单核细胞范文

单核细胞篇1

病历资料

患者，女，65岁，约2个月前开始有感冒症状且难以好转，1个月前发现右上牙龈肿大疼痛，波及面部软组织。曾在当地诊所抗炎治疗后，面部肿胀消退，但牙龈仍旧肿大，进食时疼痛。专科检查：颜面部上、中、下1/3等长，左右对称，双侧颌下及颈部未见明显红肿及异常肿物。张口度3指，咬合关系大致正常，右上17～13腭侧牙龈明显增生，平咬合面，质稍硬，口腔卫生差，牙结石较多，牙龈慢性炎症。口腔其他部位黏膜，色泽正常，未见明显红肿及溃疡。舌体活动自如，无感觉及运动功能异常。各涎腺导管口无红肿及脓性分泌物溢出。右侧颌下可扪及数个肿大淋巴结，有扪痛。心电图示：部分T波改变，Q-T间期延长。肺腹无异常。

实验室检查：血象，白细胞15.9×109/L，中性杆状核2%，中性分叶核8%，淋巴细胞17%，中幼红1%，晚幼红2%，幼单核细胞39%，单核细胞31%。红细胞1.71×1012，血红蛋白61g/L。血小板59×109/L。骨髓象，骨髓有核细胞增生活跃（分类见表），粒、红、巨三系增生减低。全片见4个巨核细胞，皆为颗粒巨核细胞，血小板散在、三五成群可见。幼单核细胞52.5%（NEC），此类细胞大小不一，形态不规则，有伪足；浆灰蓝、不透明，有多少不一的嗜天青颗粒；核形不规则，笔架形、马蹄形、S形、肾形等；核染色质疏松，核仁不明显。POX（±），CE（-）。诊断急性单核细胞白血病（M5b）。上颌腭侧牙龈肿块病理示：固有层大量淋巴样肿瘤细胞弥散分布，细胞核大，扭曲，不规则，染色质细颗粒状，可见病理性核分裂。免疫组化示：CD56（+），CD45Ro（2+），TIA-1（+），Ki-67（40%+），Perforin（-），CK（-），CD3（-），CD4（+/-），CD8（-），CD20（-），CD79a（-），CD138（-），CD34（-），CD5（-），CD23（-），CyclinD1（-）。诊断NK/T细胞淋巴瘤。

讨 论

NK/T细胞淋巴瘤常见于中年男性。本病有地域性或种族易感性，多见于亚洲和拉丁美洲，高发于东亚，而北美洲和欧洲很少。恶性肿瘤细胞常浸润腔道组织器官，引起被浸润的组织器官大块状坏死。因NK/T细胞淋巴瘤常发生于淋巴结外，少部分来源于NK样T细胞。所以，NK/T细胞淋巴瘤亦叫结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型。该病例由病理诊断证实。

急性单核细胞白血病（M5b）属于急性髓细胞白血病（AML）范畴，M5b约占AML的3%～6%。多见于中老年人，起病急骤，常有急性白血病的一般症状如：贫血、发热、出血等。可有肝、脾、淋巴结肿大，但其发生率和严重程度不及急性淋巴细胞白血病（ALL）而高于急性粒细胞白血病（AGL）。由于单核细胞特有的吞噬及游走功能，因而，髓外浸润症状多见，如口腔（牙龈肿胀、溃疡等）和皮肤（皮疹、结节、溃疡等）病变。单核细胞胞浆中富含溶菌酶，因而，溶菌酶的增加亦会损害组织器官。本病例，血象和骨髓象中的单核细胞分别占39%和52.5%（NEC），POX（±），CE（-），所以诊断M5b成立。

单核细胞篇2

【关键词】 Ghrelin；单核吞噬细胞；免疫调节；细胞因子；抗炎

【中国分类号】 R57【文献标识码】 A【文章编号】 1044-5511（2012）02-0378-02

骨髓内的幼单核细胞分化为单核细胞进入血液，此后穿出毛细血管，进入不同的组织后进一步分化发育，形成了单核-吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system, MPS )的各种细胞。该系统包括外周血中的单核细胞、结缔组织的巨噬细胞、骨组织的破骨细胞、神经组织的小胶质细胞、淋巴组织内的（交错突细胞）树突状细胞、肝巨噬细胞（Kupffer细胞）、肺的尘细胞以及表皮内的郎格汉斯细胞（Langerhans cell）等。MPS是机体内具有强大吞噬功能的细胞系统，这类细胞均具有相同的免疫学特性和功能，参与抗原提呈、免疫应答和分泌多种生物活性物质。

Ghrelin是Kojima等［1］1999年首先从大鼠和人的胃黏膜X/A样内分泌细胞中发现的一种生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor, GHS-R）的内源性配体。其主要生理功能包括刺激食欲及摄食行为、调节能量平衡和生长激素释放。进一步的研究发现，Ghrelin对心血管、生殖和免疫系统功能均有调控作用［2］。近年的研究表明，Ghrelin可能是一种免疫调节剂，具有抑制免疫反应和下调炎症因子的作用。Ghrelin及其它人工合成的GHS-R的配体可能作为内分泌-神经-免疫调节网络的信号分子发挥作用［3］。以巨噬细胞为代表的单核吞噬细胞是主要的炎症反应调节细胞，在炎症和免疫反应中发挥重要作用。本文就ghrelin的生物学特性及其在调控单核吞噬细胞功能中的作用和可能机制进行探讨。

1. Ghrelin的生物学特性

1.1 Ghrelin的结构 Ghrelin是一种含28个氨基酸的脑-肠肽。"ghre"在古印欧语系中为""之意，而"lin"为肽类激素的后缀，至今尚无公认的中译名，有学者将其译为生长素、胃促生长素、饥饿激素或胃饥饿素等［4］。人类Ghrelin基因定位于3p25-p26，包括4个外显子和3个内含子，可编码一个含117个氨基酸的被称为前Ghrelin原的多肽。通过选择性剪切机制，大鼠胃Ghrelin基因可产生两种Ghrelin原异构体的mRNA：Ghrelin和des-Gln14-Ghrelin前体分子mRNA。Ghrelin与胃动素（motilin）在结构上有36%同源性，des-Gln14-Ghrelin除缺少第14位的谷氨酸外，其它氨基酸序列和辛酰基化基团与Ghrelin相同。人和鼠的前体Ghrelin分子经翻译后修饰产生一种含有28个氨基酸的辛酰化蛋白，分子量3300kDa，其生物学活性取决于N端第3位丝氨酸残基上的酰基化基团，迄今发现的数种Ghrelin翻译后修饰的酰基化基团中辛酰基化的形式活性最强。去酰基化的Ghrelin即丧失了与GHS-R结合的能力。Ghrelin受体（GHS-R）属于典型的G-蛋白耦联受体，其编码基因位于3q26.2, 具有高度保守性，目前已知GHS-R1a 和GHS-R1b 2种亚型。GHS-R1a受体亚型由366个氨基酸组成，具备完整的7个跨膜区，为Ghrelin的功能性受体，可促进GH释放；而GHS-R1b受体亚型只有前5个跨膜区段，含289个氨基酸，为Ghrelin的非功能性受体，不能与Ghrelin和GHSs结合，但分布于多种组织和器官，GHS-R1b的生物学功能尚不清楚。Ghrelin的作用由GHS-R1a所介导，二者结合后，可经磷脂酶C（PLC）、甘油二酯（DG）、三磷酸肌醇（IP3）和蛋白激酶C（PKC）途径使胞浆内Ca2＋浓度增高而发挥各种效应［5］。

1.2 Ghrelin及其受体在免疫系统的表达 迄今的研究证明，Ghrelin受体GHS-R1a表达于神经系统、胰腺、淋巴组织、生殖系统和胃肠组织；多种肿瘤细胞上亦有GHS-R1a表达，与癌细胞的生长和转移有关［3,6］。 在免疫系统，GHS-R1a表达于人T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓样白血病细胞系和人外周血单核细胞，以及啮齿类动物和人的免疫器官；GHS-R1b亦分布于多种免疫组织［7］。胃黏膜是Ghrelin的主要来源，小肠、胰腺、心脏、肝脏、肾脏、下丘脑、垂体、卵巢和、甲状腺和肾上腺、胎盘等多种器官和组织亦有表达［6］。在免疫系统，ghrelin-mRNA和蛋白表达于人、啮齿类和鱼类的淋巴器官、B淋巴细胞、T淋巴细胞亚群、单核细胞和自然杀伤细胞。ghrelin通过GHS-R特异性地抑制致炎性细胞因子的表达，提出ghrelin做为免疫系统与代谢轴耦联的关键信号分子的观点［8］。Waseem等的研究证实ghrelin及其受体GHS-R1a表达于小鼠RAW264.7巨噬细胞，我们的研究发现ghrelin定位于人胸腺巨噬细胞［9,10］。巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的主要细胞成分，已有研究表明，ghrelin及其受体系统对单核吞噬细胞的多种功能均有调节作用。

2. Ghrelin对MPS细胞功能的调节作用

2.1 Ghrelin调节MPS细胞黏附与吞噬功能 Yada等［11］首先发现，ghrelin可刺激虹鳟鱼白细胞的吞噬作用和过氧化物生成。Ghrelin（10nM）可增加酵母聚糖诱导的鳟鱼前肾分离的吞噬性白细胞过氧化物的产生；GHS-R拮抗剂［D-Lys3］-GHRP-6可阻断ghrelin对过氧化物生成的促进作用。Ghrelin增加鳟鱼吞噬性白细胞超氧化物岐化酶mRNA水平和GH的表达，免疫中和GH可阻断ghrelin促进过氧化物生成的作用。Ghrelin可调节大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性，降低急性冷束缚应激大鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的增高［6,12］。在体外实验中ghrelin可增加人脐静脉内皮细胞血管内皮细胞黏附分子-1（VCAM-1）和细胞内黏附分子-1（ICAM-1）的表达；而单核细胞与血管内皮细胞的黏附功能并无明显改变。高迁移率簇蛋白-1（HMGB1）是一种DNA结合因子，作为一种晚期炎症因子参与脓毒症的发病进程。Ghrelin可阻断巨噬细胞内HMGB1的胞浆转位，进而抑制HMGB1的分泌，减轻晚期炎症反应；ghrelin还可表现出强效的抗菌活性［13,14］。上述研究表明ghrelin可调节单核吞噬细胞的黏附、吞噬和杀菌功能，进而调节炎症和免疫反应。

