功能异常时，血浆胆固醇水平增高， 最终导致AS斑块形成，引发冠心病。血浆中LDL的浓度首先是由肝脏决定的，原因之一就是肝脏是受体介导的LDL胆固醇清除发生的主要场所。LDLR可以结合并摄取血浆中含有载脂蛋白B和载脂蛋白E的脂蛋白（特别是LDL），内吞后， LDLR与配体解离返回细胞膜再利用， LDL进入进一步的代谢。血液中70%的胆固醇由LDL和VLDL携带，而其中90% LDL是通过LDLR途径清除的，肝脏是降解LDL的主要器官，约50%的LDL在肝降解。因此肝脏LDL-R表达的高低能够决定并反映血中胆固醇的代谢水平[3]。
研究表明中药复方或单方可通过多部位、多靶点增强肝脏LDL-R基因表达，促进LDL-R蛋白合成，综合调节和纠正脂质代谢。金华等[4]应用调肝导浊中药观察体外培养肝细胞膜LDL-R-mRNA表达水平，发现肝细胞膜LDL受体增加，不仅超过未用药的高脂血清培养组，而且高于正常组，提示中药可能直接作用于肝细胞LDL受体基因或影响基因某个环节而使转录增加，提高肝细胞LDL受体的活性而降血脂；研究[5]黄连解毒汤降脂作用机制，发现黄连解毒汤可能是通过提高肝脏脂代谢酶的活性，促进肝脏LDLR mRNA的表达来调节脂质代谢紊乱的。李小玲[6]发现单味中药丝瓜络对实验性高脂血症小鼠有明显的降血脂效应，且能使实验性高脂血症小鼠肝组织的LDL-RmRNA表达增强。
本实验结果表明，建瓴汤能显著上调高脂血症大鼠肝脏 LDLR 基因表达水平，提示建瓴汤通过促进肝脏LDLR mRNA的表达调整脂质代谢紊乱，这与其他学者研究中药降脂作用机理类似 ，但是建瓴汤通过何种LDLR调节机制促进肝脏LDLR mRNA的表达，经过哪些信号分子或通路间的相互作用，转录及转录后水平的调节机制等，均有待进一步研究。
参考文献
[1] 俸道荣，韦斌.建瓴汤对实验性肝肾阴虚高脂血症大鼠血脂及脂质过氧化的影响[J].广西中医药，2009， 32（4）：51-54.
[2] 樊蔚虹，岳广欣，李素香，等.长期激怒致肝肾阴虚证动物模型研制[J].中国中医基础医学杂志，2001，7（9）：67-69.
[3] Stlning TM，KlockerH，Harwood HJ. In vivo LDL receptor and HMG-CoA reductase regulation in human lymphocytes and its alteration during aging[J]. JArteriosoclerThromb Vasc Bio，l 1995， 15： 872.
[4] 金华，陆一竹.调肝导浊中药对家兔实验性动脉粥样硬化脂质代谢的影响[J].中草药， 2002， 33（4）： 336-338.
[5] 金瑾，张扬，胡文祥，等.黄连解毒汤对高脂血症大鼠血脂代谢及其相关基因表达的影响[J].中西医结合学报，2010，8（3）：275-279.
［关键词］ LOX_1；U937细胞；ox_LDL；凋亡；卡托普利
中图分类号：R363 文献标识码 ：A 文章编号：1009_816X(2007)03_0164_04
The Effect of LOX_1 on U937 Cell Apoptosis Induced by Oxidized LDL an d the Protective Effect of Captopril. QI Yan-hong, ZHENG Yang. Depart ment of Cardiology, The First Clinical Hospital of Jilin Universityf, Jilin 1300 21, China
［Abstract］ Objective To investigate the effect of LOX_1 on U93 7 cell apoptosis induced by oxidized LDL and the protective effect of Captopril. Methods U937 cells were preincubated with different LOX_1 inhib itors and captop ril for 1 hour, then incubated with ox_LDL 100ug/ml for 24 hours. The change of apoptosis and proteolytic enzymes was observed. The degree of U937 cell apoptosi s was determined by flow cytometry. The expression of caspase 3, 8 and 9 was det ected by immunohistochemistry and Western Blot. Results Incubati on U937 cell with ox_LDL can induce U937 cell apoptosis and significant upregula te the expression of caspase 3, 8 and 9. Preincubation U937 cell with LOX_1 inhi bitors PIA, carrageenan and captopril for 1 hour could significantly suppresse U 937 cell apoptosis induced by ox_LDL and restraine the increase of caspase 3,8 a nd 9 (P＜0.05). Conclusions LOX_1 played a key role on U937 cell apoptosis induced by ox_LDL. Ox_LDL/LOX_1 interaction on U937 cell can ind uce apoptosis via death receptor and mitochondria pathway. Captopril can protect U937 cell from ox_LDL induced apoptosis.
