小鼠单核巨噬白血病细胞培养条件优化

摘要：目的探讨小鼠单核巨噬白血病细胞的细胞培养方法。方法采用胰酶消化和细胞刮棒的方法获得细胞最适的传代方法，比较培养基酸碱度、培养耗材等确定最佳培养条件。结果采用细胞刮棒方法，沿着细胞培养瓶一端顺势往另一端轻柔刮取细胞比胰酶消化法获得的细胞传代，对细胞的损伤更小，细胞状态更好，在所有细胞培养条件中，培养耗材的高压灭菌和培养基的酸碱度对细胞的影响最大，在培养过程中需要采取180℃高压灭菌和调节酸碱度来获得细胞的最佳状态。结论采用DMEM高唐培养基+10%FBS，细胞刮棒沿着一个方向轻轻刮取细胞，传代的比例最佳为1∶4，采用过滤的HEPES每次实验时调节培养基酸碱度，是细胞的最佳培养条件。

关键词：小鼠单核巨噬白血病细胞；细胞刮棒；高压灭菌；酸碱度

细胞培养技术是目前很多医学研究离不开的技术，肿瘤细胞在细胞培养中占据核心的地位。肿瘤是对人类威胁最大的疾病之一，是研究癌变机制和抗癌药物筛选的重要手段。肿瘤细胞虽具有无限增殖的特性，但并不表示培养起来很容易，很多因素都会影响到细胞的形态及功能。如：酸碱度、CO2浓度、环境温度等。小鼠单核巨噬白血病细胞（RAW264.7）是炎症研究中非常常见的研究对象，炎症是伴随多种疾病的并发症，因此越来越受到重视。本文根据实践经验，总结RAW264.7细胞在培养过程中的生活特性及影响因素，为细胞科研工作提帮助。

1 RAW264.7细胞研究

RAW264.7细胞是小鼠源性破骨前体细胞，该细胞株由Raschke WC等建立。它来自Abelson小鼠白血病病毒所致的肿瘤[1]。据知网上不完全统计，可以发现我国从1986年就已经有对 RAW264.7细胞的研究了[2]，至2014年共有2700余篇，截止2013年其研究趋势，见图1，可见RAW264.7细胞研究越来越受到重视，因此对于RAW264.7细胞的培养需一个规范化的标准。

图1 RAW264.7细胞研究趋势

2 RAW264.7细胞的培养

RAW264.7是破骨前体细胞，因此在培养过程中很容易分化形成破骨细胞，另外 RAW264.7细胞也是一种巨噬细胞，具有很强的黏附和吞噬抗原的能力，很容易将外界环境中抗原吞噬，而发生分化，出现伪足现象，这是困扰科研工作者的一个难题。因此对RAW264.7细胞的培养也是一个很长时间摸索的过程。正常的RAW264.7细胞是圆形透亮的，而分化之后很容易产生触角，此时细胞已经在功能上发生改变，进而影响实验结果。在我国很多细胞库给购买者的建议是用0.25%的胰酶消化，因此我们采取了用0.25%的胰酶消化法来进行培养，发现用一般的胰酶配制的0.25%的胰酶可以很快的将细胞消化下来，但是对细胞的损伤很大，细胞传代之后在培养瓶中很难贴壁，很少贴壁的细胞，细胞棱廓也变得模糊不清，细胞再也很难恢复之前的状态。根据很多培养RAW264.7细胞的科研工作者的经验，认为RAW264.7细胞很难用0.25%的胰酶消化这一说法，一直困惑着我们。提示这种反差的现象也许跟胰酶的纯度有关。于是我们改用细胞刮棒的方法进行传代，发现细胞状态损伤较小，细胞在传代2~4 h内基本贴壁，且细胞状态完好。具体方法是沿着细胞壁的一端顺势往另一端刮，力度要轻柔，能够将细胞刮掉即可。这里强调一定要轻，细胞是个很脆弱的个体，力度过大对细胞会造成物理损伤，严重时不能恢复其正常形态。对于RAW264.7细胞培养使用的培养基很多经验者建议使用1640，中科院上海细胞库则建议使用DMEM高糖培养基，胎牛血清可使用GIBCO胎牛血清，也可使用国产杭州四季清。因此我们对培养基和胎牛血清（FBS）的使用进行了正交实验，研究发现DMEM高糖培养基与GIBCO胎牛血清培养的细胞状态最好，但对于资金短缺的科研工作者也可以使用DMEM高糖培养基与国产杭州四季清进行培养，1640则需与GBICO胎牛血清配合使用，这样才能保证细胞状态圆而透亮。关于FBS是否灭活则需要根据你所买的FBS是否含有对细胞刺激较大的抗原决定，如有些杭州四季清含有低内毒素，内毒素是引起巨噬细胞炎症反应的激动剂[3]，此时我们则需灭活，因此在购买血清时应尽量避免含有这类抗原的血清。血清购买回来需及时分装，分装需在无菌条件下操作，然后置于-20℃保存。下面根据对RAW264.7培养研究，将细胞复苏，细胞传代以及细胞冻存的要点归纳如下。