2.2 Ghrelin对MPS细胞分泌功能的影响 近年来发现，单核细胞和巨噬细胞可分泌近200种生物活性物质，在细胞的生长到死亡的诱导中均起作用。Granado等［15］首先在体外培养腹腔巨噬细胞中加入GHRP-2或ghrelin，可阻止内毒素引起的巨噬细胞IL-6分泌，降低亚硝酸盐/硝酸盐释放。高脂饮食小鼠腹腔巨噬细胞ghrelin的表达下降，而自主运动可使其恢复至正常水平；在体外培养的巨噬细胞系RAW264细胞，用siRNA抑制ghrelin表达可增加TNF-α的表达和LPS诱导的NF-κB活化，而ghrelin可抑制LPS诱导的RAW264细胞TNF-α表达［16］。ghrelin可通过活化GHSR-1a减轻红藻氨酸（KA）-诱导的海马神经元死亡，其机制是ghrelin抑制KA-诱导的小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，抑制促炎症介质TNF-、IL-1?和COX-2的表达。在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）多肽致敏诱导的C57BL/6小鼠脑脊髓炎（EAE）模型，ghrelin皮下注射可显著降低EAE的严重程度；并伴有脊髓内细胞浸润减少和小胶质细胞促炎性细胞因子TNF-、IL-1和IL-6mRNA水平下降；ghrelin可抑制体外培养小胶质细胞受LPS-诱导的促炎性细胞因子的分泌［17,18］。Ghrelin还能阻断MPTP-诱导的大脑黑质和纹状体内小胶质细胞激活，进而抑制促炎症性物质TNF-?和IL-1?的表达、以及iNOS的活化［19］。增生性肾小球肾炎患者肾组织中ghrelin表达显著降低；而ET-1和肾间质中CD68＋细胞增加，表明增生性肾小球肾病时低水平的ghrelin可能与间质单核细胞/巨噬细胞的过度聚集和活化有关［20］。循环血中去酰基化ghrelin含量高于酰基化ghrelin。酰基化蛋白硫酯酶1(APT1)/磷脂酶B I 是ghrelin去酰基化酶。LPS可刺激RAW264.7巨噬细胞分泌高浓度的APT-1［21］。

2.3 Ghrelin通过调控单核细胞功能影响动脉粥样硬化形成 巨噬细胞在动脉粥样硬化症的发病中具有重要用，巨噬细胞通过清道夫受体CD36增加氧化低密度脂蛋白的摄取，导致泡沫细胞形成。大量证据表明，ghrelin参与轻度炎症性疾病如肥胖和动脉粥样硬化的发生。Ghrelin可减少巨噬细胞内胆固醇酯的含量，并降低单核/巨噬细胞泡沫化过程中胆固醇酰基转移酶1（ACAT-1）mRNA和蛋白水平，抑制泡沫细胞形成，延缓动脉粥样硬化的发生［22］。人工合成的GHS-Hexarelin和EP80317亦可结合小鼠巨噬细胞上的CD36受体，抑制动脉粥样硬化斑块的沉积形成。Demers等［23］的研究发现，ghrelin/GHS-R1a和清道夫受体CD36的共同激活可诱导巨噬细胞经活化PPAR增加胆固醇释放，在动脉粥样硬化斑块形成中发挥一定作用。ghrelin通过Erk1/2和Akt激酶共同信号触发PPAR?活化，导致巨噬细胞下游效应分子LXR和ABC固醇转运体表达增加。ACAT-1和ABCA1可调控细胞内胆固醇稳态，在泡沫细胞形成中发挥重要作用。Cheng等［24］观察了不同浓度ghrelin对THP-1源性泡沫细胞ACAT-1和ABCA1表达的影响，发现ghrelin通过下调ACAT-1表达，同时上调ABCA-1表达途径抑制泡沫细胞形成，Ghrelin亦能降低泡沫细胞内胆固醇含量，增加胆固醇外流。Ghrelin的这些作用可分别被特异性GHS-R拮抗剂和PPARγ-特异性抑制剂所阻断。Ghrelin增加THP-1单核细胞对EA.hy926内皮细胞的黏附和细胞黏附分子-1的表达。TNF-+Ghrelin刺激可降低单核细胞黏附，以及内皮细胞黏附分子-1和单核细胞化学趋化蛋白-1（MCP-1）的表达；ghrelin可增强氧化低密度脂蛋白（oxLDL）对硫胶质诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的结合作用。这表明在动脉粥样硬化病程早期ghrelin可促进动脉粥样硬化形成；而在动脉粥样硬化形成中晚期ghrelin具有抗炎作用；而在人脐静脉静脉内皮细胞，ghrelin抑制基础和TNF-诱导的细胞因子释放、单核细胞聚集和NF-kB活化；抑制H2O2诱导的细胞因子释放，从而保护血管内皮细胞，抑制和延缓动脉粥样硬化的发生［25,26］。Avallone等［27］ 的研究发现，GHS-hexarelin处理THP-1巨噬细胞后PPAR的磷酸化程度增加，提示CD36和ghrelin受体下游信号可调节巨噬细胞的PPAR?和胆固醇代谢。 总之，ghrelin可通过改善血管内皮细胞功能，抑制炎症反应，减少泡沫细胞产生等作用，减少和延缓动脉粥样斑块的形成。

3. Ghrelin调节单核吞噬细胞功能的机制

3.1 副交感神经抗炎通路 刺激迷走神经可通过抑制巨噬细胞和内皮细胞的活化抑制全身性炎症反应。在大鼠肠缺血再灌注（I/R）损伤模型，ghrelin注射可抑制促炎性细胞因子释放，减少中性粒细胞浸润，减轻小肠黏膜屏障的功能障碍，提高动物的存活率；注射ghrelin受体拮抗剂可加重肠I/R引起的器官损伤和死亡率；迷走切断术可阻断ghrelin对肠I/R的保护作用，说明ghrelin对肠I/R损伤的保护作用是通过胆碱能抗炎通路实现的［28］。在盲肠结扎穿孔（CLP）大鼠脓毒症模型，灌注ghrelin可显著降低脓毒症大鼠血浆和腹腔液中TNF-和IL-6水平，迷走神经切断术可阻断ghrelin对TNF-?和IL-6生成的下调作用；而ghrelin并不抑制LPS刺激体外培养的肝Kupffer细胞或腹腔巨噬细胞TNF-和IL-6的分泌。这也说明Ghrelin对脓毒症大鼠促炎性细胞因子的下调作用是通过激活迷走神经实现的。迷走神经激活降低巨噬细胞促炎性细胞因子分泌效应由?7-胆碱能受体介导［29］。

3.2 基质金属蛋白酶 Ghrelin对小胶质细胞和星形胶质细胞活性的抑制作用与其抑制受损海马神经元基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的表达有关［16,18］。Ghrelin可通过小胶质细胞失活，促进多巴胺能神经元的存活，这种效应是以抑制受刺激多巴胺神经元MMP-3的表达间接实现的［19］。

3.3 一氧化氮 Ghrelin减轻LPS-诱导的急性肺损伤的炎症反应，抑制促炎性细胞因子生成，增加支气管肺泡灌洗液中一氧化氮（NO）含量。Ghrelin还可抑制体外培养的巨噬细胞LPS-诱导的促炎症性细胞因子的表达，增加一氧化氮合酶（NOS）活性和培养上清液的NO浓度；Ghrelin的抗炎作用可被L-NAME阻断［30］。

此外，ghrelin可增加脓毒症大鼠肝组织MAPK磷酸酶-1（MKP-1）mRNA和蛋白的表达；NE处理Kupffer细胞和RAW264.7细胞可下调MKP-1mRNA表达，这说明ghrelin通过抑制肠源性NE释放，导致促炎症性细胞因子分泌下调，ghrelin的这种作用由MAPK磷酸酶-1（MKP-1）介导［31］。

4. 展望

Ghrelin可影响多种器官系统的功能，在减轻免疫反应和病理性炎症状态中起重要作用。在炎症反应中ghrelin以互补方式影响促炎症性和抗炎症性细胞因子的生成。Ghrelin抑制促炎症通路，同时增强抗炎症成分的功能特点，提示其在病理性炎症状态下的强效抗炎作用。探讨ghrelin在不同炎症状态中的作用及其调节机制具有重要的理论意义和临床价值。巨噬细胞是重要的免疫反应调节细胞，ghrelin可调节单核吞噬细胞系统的吞噬和分泌功能。未来的研究重点应着重探讨ghrelin调节单核吞噬细胞功能的作用机制及其在炎症免疫反应中的信号转导通路。对这一领域的深入研究，有可能寻找到治疗免疫性炎症的新靶点。

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单核细胞篇3

【关键词】传染性单核细胞增多症；误诊；合并症

文章编号：1009-5519（2007）09-1324-02 中图分类号：R72 文献标识码：A

1临床资料

1.1诊断标准：参照实用儿科学第七版小儿传染性单核细胞增多症的诊断标准。（1）症状：发热，咽炎、扁桃体炎，颈部淋巴结肿大（1 cm以上），肝大（4岁以下：2 cm以上；4岁以上：可触及），脾大。（2）实验室检查：①血白细胞分类淋巴细胞占50%以上或淋巴细胞总数高于5×109/L。②异常淋巴细胞达10%以上，或总数高于1.0×109 /L。（3）EB病毒抗体检查：急性期EBNA抗体阳性；以下一项为阳性：①VCA-IgM抗体初期阳性，以后转阴。②双份血清VCA-IgG抗体滴度4倍以上。③EA抗体一过性升高。④VCA-IgG抗体初期阳性；后期EBNA抗体阳转。所有病例均参考以上标准，均未做EB病毒抗体检查。