［Key words］ U937 cell; ox_LDL; LOX_1; Captopril
氧化型低密度脂蛋白(oxidized low_density lipoprotein receptor, ox _LDL)是致动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)的一个重要的危险因素，实验证实ox_LDL以 时间浓度依赖诱导U937细胞的凋亡从而促进泡沫细胞的形成，促进AS的发生，发展［1 ］。血凝素样氧化低密度脂蛋白受体(lectin_like oxidized low_density lipoprotein r eceptor LOX_1)是新近发现的一种ox_LDL受体，主要存在于内皮细胞的表面，它可以中和降 解ox_LDL，进一步引发斑块内细胞凋亡、基质的降解和炎症反应等导致动脉粥样斑块破 裂和血栓形成。研究表明LOX_1在内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞表面都有表达［2］ 。并且在ox_LDL的作用下U937细胞表面LOX_1的表达明显增加［3］，本文探讨LOX_ 1与U937细胞凋亡的关系和卡托普利的干预作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验仪器：二氧化碳孵箱(PKI日本)，倒置显微镜(物镜10×或20×，目镜10×)(H und D-6330Wetzlar21德国)，超净工作台(SW-CT-EFD苏州)，恒温水浴箱(H2S-H哈尔滨)，低 温台式离心机(AERMLE2383K德国)。
1.1.2 实验试剂：人骨髓系白血病细胞U937由吉林大学基础免疫教研室馈赠，低密度脂 蛋白(nLDL)和氧化低密度脂蛋白(ox_LDL)购自北京协和医院基础研究所。IMDM培养基(PH7. 2，100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素)(Sigma Chemical Co. USA)，10%胎牛血清，D-Hank 's液，其他试剂为国产分析纯，Caspase3、8、9单克隆抗体均购自Santa Cruz公司。其它二 抗和显色剂购自鼎国公司。LOX_1拮抗剂聚肌苷酸(Polyinosinic acid PIA)和角叉菜胶购自 Sigma公司。卡托普利纯品(中美上海施贵宝公司馈赠)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及实验分组
用IMDM培养液和10%胎牛血清，常规方法培养U937细胞，2～3d传代，待细胞传至需要数量时 即可用于实验。实验共分六组：(1)对照组：细胞置IMDM培养基中于5%CO2、37℃、饱和湿 度 培养箱中培养。(2)LDL组(nLDL):在培养瓶中加入nLDL(100ug/ml)，其他同对照组。(3)ox_L DL组：在细胞的培养瓶中加入ox_LDL(100ug/ml)，然后在IMDM培养基中于5%CO2、37℃、 饱 和湿度培养箱中培养24小时。(4)PIA组：PIA(250ug/l)处理1小时后加入ox_LDL 100ug/ml共 同培育24小时。(5)角叉菜胶组：角叉菜胶(250ug/l)处理后ox_LDL 100ug/ml共同培育24小 时。(6)卡托普利组：卡托普利(10-5mol/L)处理1小时后加入ox_LDL 100ug/ml共同培 育24小时。
1.2.2 流式细胞术(FCM)检测凋亡：分组分瓶收集细胞(1×106个)。离心(1000r/min)5 min弃上清液，沉淀中加入2ml磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，离心(1000r/min)5min。弃上清液， 加75%冷乙醇2ml固定，置4℃保存。染色前用PBS离心沉淀去除固定液，加入20μl RnaseA 3 7℃水浴30min，再加800μl碘化吡啶染色液混匀，4℃避光30min。上机检测。
1.2.3 免疫组织化学技术检测caspase蛋白的表达：分组收集细胞，进行免疫组织化学染 色。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性片作为阳性对照。上镜观察阳性细胞数。 结果判定：阳性染色为细胞浆和(或)细胞核内有浅至深棕黄色颗粒，随机选择10个高倍视野 (×400)，记数1000个细胞中所占的阳性细胞数，计算百分比。
免疫印迹法(Western Blot)检测caspase蛋白的表达：取1×106个培养U937细胞洗涤，离 心，用加样缓冲液裂解细胞，100℃水浴10min，离心(10 000r×10min)，收集上清，采用考 马斯亮兰法进行蛋白定量，制备好的蛋白样品置-80℃冰箱保存备用。用20ug蛋白/泳道上样 ， 经12%聚丙烯酰胺凝胶SDS_PAGE电泳后，电转膜至硝酸纤维膜。室温封闭3h加1：100 caspas e蛋白的抗体，再加入1：200的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，采用二甲基 联苯胺(DAB)显色试剂盒进行显色约2～5min，待蛋白条带显色清晰时中止反应，拍摄照片， 记录实验结果。
1.3 统计学处理
各种计量数据均以均数±标准差表示，各组数据间显著性检验采用t检验，统计学分析应用S AS(6.12)软件包。P＜0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 各U937细胞凋亡率
各组细胞经流式细胞仪检测DNA周期的结果发现，正常培养的细胞DNA多处于G0/G1期，凋亡 率为(0.098±0.022)%，而ox_LDL处理的细胞DNA在G0/G1期前出现了明显的“亚二倍体峰 ”，又称凋亡(AP峰)，凋亡率为(12.77±1.41)%。卡托普利组与C组相比凋亡率增加，为( 1.02±0.166)%；与ox_LDL组相比，凋亡率减少。应用LOX_1阻断剂PIA和角叉菜胶后，凋 亡率分别为(4.94±0.47)%和(2.62±0.656)%与C组相比凋亡率增加，与ox_LDL组相比凋 亡率减低，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
2.2 LOX_1对凋亡蛋白酶的影响和卡托普利的作用
正常状态下，细胞核为圆形，周边整齐光滑，胞质和胞核内未见有棕黄色着色，经ox_LDL处 理 24小时后细胞体积缩小、细胞核出现凹沟，有的细胞核分裂成数个小核，符合细胞凋亡的光 镜学特征，在Caspase3、8、9染色的细胞核内均可见棕黄色颗粒着色，其阳性细胞百分率与 对照组明显增多(P＜0.05)。应用药物和阻断剂后可见细胞数目增多，与ox_LDL相比Ca spase3、8、9表达明显减少(P＜0.05)，见表1。
同时应用免疫印迹法发现ox_LDL作用U937细胞24小时后caspase3、8、9的免疫印迹条带的颜 色明显加深，密度增加，其蛋白质的表达量明显增多，应用药物卡托普利和LOX_1阻断剂PIA 和角叉菜胶可见其含量明显减少(图1)。
3 讨论
大量研究证实ox_LDL在动脉粥样硬化的形成和发展中扮演重要角色，而血管细胞通过受体介 导的方式中和降解ox_LDL。1997年Sawamura等［4］证明这一功能受体为血凝素样氧 化低密度脂蛋白受体(LOX_1)，它属于II型单链跨膜蛋白，有一个短的N端胞浆亲水结构和一 个 长的C端胞外亲水结构域，中间为疏水区域，从结构上看属于C型选择素家族。LOX_1作为ox_ LDL的受体与以往的清道夫受体(如CD36)不同，它具有高度的配体特异性，可以结合、内吞 、 降解ox_LDL，但对天然低密度脂蛋白(nLDL)和乙酰化低密度脂蛋白(ac_LDL)则无作用［ 5］，表明ox_LDL与LOX_1的结合是特异的，此过程可被LOX_1阻滞剂PIA和角叉菜胶抑制［6］。正常条件下主动脉内膜和富含血管的器官如胎盘，肺，脑，肝等中都有LOX_1的 表达，在胸主动脉的动脉粥样斑块中和培养的主动脉内皮细胞，巨噬细胞，血管平滑肌细胞 也有此表达［2］。
已有研究证实ox_LDL诱导斑块内多种细胞凋亡都有LOX_1的参与。双重免疫斑点实验证实LOX _1表达与凋亡共存在［7］，其主要集中在斑块中有破裂倾向的区域。在培育的牛主 动脉平滑肌细胞［8］，ox_LDL通过使受胞外信号调控的激酶磷酸化，从而上调LOX_1 介导凋亡，LOX_1中和抗体可阻止细胞通过LOX_1对ox_LDL的摄取从而抑制ox_LDL诱导凋亡过 程，该抗体也抑制由ox_LDL引起Bax/Bcl-2的增加，因此ox_LDL通过LOX_1调节Bax/Bcl-2比 例诱导SMC 凋亡。把人脐静脉内皮细胞与抗Fas抗体激动剂CH11和低浓度ox_LDL共孵育测凋亡，发现ox_ L DL浓度依赖性上调Fas的表达，从而促进Fas介导的凋亡，LOX_1中和抗体则阻止LOX_1介导的 对ox_LDL的摄取，从而抑制凋亡。因此ox_LDL通过与LOX_1相互作用上调细胞表面Fas，调节 Fas系统介导凋亡，从而通过死亡受体途径诱导凋亡［9］。在人冠状动脉内皮细胞， Li等［6］发现与ox_LDL共孵育24小时LOX_1蛋白质和mRNA表达明显增加，而与nLDL共 同培养则无此现象，这种上调作用可被反义LOX_1抑制，但不被顺义LOX_1所抑制，PIA和角 叉菜胶也降低ox_LDL介导的凋亡。
在粥样斑块内尚存在巨噬细胞凋亡，然后坏死，使脂核不断增大，同时巨噬细胞凋亡使其对 脂质，胆固醇消除减少，促进AS的发生发展。ox_LDL可诱导巨噬细胞凋亡的发生，可诱导细 胞表面LOX_1的表达，但LOX_1与巨噬细胞凋亡的关系研究较少。研究证实在ox_LDL可时间和 浓度依赖性诱导U937细胞凋亡和LOX_1的表明［1，3］，本文应用LOX_1的化学阻断剂 PIA的角叉菜胶探讨LOX_1在这一过程中的作用，结果表明LOX_1阻断剂可使ox_LDL诱导U937 细胞凋亡百分比减少，同时凋亡蛋白酶caspase3、8、9表达均减少。在细胞凋亡中的信号通 路及通路分子中，目前认为主要通过两条信号通路发生，一条是通过Fas和Fas配体激活天冬 氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶8(Caspase8)和3(Caspase3)的死亡受体途径，另一条是通过细胞 色素C释放进而逐步激活天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)和3(Caspase3)的线粒 体途径。本实验结果显示U937细胞通过LOX_1摄取ox_LDL进而诱导细胞凋亡，应用LOX_1阻断 剂后Caspase8，9，3的表达减少，提示ox_LDL通过与LOX_1结合后是通过上述两条信号通路 诱导U937细胞凋亡现象的发生。