1.2一般资料：36例中男16例,女20例，年龄1-3岁24例,3-8岁12例；冬春季发病24例，夏秋季发病12例。

1.3临床表现：发热36例(100%),咽峡炎36例(100%),颈淋巴结大32例(88.9%),腋窝及腹股沟淋巴结肿大16例(44.4%),肝大28例(77.8%),脾大16例(44.4%)，早期误诊为化脓性扁桃体炎18例（50%）,左侧周围性面瘫1例(2.8%),合并下呼吸道感染（支气管炎，肺炎）20例（55.6%）。

1.4实验室检查：血白细胞（20-28）×109/L 16例,（15-20）×109/L 8例,（10-15）×109/L 12例,淋巴细胞60%-80% 20例,40%-60% 16例,异常淋巴细胞等于或超过10% 36例;查嗜异性凝集试验24例,3例阳性;查肝功能30例,异常20例(66.7%),LDH升高15例，均在200-360U/L，ALT 80-100 U/L 16例,100-400 U/L 4例；查CK-及CK-MB 10例，CK升高仅2例，CK-MB升高1例，查BUN及Cr均无异常。

1.5治疗：全部病例入院后予病毒唑及对症治疗,12例加用干扰素3-5 U/(kg・d)肌肉注射,每天1次,共3天,平均住院8天,平均病程13天。

2结果

传染性单核细胞增多症早期误诊为化脓性扁桃体炎最常见，占50%。合并症中肝功能损害最常见，肝功能异常66.7%，其次为下呼吸道感染（支气管炎、肺炎）20例（55.6%）。

3讨论

本组病例外周血异常淋巴细胞等于或超过10%占100%，故在一般医院的实际工作中外周血异常淋巴细胞的检查非常重要。嗜异性凝集反应是本病诊断中较重要的线索之一，但本组患儿中阳性率低，占12.5%，本病患者中的嗜异性凝集素是一种IgM抗体，一般认为1：40以上即为阳性反应，它的出现与消失在时间上变异很大，小于5岁不易出现或出现晚，需反复查才能提高阳性率。本组嗜异性凝集试验为入院时检查，故阳性率低。传染性单核细胞增多症是一种全身性疾病，全身各脏器都可发生病变，本文资料显示肝功能损害最常见，其次为下呼吸道感染（支气管炎，肺炎）20例（55.6%）。实验室检查中肝功能异常占66.7%,与文献报道肝功能异常率75%[1]相符。肝功能异常中以LDH升高及ALT升高为主，且ALT升高为轻到中度升高，多数在100 U/L以内，与金玲等报道相符[2]。患儿合并下呼吸道感染机率亦较高，可能与本病是EB病毒经呼吸道侵入引起的疾病有关。

本病的临床表现复杂多样，没有特异性，易误诊为上呼吸道感染、扁桃体炎、急性白血病等，尤其在扁桃体周围有白色凝胶状物常误诊为化脓性扁桃体炎，本组患儿中18 例初期诊断为化脓性扁桃体炎，入院后经应用外周血异常淋巴细胞计数确诊，误诊率50%，曾报道34例传染性单核细胞增多症中有6例误诊为腭扁桃体炎，占14.8%[3]，可见该病误诊为扁桃体炎机率较高。误诊原因主要为该病初期表现为上呼吸道感染症状，出现扁桃体肿大，表面覆盖白色假膜，而其他症状较轻或主要症状偏少，且本病外周血的特征性表现为异常淋巴细胞升高，一般发病4-5天才升高，2-3周达高峰，一次检查阳性率偏低。提示在诊断婴幼儿的化脓性扁桃体炎时，血常规中淋巴细胞升高者应查异常淋巴细胞计数，有条件时查嗜异性凝集试验及EB病毒抗体。

单核细胞篇4

【摘要】

目的: 研究IFN-γ诱导上调表达的单核细胞MHC-I类链相关分子(MICs)分子对NK细胞的活化作用。方法: 采用密度梯离离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）， 以免疫磁珠法从PBMC中特异性分选单核细胞及NK细胞， 以细胞因子IFN-γ、 TNF-α刺激单核细胞后， 再将单核细胞与NK细胞共培养， 以流式细胞术（FCM）检测NK细胞表面CD69分子及胞内IFN-γ表达， 以51Cr释放试验检测NK细胞对K562细胞的杀伤效应。结果: IFN-γ上调人单核细胞表面MICs表达; IFN-γ刺激的单核细胞能促进异体NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达， 能增强NK细胞对K562细胞的杀伤效应; 单核细胞的这种效应至少部分依赖于IFN-γ上调的MICs分子， 因为用抗MIC抗体封闭或用细胞小室阻断细胞接触， 可以明显地抑制NK细胞的活化。结论: IFN-γ上调人单核细胞表面MICs分子介导了NK细胞的活化。

【关键词】 单核细胞 IFN-γ MHC-I类相关分子 NK细胞

活化的淋巴细胞（含NK、 T、 NKT细胞）分泌的细胞因子γ干扰素（IFN-γ）不仅具有直接的抗病毒作用， 更具有强大的免疫调节和修饰功能。目前认为， IFN-γ能广泛地作用于体内包括淋巴细胞在内的多种细胞。对于单核细胞， IFN-γ一方面可以影响其向DC或巨噬细胞分化; 另一方面， IFN-γ还能诱导单核细胞产生系列细胞因子［1， 2］。机体单核细胞正常情况下处于免疫静息状态， 但在适宜的条件下， 它可以通过转化为DC或者分泌大量细胞因子来参与或调节免疫应答。最近研究发现， 单核细胞与NK细胞或T细胞之间存在着对话机制， 并且IFN-γ及细胞间的直接接触是介导单核细胞与淋巴细胞相互作用的关键因素［3］。NKG2D是同时表达于人类NK细胞及CD8+T细胞表面的活化受体。对于NK细胞， 它直接启动活化信号; 对于CD8+T细胞， 它提供重要的共刺激信号［4］。MHC-I类链相关分子(MIC)是最早发现并且研究最多的NKG2D受体的配体。MIC是一种应激诱导表达的分子， 当细胞处于热休克、 氧化、 感染等状态时， MIC分子即被诱导表达于细胞表面。细胞表面的MICs作为一种应激“标记”分子， 能够被NK细胞或CD8+T细胞表面的NKG2D受体识别， 并刺激或共刺激NK细胞或CD8+T细胞活化， 最终清除异常细胞。研究发现， MICs分子低水平的表达于某些正常组织细胞如肠上皮细胞、 内皮细胞、 成纤维细胞表面， 单核细胞表面未见MICs表达［5］。NKG2D还在NK细胞、 T细胞、 DC及其他组织细胞中起着重要的“桥梁”作用［6］。但NKG2D是否也在单核细胞与NK细胞对话中发挥作用？ IFN-γ作用的单核细胞是否通过MIC-NKG2D促进NK细胞活化？ 我们对此进行了探讨。

1 材料和方法

1.1 材料 FITC标记抗人CD3（OKT3）、 CD14（61D3）、 CD69（FN50）、 IFN-γ（4S.B3）单克隆抗体（mAb）、 纯化及生物素化抗人NKG2D (1D11) mAb、 PE标记抗人CD56 mAb(NCAM)、 抗体的各同型对照抗体均购于eBioscience公司; 小鼠抗人MICs mAb(clone 159207)购于R&D公司; FITC标记的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG二抗购自北京中山生物技术有限公司。小鼠抗人CD14免疫磁珠（CD14 Magnetic Particles， Clone MфP9）、 磁性细胞分离架购于BD Bioscience Pharmingen公司; 人重组干扰素-γ（IFN-γ）、 重组干扰素-α（IFN-α）购自PeProtech公司; 人淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque）购自天津TDB生物技术发展中心; 胎牛血清购自HyClone公司; FACSCalibur流式细胞仪购于BD公司。

1.2 方法

1.2.1 人PBMCs的分离及单核细胞、 NK细胞的分选 健康志愿者外周血用生理盐水作等倍稀释后， 按标准密度梯度离心法分离PBMCs。单核细胞及NK细胞采取阴性分选和阳性分选相结合的序贯分离法， 按说明书操作进行。先从PBMCs中分选CD14+细胞， 再从其CD14-组分中去除CD3+细胞， 最后从CD3-CD14-组分中分选CD56+细胞， 即为CD3-CD56+ NK细胞。取少量细胞分别行CD14、 CD3/CD56流式细胞术（FCM）检测， 确定CD14+及CD3+CD56-细胞的纯度（>90%）。

1.2.2 细胞株培养 人红白血病细胞K562由本研究所保存， 培养于含100 mL/L FCS的RPMI1640完全培养液中。

1.2.3 单核细胞/NK细胞共培养 纯化的单核细胞按2.5×108个/L接种于24孔培养板中， 根据实验需要加或不加50 mg/L TNF-α或1000 mg/L IFN-γ， 培养24 h后， 用无血清RPMI1640液洗细胞2次， 再以含100 mL/L FCS的RPMI1640完全培养液悬浮并按2×108个/0.5 L/孔接种细胞于48孔板内; 纯化的异体NK细胞用RPMI1640完全培养液悬浮并调整细胞密度为4×108个/L， 按每孔0.5 mL接种于单核细胞培养板内， 使总体积为1 mL。如果要阻断NK细胞与单核细胞的直接接触， 可先在单核细胞培养板内放入细胞小室， 再将NK细胞加于小室中; 如要作抗体阻断试验， 可在共培养体系中加入抗MICs mAb 159207或抗NKG2D阻断抗体。继续培养24 h。

1.2.4 NK细胞表面CD69及胞内IFN-γ表达分析 收集共培养细胞， 用流式洗液洗细胞2次后， 将各组细胞等分成相应管数， 每管细胞悬液体积约50 μL。采用PE-CD56/FITC-CD69或PE-CD56/FITC-IFN-γ双色流式检测。简述如下: 如检测NK细胞CD69表达， 在细胞悬液中加入PE-CD56/FITC-CD69单克隆抗体或其同型对照抗体， 4℃避光孵育20 min， 流式洗液洗细胞1次， 再以10 g/L多聚甲醛悬浮细胞即可上机检测; 如作NK细胞胞内IFN-γ染色， 先在细胞悬液中加入PE-CD56 mAb或其同型对照抗体， 4℃避光孵育20

min， 流式洗液洗细胞1次， 再以细胞固定液固定细胞10 min， 用细胞通透液洗细胞2次后， 用50 μL流式洗液悬浮细胞， 加入FITC-IFN-γ mAb或其同型对照抗体， 4℃避光孵育20 min， 细胞通透液洗细胞1次后， 再以10 g/L多聚甲醛悬浮细胞上机检测。

1.2.5 NK细胞51Cr释放试验 K562的标记: 以100 μCi Na2（51CrO4）（中国同位素公司）标记1 mL细胞数为5×106个的靶细胞， 37℃孵育90 min， 再以RPMI1640液洗细胞3次。按不同效靶比（E∶T）值， 将标记好的K562细胞加入至NK/单核细胞共培养体系中， 并使终体积数为200 μL， 天然释放孔不含效应细胞， 最大释放孔加入100 μL 20 g/L Triton X-100， 每孔设复孔数为3。50 mL/L CO2、 37℃条件下孵育4 h。离心后吸取每孔上清， 用FT-603型γ闪烁计数仪测定每份上清的cpm值。特异性溶细胞活性由特异性释放百分数表示， 按下述公式计算: 特异性释放率=［（实验孔cpm－自然释放对照孔cpm）/（最大释放对照孔cpm－自然释放对照孔cpm）］×100%。

2 结果

2.1 细胞因子IFN-γ对人单核细胞MICs表达的上调作用 活化淋巴细胞分泌的细胞因子TNF-α与IFN-γ一样也参与了淋巴细胞与其他细胞如DC的相互作用［7］。TNF-α与IFN-γ对单核细胞MICs表达的影响尚不清楚。在此一并研究了TNF-α及IFN-γ对纯化的人单核细胞表面MICs表达的作用。新鲜分离的人单核细胞表面低水平或阴性表达MICs分子， 经IFN-γ刺激24 h后， 单核细胞表面MICs分子明显上调。细胞因子TNF-α不能轻微上调单核细胞表面MICs表达（图1）。

2.2 IFN-γ刺激的单核细胞对NK细胞的活化作用 进一步研究IFN-γ及TNF-α刺激后的单核细胞活化NK细胞的能力。结果显示， 无论是新鲜分离还是在体外培养24 h后的单核细胞， 都不能促进NK细胞表面CD69及胞内IFN-γ表达， 也不能促进NK细胞杀伤NK敏感的K562细胞; TNF-α作用后的单核细胞能微弱的促进NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达，对NK细胞的细胞毒作用亦有一定增强作用; 当单核细胞与IFN-γ共培养24 h后， 单核细胞对NK细胞有很强的活化作用， 表现为NK细胞表面CD69及胞内IFN-γ表达、 NK细胞对K562的杀伤活性均明显增强（图2）。

图1 细胞因子TNF-α与IFN-γ对人单核细胞MICs分子表达的影响（略）

图2 IFN-γ刺激后的单核细胞促进NK细胞活化（略）

A: IFN-γ刺激后的单核细胞与异体NK细胞共培养后， NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达明显增强， 而TNF-α刺激后的单核细胞无此效应; B: IFN-γ而非TNF-α刺激后的单核细胞与NK细胞共培养后， NK细胞对K562的杀伤活性明显增强.

2.3 MICs及细胞直接接触在单核细胞活化NK细胞中的作用 IFN-γ能诱导单核细胞MIC上调表达， IFN-γ作用后的单核细胞能活化NK细胞， 单核细胞表面MIC分子在NK细胞活化中的作用如何？ 对此进行了研究。首先进行MIC抗体阻断试验: 1000 mg/L IFN-γ刺激单核细胞24 h后， 在NK细胞/单核细胞共培养体系内加入饱和剂量(5 mg/L)的抗MICs mAb 159207， 或者加入相等剂量的的同型抗体， 结果显示， 加入同型对照抗体后， NK细胞表面CD69及胞内IFN-γ表达明显升高（图3A）， NK细胞对K562的杀伤活性也明显增强（图3C）; 但加入饱和剂量的抗体159207后， NK细胞表面CD69及胞内IFN-γ表达、 以及NK细胞对K562的杀伤活性大幅下降（图3A、 C）， 较静息的NK细胞仅有微弱提高。这说明IFN-γ诱导的表面MICs分子在单核细胞活化NK细胞中发挥着重要作用。用transwell小室进一步证实了细胞间直接接触在单核细胞活化NK细胞中的作用。从（图3）中可以看出， 用小室隔离单核细胞及NK细胞后， NK细胞活化标志CD69及胞内IFN-γ表达较NK/单核细胞混合条件下明显减低（图3B）， NK细胞的细胞毒活性也明显减弱（图3C）。这些结果提示NK细胞与单核细胞的直接接触及单核细胞表面的MICs分子， 可能是IFN-γ介导NK/单核细胞相互作用的关键环节。

图3 单核细胞活化NK细胞依赖MICs分子及细胞间的直接接触（略）

A: IFN-γ预先刺激的单核细胞与NK细胞共培养， 当加入抗MICs抗体159207阻断后， NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达受抑制; B: IFN-γ预先刺激的单核细胞与NK细胞共培养， 当以细胞小室阻断细胞直接接触后， NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达受抑制; C: IFN-γ预先刺激的单核细胞与NK细胞共培养， 当加入抗MICs抗体159207阻断（左）， 或以细胞小室阻断细胞直接接触后（右）， NK细胞对K562细胞的杀伤活性变化.

3 讨论

完整的免疫应答包括天然免疫应答和适应性免疫应答2方面， 淋巴细胞和非淋巴细胞是免疫应答的主要物质基础， 免疫应答的效应主要由淋巴细胞来发挥和体现， 非淋巴细胞则起着不可缺少的辅助和调节的作用。事实上， 免疫细胞之间的联系和相互作用十分紧密而复杂， 在淋巴细胞之间、 淋巴细胞与非淋巴细胞之间均存在着不同的“对话”机制。免疫细胞之间的“对话”方式主要有二种， 一是通过释放化学介质（主要是细胞因子）传递信息; 二是通过细胞之间的直接接触进行交流。对免疫细胞相互作用的研究， 此前主要集中在NK细胞与DC、 T细胞与DC、 NK细胞与T细胞几个方面， 对于单核细胞对免疫应答的调节则关注不够。

体内IFN-γ来源于淋巴细胞， 在免疫应答的早期和晚期主要分别由NK细胞和活化的T细胞产生。除了发挥直接的抗病毒功能， IFN-γ对免疫应答也起着关键的调节作用。很早就发现， IFN-γ对单核-巨噬细胞的生化、 形态及功能有修饰和调节的作用， 它能直接活化巨噬细胞， 能促进髓样DCs分泌IL-12和向TH1极化。对于单核细胞， IFN-γ一方面可以影响其向DC或巨噬细胞分化; 另一方面， IFN-γ还能诱导单核细胞产生系列细胞因子如IL-15、 IL-12、 TNF-α、 IL-6、 M-CSF等［1， 2］。既往研究发现， IFN-γ介导了单核细胞与淋巴细胞之间的交互活化， 这种交互作用依赖细胞间的直接接触， 但其具体分子机制不清［3］。我们的研究显示， 来源于淋巴细胞的IFN-γ能上调单核细胞表面MICs表达， MIC则介导了NK细胞的活化。

MICs基因位于人类第6号染色体MHC-I类基因区域， 与经典的MHC-I类分子却只有30%相同序列。MICs无抗原提呈功能， 作为一种应激分子， 它广泛表达于处于应激或恶变的细胞表面， 某些正常细胞表面或胞质内也存在MICs表达。此前发现， 单核细胞胞质而非胞膜存在MIC蛋白表达［5］。细胞因子TNF-α、 IFN-α对单核细胞MICs表达无类似的影响， 这提示单核细胞可能是IFN-γ发挥免疫调节作用的一个很重要的靶细胞， 而IFN-γ则可能是是淋巴细胞与单核细胞之间的主要信号分子。事实上， 众多证据表明， IFN-γ在淋巴细胞与单核细胞的“对话”中发挥着关键的作用。

单核细胞、 DC和巨噬细胞是免疫系统中专职的APC， 虽然巨噬细胞及大部分DC来源于单核细胞， 但它们之间的生物学性状差异十分明显，

在NKG2D配体的表达和调节上也是如此: 单核细胞组成性表达MIC转录模板和蛋白， GM-CSF、 IL-4诱导的单核细胞源性DC(moDCs)却无MICs的转录和蛋白合成; IFN-γ可以上调单核细胞表面某种MIC分子表达［7］。I类IFN（IFN-α）或者是结核杆菌的感染可以诱导moDC表面MIC分子表达， 从而介导NK细胞［6］的活化; 对于巨噬细胞， 目前发现LPS而非IFN-γ能够诱导小鼠巨噬细胞表达RAE-1［8］。这种差异表明， 单核细胞的分化， 也影响着MIC分子的表达和调节， 但其中的具体机制不清楚。单核细胞及moDC在IL-15的表达调节上也有明显不同， 单核细胞IL-15与MIC分子一样受IFN-γ而非IFN-α调节， 而IFN-α则能促进moDC表达MIC和IL-15［9］。基于以上研究结果， 我们认为在抗原提呈细胞（APCs）与淋巴细胞之间可能存在着一种以IFN为信使、 以NKG2D为桥梁的交流对话机制。

参考文献

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［3］ Gonzalez-Alvaro I， Dominguez-Jimenez C， Ortiz AM， et al. Interleukin-15 and interferon-gamma participate in the cross-talk between natural killer and monocytic cells required for tumour necrosis factor production［J］. Arthritis Res Ther， 2006， 8(4): R88.