肾素_血管紧张素_醛固酮和动脉粥样硬化发生和发展之间有着密切的联系［10］，有 研究证实血管紧张素(Ang)II可上调LOX_1的表达［11］，ACEI为血管紧张素转换酶抑 制剂，它可抑制AngI向AngII的转换，从而使LOX_1的表达减少。本文在培养液中预先加入AC EI类代表药物卡托普利，发现ox_LDL诱导的U937细胞的凋亡现象明显减少，免疫组织化学染 色亦证实应用卡托普利处理后细胞凋亡蛋白酶表达明显减少，表明卡托普利可抑制ox_LDL对 U937细胞的损害作用，其具体机制尚待进一步研究。
总之，ox_LDL是导致AS的重要的危险因子，ox_LDL与其受体LOX_1结合通过以caspase为代表 的两条信号通路引起U937细胞凋亡，促进AS的发生、发展，ACEI类药物卡托普利则可通过抑 制ox_LDL的上述作用，起到抗动脉粥样硬化作用，这为我们对AS的发生发展机制的研究及其 防治方法提供新的思路。
参考文献
［1］齐艳红，郑杨，王凌云.氧化低密度脂蛋白对U937细胞凋亡的影响及其机制的 研究［J］.中国心血管杂志，2005，4：255-257.
［2］Kume, N, Moriwaki H, Katalka H, et al. Inducible Expression of LOX_1, a Nov e l Receptor for Oxidized LDL, in Macrophages and Vascular Smooth Muscle Cells［J ］. Annals of the New York Academy of Sciences, 2000, 902:323-327.
［3］齐艳红，郑杨，曾炜炜.ox_LDL诱导U937细胞LOX_1的表达及其卡托普利的干预作用［ J］.心血管康复医学杂志，2007，16(1)：21-24.
［4］Sawamura T, Kume N, Aoyama T, et al. An endothelial receptor for oxidized l ow_density lipoprotein［J］. Nature, 1997, 386(1):73-77.
［5］Kume N, Murase T, Moriwaki H, et al. Inducible Expression of Lectin_like Ox i dized LDL Receptor_1 in Vascular Endothelial Cells［J］. Circulation Research, 1998, 83(3):322-327.
［6］Li D. Y, Mehta JL. Antisense to LOX_1 inhibits oxidized LDL_mediated upregu lation of monocyte chemoattractant protein_land monocyte adhesion to human coron ary artery endothelial cells［J］. Circulation, 2000, 101(25):2889-2895.
［7］Kataoka H, Kume N, Miyamoto S, et al. Expression of Lectin_like Oxidized Lo w_Density Lipoprotein Receptor_1 in Human Atherosclerotic Lesions［J］. Circula tion, 1999, 99(24):3110-3117.
［8］Kataoka H, Kume N, Miyamoto S, et al. Oxidezed LDL modulates Bax/Bcl_2 thro ugh the lectin_like ox_LDL receptor_1 in vascular smooth muscle cells［J］. Art eriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology, 2001, 21(6):955-960.
［9］Imanishi T, Hano T, Sawamara T, et al. Oxidixed low_density lipoprotein pot entiation of Fas_induced apoptosis through lectin_like oxidized_low density lipo protein receptor_1 in human umbilical vascular endothelial cells［J］. Circ J, 2002, 66:1060-1064.
［10］Nickenig G, Harrison DG. The AT(1)_Type angiotensin receptor in oxidative stress and atherogenesis: part1: oxidative stress and atherogenesis［J］. Circu lation, 2002, 105(3):393-396.