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［5］ Stephens HA. MIC and MICB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved?［J］. Trends Immunol， 2001， 22(4): 378-385.

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［7］ 王惠明， 阮志华， 王沂芹， 等. IF-r诱导人单核细胞MICs分子表达［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(12): 1192-1194.

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单核细胞篇5

【摘要】 目的：探讨小儿传染性单核细胞增多症的护理。方法：对我儿科2012年3月至2013年3月收治的30例KD患儿进行分析，针对患儿在患病过程中出现的各种症状、体征，提出护理问题，实施有效的护理措施，并对患儿及家属进行健康心理指导。结果：正确及时用药和合理护理是缩短病程有效方法，30例KD患儿全部痊愈。

【关键词】 小儿；单核细胞增多症； 传染性

传染性单核细胞增多症是一种单核-巨噬细胞系统急性增生性传染病。小儿时期常见。主要由EB病毒引起。特征为不规则发热、咽峡炎、淋巴结及肝脾肿大，血液中出现大量异常淋巴细胞，血清中可出现嗜异性凝集素及EB病毒特异性抗体。

1 临床资料

1.1 一般资料 选自我儿科2012年3月至2013年3月收治的30例传染性单核细胞患儿，患儿入院时临床特点为：发热，大多数为38°-40℃个别可达40℃以上，持续1-2周或3-4周，咽峡炎，淋巴结肿大，肝脾肿大及黄疸，其他：可出现皮疹，头痛、呕吐，脑膜脑炎、瘫痪、昏迷等神经系统及心肺肾等器官受损。血象中白细胞常为轻度升高，分类以淋巴细胞升高，可见异型淋巴细胞，常超过10%。嗜异凝集试验：阳性。抗EB病毒抗体试验：阳性。入院后经积极正确治疗和有效护理，全部治愈出院，住院时间为15 d～36 d。

1.2 方法 运用护理程序从生理、心理、社会、精神等方面对患儿的健康状况进行评估，通过观察，询问病史，体格检查，与患儿及家长交谈等获取资料，制定护理计划，并组织实施与评价，同时针对此病缺乏认识的情况，加强对患者及家属的健康教育。

1.3 结果 30例患者经合理护理以及轻症病人对静脉补液，对症治疗，口服抗生素为主。较重病人，有明显合并感染时以静脉补液，静脉使用抗生素，对症治疗。若能给以丙种球蛋白或恢复期病人的血清治疗，效果为更佳。对于重症或有明显中枢神经系统症状的病人，应加用肾上腺皮质激素、干扰素、丙球及/或恢复期血清。全部痊愈出院。

2 护理

2.1 安置隔离病房 按传染病一般常规护理 实行呼吸道隔离，防止交叉感染和疾病的传播。

2.2 发热护理 发热是小儿传染性单核细胞增多症的主要症状之一。70%患儿均有不同程度的发热，部分患儿伴有畏寒、寒战，T38.0℃～40.0℃不等，热程数日至数周，某些患儿高热易至惊厥、抽搐，因此因严密观察体温变化，及时做好降温处理，必要时可用镇静剂，高热病人应每4h测量体温一次，同时密切观察患儿的面色、脉搏、呼吸及血压等。出汗较多者应及时揩干汗液和更换衣裤，及时补充水、电解质，多饮开水，并做好口腔护理，同时保持病房内空气新鲜、流通、温湿度适宜。2.3 做好病情观察 防止并发症 小儿传染性单核细胞增多症在不同病期，可出现不同脏器受累的临床表现，如在急性期可发生心包炎、心肌炎及中枢神经系统症状等。因此因密切观察患儿的面色、神志、血压、脉搏、呼吸等情况，急性期应嘱患儿卧床休息，避免剧烈运动，保持大便通畅，注意输液速度，给予高热量、优质蛋白清淡、易消化饮食，避免服用辛辣等刺激性饮食。

2.4 口腔和皮肤护理 所有患儿均有不同程度的口腔咽部黏膜充血，严重者口腔黏膜糜烂，小溃疡、唇皲裂，每日口腔护理，动作轻柔；漱口液选用1%～2%碳酸氢钠溶液、生理盐水、3%硼酸溶液；鼓励多饮水，保持口腔清洁湿润，增加食欲，唇干裂者可涂消毒石蜡油。还应保持皮肤清洁，避免抓伤皮肤后感染。

2.5 心理护理 家长对本病缺乏了解，当得知可引起脑膜脑炎、瘫痪、昏迷等神经系统及心肺肾等器官受损，而且费用高，不同程度的紧张及焦虑，此时应耐心倾听家长的诉说，主动解答家长的问题，并且积极告知本病的治疗方案、用药的重要性、护理措施、疗程及预后，增加战胜疾病的信心.

2.6 出院指导 做好健康宣教：强调定期复查的重要性，加强营养，适当参加体育运动，增强体质，防止疲劳，防止感冒，半个月～1个月后门诊复查血常规及肝、肾功能，观察有无复发的临床表现。

3 评价护理

通过沟通，家长对疾病有了基本的认识，患儿适应了医院的环境，主动配合治疗，有效的护理措施和家长密切配合30例患儿住院期间，护理人员密切监测有无严重的并发症发生。30例患儿发现的肝脾肿大，经安抚卧床休息，给予对症治疗后，B超复查均好转。总之，只要及时、准确用药和密切观察病情、细心护理，与家长相互配合，才能缩短病程提高治愈率。

参考文献

[1] 胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学，第7版.北京：人民卫生出版社，2001，821.

[2] 杨桂瑛 《中华实用中西医杂志》 2004年 第15期

单核细胞篇6

目的 分别观察骨髓单个核细胞复合异种骨、骨髓基质干细胞复合异种骨以及单独植入异种骨对兔坏死股骨头的修复效果，并对其进行比较，以判定骨髓骨髓单个核细胞是否对股骨头坏死有修复作用。方法 23 只新西兰白兔，用液氮冷冻的方法，建立双侧股骨头坏死模型，取其中45 个坏死股骨头，随机分组，分别为对照组，实验1 组，实验2 组。每组15 只股骨头。对照组为髓芯减压后单独的异种骨植入，实验1 组为髓芯减压后植入复合骨髓基质干细胞的异种骨，实验2 组为髓芯减压后植入复合骨髓单个核细胞的异种骨。术后2、4、8 周，分别行X线检查、Masson染色检查、及新生血管面积百分比和新生骨小梁体积百分比统计分析。结果 纳入新西兰白兔23 只，均进入结果分析。X线及Masson染色检查示实验1、2 组修复效果相同，均优于对照组。术后新生血管面积百分比和股骨头新生骨体积百分比比较，同时期实验组效果好于对照组，且统计学差异明显。而实验1、2 组间除2、4 周血管面积百分比外，其余都无显著性差异。结论 骨髓单个核细胞确有修复坏死股骨头的效果，且与骨髓基质干细胞修复效果相似。

【关键词】 骨髓单个核细胞 骨髓基质干细胞 异种骨 股骨头坏死

Abstract: Objective To observe and compare the respective effects of bone marrow mononuclear cells composite bone xenograft， bone marrow stromal cells composite bone xenograft and bone xenograft on restoration of caput femoris necrosis. Methods The caput femoris necrosis models were established in 23 rabbits with bilateral caput femoris necrosis， and 45 necrotic caput femoris were randomly pided into 3 groups with 15 necrotic caput femoris in each group. One group served as control group with implantation of bone xenograft， another group as experimental group 1 with implantation of marrow stromal cells composite bone xenograft， and the last group as experimental group 2 with implantation of bone marrow mononuclear cells composite bone xenograft. After 2， 4 and 8 weeks， X-ray examination and Masson trichrome staining examination were respectively taken， and Alkaline phosphatase activities was respectively analyzed， and the statistical analysis of percentage of new vein area and percentage of new bone trabecula were also respectively carried out. Results All the 23 rabbits were involved in the result analysis. The results of X-ray examination and Masson staining examination showed that the effects of the two experimental groups were better than those of the control group. Alkaline phosphatase activities analysis， statistics of percentage of new vein area and percentage of new bone trabecula all indicated that in the same period of time， the effects of the two experimental groups were better than those of the control group， and the statistical differences were significant. But there were no significant differences between the two experimental groups in all aspects， except the percentage of new vein area after 2 and 4 weeks. Conclusions Bone marrow mononuclear cells composite bone xenograft can restore caput femoris necrosis， and nearly have the same effects as bone marrow stromal cells.

Key words：bone marrow mononuclear cells; bone marrow stromal cells; bone xenograft; caput femoris necrosis

股骨头坏死的治疗仍是国内外的一大难题，对其的研究也是骨科研究中一个活跃的热点。近年来骨组织工程研究快速发展，其在股骨头坏死的治疗方面也有了充分的利用。全骨髓复合载体或者骨髓基质干细胞复合载体［1］等都被应用于股骨头坏死的治疗。但是全骨髓复合载体治疗股骨头坏死疗效不确切。骨髓基质干细胞复合载体，虽然疗效确切，方法却比较烦琐，容易发生污染。我们本次研究的骨髓单个核细胞，是将全骨髓离心，去除其中的血浆和红细胞后，获得的一种混合物质，其中的骨髓基质干细胞比例较全骨髓有很大提高。同时还包括了一些促进修复的因素。通过本次实验中，我们分析骨髓单个核细胞对股骨头坏死的修复作用，同时探讨单个核细胞复合异种骨治疗股骨头坏死的能力。为临床治疗股骨头坏死探索一种新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料 实验于2004年9月至2005年1月，在辽宁医学院附属第一医院外科实验室完成。实验动物为新西兰白兔23 只，雌雄不限，由锦州医学院动物实验中心提供，体重2.5～3.0 kg，建立双侧股骨头坏死模型，取其中45 只股骨头用于实验，随机分为3组，分别是对照组，实验1、2 组，每组15 只股骨头，对照组为髓芯减压后单独的异种骨植入，实验1 组为髓芯减压后植入复合骨髓基质干细胞的异种骨，实验2组为髓芯减压后植入复合骨髓单个核细胞的异种骨。

1.2 方法 依照赵宝全的方法［2］。

骨髓基质干细胞的培养及复合载体：参考赵子义等［3］的方法，采用全骨髓培养法分离和培养骨髓基质干细胞。制成细胞悬液，按1∶3 传代。之后仍每3 天换液1 次，待细胞再次长满瓶底，收集骨髓基质干细胞悬液，并离心后，将其配成6×106 个/mL的细胞悬液，无菌条件下，将其逐滴滴至松质骨上，使之充分渗入孔隙，等待植入。

单个核细胞的提取及复合载体：速眠新肌注麻醉实验用兔后，消毒，在股骨大转子、胫骨结节等处用穿刺针及肝素化的注射器抽取骨髓，共8 mL。混合等体积的DMEM培养基后，吹打成细胞悬液，用密度为1.073 g／L Percoll分离液提取单个核细胞，要求将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含有提取液的离心管，使悬液置于提取液上层，于离心机1 500 r／min离心20 min，取云雾状中层即骨髓单个核细胞，约1 mL，无菌条件下，将离心所得单个核细胞逐滴滴至松质骨上，使之充分渗入孔隙。等待植入。

股骨头坏死模型的制备及修复实验：新西兰白兔术区备皮，手术台俯卧位固定，速眠新肌注麻醉下，取髋关节外侧斜形切口，长约4 cm，切开皮肤、皮下、深筋膜，分开臀中肌，显露髋关节囊，T型切开关节囊，可见股骨头外上部分。不切断圆韧带，内收下肢，增加股骨头暴露部分。后在保护股骨头周围组织的情况下，用棉棒反复沾取液氮，持续紧贴股骨头3 min。再用温生理盐水复温1 分钟。随后从股骨头基底向液氮冷冻部钻孔，直达软骨下2 mm，形成一直径3.5 mm的腔隙。对照组将单独的异种骨植入，实验1 组植入复合骨髓基质干细胞的异种骨，实验2组植入复合骨髓单个核细胞的异种骨。完成处理后，逐层关闭切口。术毕分笼饲养，肌注青霉素40 万U／d，持续5 天。所有实验用兔，统筹安排，选取适当手术和处死时间，处死后，先行影像学检查，再取股骨头做其他检查。

1.3 主要观察指标

X射线检查：术后2，4，8 周，处死实验用兔取俯卧位摄髋关节正位片。观察股骨头密度变化，判断修复效果。

Masson染色：术后2，4，8 周取股骨头，冠状切开，10％福尔马林固定1 周、5 ％硝酸脱钙3 天，石蜡切片，7 μm厚度，后按说明逐步完成Masson染色。最后光镜下观察坏死股骨头修复情况。

新生血管面积百分比：取实验组织块，连续切片，从第10 张开始选片，每隔50 张选1 张，每个组织选5 张。在每张切片的原冷冻坏死修复区域，随机选取5 个100倍视野，用计算机图像分析系统进行分析，计算各个平面，新生血管占修复区面积的百分比。

新生骨体积百分比：取上述切片，在每张切片的原冷冻坏死修复区域，随机选取5 个100 倍视野，根据Weibel点计数法及立体学公式，VV=∑po/∑pα，以骨组织为参照空间，对各实验组和对照组坏死修复区进行定量，每个视野通过对点的计数来统计修复比例。计算公式中∑po为落在修复区的点数，∑pα为镜下的总点数。

1.4 统计学分析

应用SPSS11.0软件进行统计学分析，数据全部以均数±标准差（±s）表示。各个时间段，3 组间的数据分别进行两两比较，又称多重比较，故使用多样本的单因素方差分析，P＜0.05认为有统计学差异。

2 实验结果

2.1 X线检查

术后2 周，关节间隙正常，股骨头外形正常，对照组股骨头内局部可见囊性改变，边缘少量密度增高影。实验组可见斑片样或云絮样密度增高影，且实验1 组密度增高影又多于实验2 组。术后4 周，对照组股骨头局部刚可见云絮样密度增高影，而实验组密度整体呈均匀增高，两实验组间无明显差异。术后8 周实验组股骨头密度增高显著，且两实验组X片无明显差别(图1)，对照组密度增高不如实验组增高明显，且不完全均匀（图2）。

2.2 Masson染色

新生骨小梁呈蓝色，红细胞及成熟骨小梁呈红色，细胞核呈蓝褐色。

术后2 周，对照组可见少量新生血管和细小新生骨小梁。骨小梁蓝染为主，且不均匀，骨陷窝周围蓝染较深，骨小梁局部点缀红染。骨小梁间为纤维结缔组织充填，可见少量新生血管。实验1 组骨小梁染色蓝色为主，但处处可见红染，骨小梁间可见大量活跃的成骨细胞。实验2 组骨小梁染色蓝色为主， 但红染较对照组多，骨小梁间为纤维结缔组织充填，数条血管也见于骨小梁间。

术后4 周，对照组骨小梁较细小且数量少，骨小梁蓝染仍不均匀，局部可见少量红染部分，骨小梁边缘可见少量成骨细胞。实验1 组，骨小梁局部蓝染均匀，出现片状红染，骨小梁边缘骨髓基质干细胞活跃，骨小梁间纤维组织为主，血管丰富，有少量新生骨髓组织。实验2 组骨小梁可见条状蓝染，片状红染，骨小梁间血运丰富，可见新生骨髓组织。

术后 8 周，对照组（图3）骨小梁红染增多，但仍以蓝染为主。骨小梁边缘可见部分静止成骨细胞，小梁间可见丰富骨髓组织。实验1、2 组（图4、5）可见成熟骨小梁，整个骨小梁多数红染，骨小梁排列有序。小梁间可见丰富骨髓组织。两实验组间未见明显差别。

2.3 新生血管面积百分比统计分析

术后2、4、8 周计算机图像采集，并计算不同时期各个冠状切面新生血管占坏死区面积百分比。后行统计学分析。不同时间，各组间两两进行比较，使用单因素方差分析比较差异大小。术后2、4、8 周，实验1、2 组的新生血管面积均明显高于对照组，且均有显著差异（P

表1 不同时期新生血管占修复区平面的面积百分比（略）

注：同时间，组间比较用单因素方差分析，*表示与对照组比较P

2.4 新生骨体积百分比统计分析

术后2、4、8 周显微镜下，计算机图像采集并计算不同时期各例股骨头内，新生骨占坏死修复区的体积百分比。后行统计学分析。不同时间段，各组间两两进行比较，使用单因素方差分析比较差异大小。术后2、4、8 周，实验1、2 组的新生骨体积比均明显高于对照组，且均有显著差异（P0.05）。结果如下（见表2）。

表2 不同时期新生骨占坏死修复区的体积百分比（略）

注：同时间，组间比较用单因素方差分析，*表示与对照组比较P

3 讨论

本实验中所用骨髓单个核细胞是一种混合物质。是将所抽取的完整骨髓，通过1 500 r／min的转速离心20 min后，取云雾状中层所得。与完整的骨髓相比较，我们去除骨髓中的血浆成份和红细胞，得到的是包括造血干细胞、骨髓基质干细胞、多能前体细胞、以及各类有核的血细胞等在内的混合物质。在本次实验研究中，我们观察到骨髓单个核细胞确有修复股骨头坏死的作用，通过查阅文献及相关分析，我们主要考虑两方面的生物学效应起作用。

骨髓单个核细胞的成骨作用，骨髓单个核细胞中含有一定数量的骨髓基质干细胞，虽然尚不能达到组织工程所需最低细胞数量，但Dumas等［4］通过实验发现不同的离心方法以及复合载体等措施可以明显提高骨髓基质干细胞克隆形成能力，使骨髓基质干细胞成骨能力最大化。国内李亚非等［5］的研究成果也表明骨髓内基质干细胞在周围存在骨坏死、骨修复的条件，以及适宜的体内理化、营养环境诱导作用下可以分化、增殖，明显提高单位体积内基质干细胞、成骨细胞的数量和活性，增强成骨活性，促进新骨的生长，从而获得肯定的成骨效果。所以将骨髓单个核细胞应用到股骨头坏死的治疗，可以增加股骨头坏死修复过程中成骨的因素，促进股骨头坏死的修复。

骨髓单个核细胞的促进血管生成作用，骨髓单个核细胞中的造血干细胞和骨髓基质干细胞都是其能促进血管生成的关键。实验研究［6，7］证实，造血干细胞、骨髓基质干细胞在体内缺血的环境刺激下，都可以向血管内皮细胞方向分化，促进血管生成。该生物学效应，已经通过实验研究得到证实。并且在临床方面，也应用到了心肌梗死和糖尿病性下肢缺血［8］等疾病的治疗，且收到了良好效果。而在本次实验中，我们对坏死修复区，新生血管面积百分比的统计，也证明骨髓单个核细胞组成血管作用较其他两组强。同时股骨头坏死往往与股骨头内进行性血运障碍有关，所以考虑，骨髓单个核细胞能够促进血管生成，也是其修复股骨头坏死的作用机理之一。

股骨头坏死修复过程中，骨细胞坏死本身并不引起任何症状和可见的X线表现异常.只有当坏死后引起修复反应达到一定程度时，才可以引起X线片上骨密度的改变［9］。对于何时出现X线表现的变化，目前研究尚不统一，可能与是否脱位股骨头、是否切断圆韧带、是否切断股骨颈有关。本实验未脱位股骨头，未截断圆韧带和股骨颈，故修复开始较早。2周即可见修复局部云絮样密度增高影，同时实验各组修复因素多于对照组，故各时间段X片可见实验组修复效果好于对照组。而实验组间比较，并无明显差异，可见仅从X线看，骨髓单个核细胞和骨髓基质干细胞无明显差异。

依照上述分析，自术后2 周开始，各实验组和对照组坏死股骨头已经开始修复，且有新生骨小梁形成，但各实验组在骨髓基质干细胞作用，以及骨髓基质干细胞和成血管因素共同作用下，成骨效果以及修复坏死股骨头效果明显好于对照组，在4周、8周时，效果差异也同样显著，该分析符合本次实验2、4、8 周新生骨小梁统计分析结果。同时两个实验组间，各种成骨修复因素相互作用，可导致成骨差异不大，故统计学分析未见明显差异。

综上所述，骨髓单个核细胞作为骨髓离心提取物，去除了骨髓中对组织修复意义不大的成份，保留了关键成份。其复合异种骨是一种新的修复股骨头坏死的有效方法。

参考文献

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［3］ 赵子义，郭希民，王常勇，等.成人骨髓基质干细胞的分离与纯化［J］.中华创伤骨科杂志，2004，6(7):740-743.

［4］ Dumas A， Moreau MF， Ghérardi RK， et al. Bone grafts cultured with bone marrow stromal cells for the repair of critical bone defects: An experimental study in mice ［J］. Biomed Mater Res A， 2008，8(5):617-619.

［5］ 李亚非， 常红星， 姚建华，等.组织工程化异体骨复合BMP和自体骨髓治疗股骨头缺血性坏死［J］.中华骨科杂志，2005，25(6):337-341.

［6］ Grant MB，May WS，Caballero S，et al. Adult hematopoietic stem cells provide functional hemangioblast activity during retinal neovascularization［J］. Nat Med，2002， 8(6):607-612.

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［8］ 谷涌泉， 张建， 郭连瑞，等.自体骨髓单个核细胞移植治疗糖尿病性下肢缺血的临床观察［J］. 中国医师进修杂志：综合版，2006， 29(8):22-25.

单核细胞篇7

【关键词】 单核细胞化学吸引蛋白质1；脐静脉；内皮细胞；动脉硬化；细胞凋亡

动脉粥样硬化 (As)与血管内皮细胞（VEC）之间的关系密切，目前被普遍接受的“损伤反应” 学说［1］认为，内皮细胞功能性的损伤是As形成早期的始动环节. 有学者认为内皮细胞的凋亡在As的早期扮演了重要角色［2］. 单核细胞趋化蛋白1（MCP1）是一种趋化激活剂，可以特异地作用于血液中的单核细胞，招引其迁移至内皮下形成泡沫细胞. Selzman等［3］及官秀梅等［4］的研究发现，MCP1不仅有趋化作用，而且可以作为一种生长因子促进血管平滑肌细胞的增殖，从而直接或间接地参与了As的形成，但MCP1对与As发生关系极为密切的内皮细胞的生长有何影响尚少见相关报道，我们对此进行了研究.

1材料和方法

1.1材料

人MCP1（Peprotech公司）；M199培养基，胎牛血清（Gibco公司）；胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶，EDTA（Sigma公司）；Annexin VEGFP 细胞凋亡检测试剂盒，DNA ladder 检测试剂盒（Oncogene公司）；鼠抗人Ⅷ因子抗体、鼠抗人内皮细胞生长因子受体2(KDR)抗体（美国Dako公司）；超净台（苏州苏净集团安泰空气公司）；倒置相差显微镜（日本Nikon公司）；CO2孵箱（美国Thermo Formo公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；凝胶成像系统（英国Syngene公司）.

1.2方法

1.2.1人脐静脉内皮细胞（hUVEC）培养

采用李琴山等［5］改良的酶消化法进行细胞培养，用内皮细胞特异性Ⅷ因子抗体（抗von Willebrand因子抗体）以及KDR mAb免疫细胞化学法鉴定内皮细胞. 本实验所用细胞均为第3代.

1.2.2实验分组

将细胞分为5组. 阴性对照组：含10 mL/L胎牛血清的M199培养基，2 mmol/L L谷氨酰胺；实验组（M1~M4组）：MCP1含量分别为0.1，1.0，10，100 μg /L.

1.2.3Annexin V/PI双染流式细胞仪检测

早期凋亡率将hUVEC以1×106个/瓶接种于50 mL无菌的培养瓶中，孵育24 h后用含10 mL/L胎牛血清的M199同步化12 h后换为不同终浓度的MCP1应用液，24，48 h后用流式细胞仪检测早期凋亡率.

1.2.4琼脂糖凝胶电泳检测

DNA ladder将hUVEC以1×106个/瓶接种于50 mL无菌的培养瓶中，孵育24 h后用含10 mL/L胎牛血清的M199同步化12 h后换为不同终浓度的MCP1应用液，24，48 h后按试剂盒说明书提取DNA，15 g/L琼脂糖凝胶电泳. 电压5 V/cm ，电泳2.5 h. 在凝胶成像系统上观察结果并拍照.

统计学处理： 所有数据用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析及t检验，结果用x±s表示.

2结果

2.1细胞培养与鉴定

培养的细胞在显微镜下观察，细胞呈典型的“铺路石”样结构特征（图1）. Ⅷ因子mAb免疫细胞化学结果显示95%为阳性血管内皮细胞，细胞胞质为棕黄色. GAMFITC绿色荧光显示膜上KDR（AntiVEGF recepter2） 和GARTR红色荧光显示胞内的Ⅷ因子，免疫荧光双标显示95%以上为阳性血管内皮细胞. 证明所培养的细胞为血管内皮细胞，并且纯度符合实验要求.

2.2Annexin V/PI双染流式细胞仪分析

在0.1 μg/L MCP1作用VEC 24 h即可明显诱导hUVEC的早期凋亡，这种效应随MCP1用量增加和作用时间的延长而明显增强（P

2.3MCP1对hUVEC作用

后琼脂糖凝胶电泳在1.0 μg/L的MCP1作用24，48 h时均未见“DNA ladder”，而10 μg/L和100 μg/L的MCP1作用于hUVEC 24，48 h后均可见“DNA ladder”（图2）. 说明MCP1作用于hUVEC可引起凋亡，并且具有剂量依赖性.

3讨论

血管内皮细胞是参与As病理过程的重要细胞，实验证明发生As的局部血管内皮细胞更新加快，提示高频率的内皮细胞凋亡是As发生的第一步［6］，凋亡内皮细胞的增加易改变内皮的完整性和功能，从而诱发As［7-8］. 因此VEC凋亡在As中的作用越来越受到关注. MCP1为一种趋化激活剂，在As斑快中有很高的表达，已证实多种促进As的刺激因素均可引起MCP1的高表达［9］. 新的研究发现，MCP1不仅是趋化激活剂，参与了As及多种炎性疾病的发生，而且可以作为一种生长因子促进VSMC的增殖，从而直接或间接地参与了As的形成.

我们用不同浓度MCP1作用于原代培养的hUVEC（来源于人体、更接近于体内细胞的生理特性）24，48 h，观察其对VEC生长的影响. 细胞发生凋亡时，由于内源性钙－镁离子依赖性核酸內切酶被激活，选择性降解核小体间DNA，形成大小不一的DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现规则的、间隔180～200 bp的DNA梯带，即“DNA ladder”， 而坏死细胞DNA断裂无规律性. “DNA ladder”已被认为是判定细胞凋亡的金标准之一［10］. 此外，细胞发生凋亡时胞膜成分亦发生改变. 在凋亡早期，原来位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)迁移至脂双层外侧，PS外翻是凋亡细胞的早期事件. Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合. 与PI双染细胞通过流式细胞仪可区分活细胞、凋亡细胞及坏死细胞. 两项指标检测的结果均表明MCP1 能够诱导hUVEC的凋亡，但对细胞坏死没有影响. 并且MCP1的这种促hUVEC凋亡的效应随着其浓度和时间的增加而增强. 在As发病中多种因素可刺激MCP1表达增加，MCP1可通过诱导 hUVEC的凋亡加重As病变，这从一个新的角度探讨了MCP1致As的机制，对认识MCP1的多种生物学功能有重要意义.

参考文献

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［3］Selzman CH， Miller SA， Zimmerman MA， et al. Monocyte chemotactic protein1 directly induces human vascular smooth muscle proliferation ［J］. Physiol Heart Circ Physiol， 2002，283(4):H1455-1461.

［4］官秀梅，钱民章. 单核细胞趋化蛋白1对人脐静脉平滑肌细胞增殖的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2005，13（3）：309-312.

［5］李琴山，冯赞杰，刘 洋，等. 一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法 ［J］.第四军医大学学报，2007，28（3）：276-278.

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［7］Choy JC， Granville DJ， Hunt DW， et al. Endothelial cell apoptosis: Biochemical characteristics and potential implications for atherosclerosis ［J］. Mol Cell Cardiol， 2001， 33(9):1673-1690.

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单核细胞篇8

【关键词】 辛伐他汀;CD40;IFNγ;单个核细胞;急性冠状动脉综合征

Effects of Simvastatin on Expression of CD40 in Peripheral Blood Mononuclear Cells Induced with IFNγ　TIAN Caixia1,QIN Weichao1,WANG Jianing2,QIU Fangcheng1,LIU Tangxin3*(1Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital,2Institute of Clinical Medcine,Renmin Hospital,3Department of Orthopedics,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

Abstract:Objective To explore the change of CD40 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMNC) with induction of IFNγ,and the effects of simvastatin on expression of CD40 induced with IFNγ in PBMNCs with different genotypes.Methods Fortytwo healthy volunteers were enrolled,PBMNCs were separated from heparinized venous blood by density gradient centrifugation and then cultured with 100 μg/L IFNγ or 20 μmol/L simvastatin for 24 h.The CD40 expression level was determined by flow cytometry.Genotypes of the CD401C/T were assayed by polymerase chain reactionrestricted fragment length polymorphism(PCRRFLP).The expression levels of CD40 in PBMNC with different genotypes were analyzed.Results The levels of CD40 expression without intervention was increased after 24 h,however,there was no significant difference among CC,CT and TT genotypes (P>0.05).The levels of CD40 expression in PBMNC in all genotypes were increased significantly after induction with IFNγ and culture for 24 h,and the increase extent of CC genotype was significant higher than that of the other genotypes(P<0.05).Simvastatin could significantly inhibited the expression of CD40 in PBMNC induced with IFNγ,while the inhibitory effects of Simvastatin had no significant difference among different genotypes.Conclusion CD401C/T polymorphism could influence the CD40 expression of PBMNC,Simvastatin could markedly inhibit the expression of CD40 in PBMNCs induced with IFNγ,but there was no significant difference in the protective effects of Simvastatin among different genotypes of PBMNCs.

Key words:Simvastatin;CD40;IFNγ;Mononuclear cell;Acute coronary syndrome

最近的研究[1]发现，他汀类药物除具有调脂作用外，还具有抗炎症反应作用。CD40属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，具有所有炎性因子的共同特征。药物基因组学研究认为[2]，基因表型与药物疗效之间存在着明显关系。辛伐他汀是否影响CD40的表达及对不同基因表型个体的抗炎效应是否相同还不清楚。本文探讨经干扰素γ(IFNγ)干预后，辛伐他汀对CD40表达的调节作用，并进一步探讨其对携带CD40不同基因表型的单个核细胞表达CD40的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择郧阳医学院附属人民医院体检保健科的健康志愿者42例，均经体检及实验室检查排除任何感染症状和炎症状态，平均年龄(25.43±3.15)岁，其中男30例，女12例。

1.2 外周血单个核细胞的分离及培养

采集健康志愿者外周静脉血16 mL，EDTANa2抗凝，用PBS缓冲液1∶1稀释，轻轻颠倒试管混匀。用尖头吸管将稀释血轻轻平铺于离心管内的淋巴细胞分离液表面(比重1.007)，稀释血与淋巴细胞分离液体积比为2∶1，可见二者间形成清晰界面，室温下水平式离心机2 000 r/min离心20 min，离心后单个核淋巴细胞呈白膜状悬于分离液层与红细胞层之间，用尖头吸管小心吸取单个核淋巴细胞层至新的离心管，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液洗涤2次(室温下水平式离心机1 500 r/min离心10 min)，将清洗后的细胞重悬于RPMI 1640培养液中(含10%胎牛血清、1 nmol/L谷氨酰胺、105U/L青链霉素)，取0.1 mL，台盼兰染色，显微镜下计数活细胞比率，要求>95%。

将细胞接种于培养皿中，置于37 ℃ 5%CO2培养箱孵育2 h后，吸出培养液，用37 ℃预热的新鲜培养液清洗3次，洗脱未贴壁细胞，贴壁细胞即主要为单核细胞。瑞氏染色鉴定贴壁细胞中单核细胞比率占85%以上。将贴壁细胞用细胞刮片轻轻刮下，重悬于RPMI 1640培养液中，调整细胞浓度为1×106/mL，并接种于24孔培养板，2 mL/孔。

1.3研究对象CD401C/T单核苷酸多态性基因分型

改良的碘化钠法提取模板DNA，聚合酶链反应扩增包含1C/T位点的特异性片段，扩增产物用5U限制性内切酶NcoⅠ酶切，37 ℃反应6 h，反应终止后，消化片段用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶(EB)染色，紫外灯下观察。

1.4实验分组

给予100 μg/L IFNγ干预作为刺激状态组，以20 μmol/L辛伐他汀先与单个核细胞共孵育1 h，再给予100 μg/L IFNγ刺激为辛伐他汀干预组，24 h后用流式细胞仪检测培养的单个核细胞表面CD40的表达水平。

1.5统计学分析

计量资料用x±s表示，两样本之间计量资料比较用两独立样本t检验，多样本之间计量资料比较用单因素方差分析，所有数据均在SPSS11.5软件包上分析，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基本资料

42例研究对象按照CD401C/T位点基因型分为CC基因型(13例)，CT基因型(24例)和TT基因型(5例)。研究对象的临床和生化特征见表1，可见三种基因型研究对象间性别、年龄、BMI、收缩压、舒张压、血糖、TC、TG、LDLC、HDLC、apoAI、apoB等差异无统计学意义(P均>0.05)。表1 42例不同基因型研究对象间临床和生化特征的比较

2.2基础状态下CD40基因1C/T多态性对单个核细胞表达CD40的影响

基础状态下，三种基因型单个核细胞培养24 h后，细胞表面CD40表达量均显著升高。CC、CT、TT三种基因型单个核细胞在0 h CD40表达量无显著性差异，培养24 h后，三种基因型单个核细胞CD40表达水平也无显著性差异，见表2。表2 基础状态下不同基因型单个核细胞表达CD40水平的比较(x±s,MFI)

2.3 IFNγ刺激状态下CD40基因1C/T多态性对单个核细胞表达CD40的影响及辛伐他汀的干预作用

100 μg/L IFNγ刺激状态下，单个核细胞培养24 h后CD40表达量呈显著升高水平，不同基因型单个核细胞CD40表达上升的幅度有显著性差异，分别为CC型上升6.41倍，CT型上升3.68倍，TT型上升2.35倍，20 μmol/L辛伐他汀显著抑制经IFNγ诱导后CD40的表达，然而对不同基因型单个核细胞的抑制程度没有显著性差异，对CC、CT、TT型的抑制率分别为46.4%、39.6%、36.8%。表3 三种状态下不同基因型单个核细胞培养24 h后表达CD40水平的比较(x±s,MFI)

3 讨论

急性冠状动脉综合征(Acute Coronary Syndrome,ACS)是以动脉粥样硬化斑块破裂或糜烂，继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征，炎症反应的激活可能是发生ACS的因素之一。最新的研究证实[3]，炎性细胞因子CD40在ACS发生发展过程中起到了激活炎症细胞、启动炎症反应的作用，是介导这一炎症反应的重要介质。在正常情况下，血管内皮具有抵抗白细胞浸润的能力，并且只少量表达CD40，血管内皮受到损伤时，如干扰素γ(IFNγ)的刺激下，CD40大量表达，并与其配体CD40L结合，进而激活粥样斑块中的巨噬细胞、内皮细胞以及T淋巴细胞分泌黏附分子、细胞因子(IL6、TNFα、IFNγ等)、基质金属蛋白酶和组织因子等[4]。因此，CD40CD40L的激活能加速动脉粥样硬化的发生发展，并触发斑块不稳定，裂缝形成，甚至破裂，导致ACS的发生。

激活的单核/巨噬细胞是CD40的重要来源之一，机体单个核细胞不仅容易获取、分离、培养，而且被激活后可与内皮细胞粘附并向内皮下迁移，这也是动脉粥样硬化发生的首要步骤。IFNγ可诱导单个核细胞募集，促进泡沫细胞和指纹形成，促进血管壁细胞产生炎性因子，还可显著促进单核细胞分泌CD40[5]。

我们的体外实验证实，经IFNγ刺激后，单个核细胞大量表达CD40，这与国外报道相一致[6]。IFNγ是ACS炎症反应中关键的介质之一，也是调节CD40生成的主要因子，实验结果提示，IFNγ能直接激活人外周血单个核细胞，参与机体的炎症反应。

基因组的变异是普遍存在的，且绝大多数变异都不具功能性，没有生物学意义，不影响基因表达产物的功能或表达水平。我们在前面的研究[7]中发现中国湖北地区汉族人群CD40基因启动子上游1位点存在单核苷酸C和T的互换，但此多态性在中国人中是否具有功能性、是否影响CD40基因的转录或翻译效率，尚需探讨。本实验发现携带CD40不同基因表型的单个核细胞经IFNγ刺激后，CD40表达上升的幅度有显著性差异， CC基因型上升的幅度最大，CT基因型次之，TT基因型上升幅度最小，据此可推测CD401C/T基因多态性可能在某种程度上影响CD40的表达。目前尚不明确CD40基因1C/T多态性影响CD40基因转录效率或翻译效率的机制，推测可能CD40基因1C/T多态性通过一些未知的DNA结合序列影响CD40基因的转录或翻译，也有可能该多态性并不真正影响CD40基因的转录，只因与CD40基因中另一个有功能的多态性连锁而得出上述结论。IFNγ可促进单核/巨噬细胞合成TNFα、ILβ及表达NFκB，我们在研究中虽没有检测这些因子的表达水平，但不排除CD40基因1C/T多态性通过与这些炎性因子的相互作用影响单个核细胞表达CD40效率的可能。CD40基因的转录和翻译调控复杂，启动子区任何微小的变异都有可能影响该系统的调节，要完全了解CD40基因1C/T多态性的功能需进行单体分析及分析与各种转录因子的共同作用。

随着分子生物学的发展和人类基因组计划的完成，药物基因组学成为研究的热点，不同患者对同一种药物的作用效果和药物代谢可能存在差异，而这种差异可能是由不同患者所携带的基因型不同引起的。他汀类药物是临床上常用的治疗冠心病的药物，具有很好的调脂和抗炎疗效[8]。本研究用20 μmol/L辛伐他汀观察其对单个核细胞表达CD40的调节作用，并进一步探讨其对不同基因表型单个核细胞的影响，发现辛伐他汀可显著抑制IFNγ诱导的CD40的表达，但在不同基因型单个核细胞中，辛伐他汀的抑制效率没有显著性差异，对CC、CT、TT型的抑制率分别为46.4%、39.6%、36.8%。本研究在体外证实了辛伐他汀的抗炎作用，下一步我们将探讨在非炎症状态下，即单一辛伐他汀处理细胞，观察其对基础状态下单个核细胞的影响。

综上所述，经辛伐他汀处理后，炎症因子CD40大幅度下降可以初步反映临床上ACS患者在他汀类药物治疗后的良好效应，提示应激状态下单个核细胞对早期他汀药物干预反应良好，炎症活动减弱，有助于斑块钝化，然而在临床上对不同基因型的患者使用辛伐他汀治疗，在抗炎效果上可能没有差异。

【参考文献】

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[7]李 艳，田彩霞，汪 明，等.CD40基因多态性与急性冠状动脉综合征、高血压和糖尿病的易感相关性[J].中华医学杂志,2007,87(10):690694.