2.1细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，迅速将冻存管放到已经预热的水浴锅（37℃）中迅速解冻，不断的摇动，待冻存管内液体完全溶解（控制在1 min内），取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内，将冻存管内的液体转入15 mL离心管，加入2倍体积含10%胎牛血清的DMEM培养基，800 rpm离心3 min，弃去上清液，重悬细胞，接种到培养瓶中，37℃，5%CO2条件下培养，此时重点是细胞冻存本来就是对细胞的损伤，需采用的是20%的胎牛血清进行复苏培养，第二次传代后换成10%FBS培养。

2.2细胞传代 待细胞长至80%~90%时，从培养箱内取出细胞，小心吸出培养液，用PBS清洗，加入3 mL 10%胎牛血清的DMEM培养基，用细胞刮棒沿一个方向轻轻的将细胞刮下来，将细胞悬液转移到15 mL离心管中，800 rpm离心3 min，弃去上清液，加入培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液，分装入培养瓶后，放入培养箱37℃，5%CO2条件下培养，因为RAW264.7细胞的增殖非常快，因此传代比例根据自己实验需要1∶3~1∶10均可。

2.3细胞冻存 待细胞长至80%~90%时，按细胞传代方法把细胞收集起来，将配制好的冻存液加入细胞中重悬，每管2 mL，冻存液的配制方法是：胎牛血清与二甲基亚砜（DMSO）的比例为9∶1，依次放在4℃中40 min，-20℃中40 min，-80℃中过夜，第2 d转移至液氮灌中保存。

3影响RAW264.7细胞培养的因素

3.1培养基酸碱度 根据对RAW264.7的培养研究发现酸碱度对于RAW264.7细胞的培养影响最大，GBICO的DMEM建议在配制过程中加入3.7 g NaHCO3，中科院上海细胞库建议加1.5 g NaHCO3，然后用1MHCL调pH至7.2～7.4，过滤分装置在4℃冰箱备用。但是在冰箱里放置3 d或1 w后培养基就很容易变紫，但是很多研究者并没有在意这个问题，仍然用变紫的培养基继续培养，之后细胞就会出现漂浮或者变成梭形。文献提示可采用HEPES法进行缓冲[4]，我们研究发现虽然HEPES缓冲能力更强，培养基变碱的时间会延长，但放置时间久后仍然会变紫，通过比较可采用将HEPES配置成母液，过滤并分装，然后每次传代的时候用HEPES调节培养基，将培养基调至所需的pH。

3.2培养耗材 RAW264.7细胞是一类巨噬细胞，因此对于接触细胞的培养耗材如：枪头、培养皿等要求需要高一些，研究发现高温180℃烘干的耗材比120℃高压灭菌的耗材培养的细胞，细胞的形态更圆更亮，提示尽量减少抗原有助于RAW264.7细胞的培养，这与方瑶等研究发现相一致[5]。

4结论

RAW264.7细胞的培养和研究已然成为一个趋势，对于RAW264.7细胞的培养也需要标准化的方法，本实验研究发现RAW.264.7细胞的最佳优化条件即：DMEM高唐培养基+10%FBS，细胞刮棒沿着一个方向轻轻刮取细胞，传代的比例最佳为1∶4，采用过滤的HEPES每次实验时调节pH。细胞的培养本身就是一个复杂的过程，只有细胞处于最佳状态时才能给科研工作者带来更可靠的实验结果，因此对于细胞的培养，我们更要花耐心和精力去呵护。

参考文献：

[1]肖新华,廖二元,董源媛,等.小鼠单核细胞RAW264. 7的细胞生物学特征[J].南华大学学报,2008,36(3):283-285.

[2]汪民.立克次体免疫学研究的新进展[J].中国免疫学杂志,1986,2(6):376-379.

[3]Bak MJ, Truong VL, Kang HS, Jun M, Jeong WS. Anti-inflammatory effect of procyanidins from wild grape (Vitis amurensis) seeds in LPS-induced RAW 264.7 cells. Oxidative medicine and cellular longevity. 2013;2013: 409321.

[4]Yu-Mi Shin, Hyun-Joo Jung, Woo-Yong Choi,et al.Chang-Jin LimAntioxidative, anti-inflammatory, and matrix metalloproteinase inhibitory activities of 20(S)-ginsenoside Rg3 in cultured mammalian cell lines[J]. Mol Biol Rep (2013) 40:269-279.

[5]方瑶,毛旭虎,等.小鼠巨噬细胞 RAW264.7 的培养技巧及经验总结[J].现代生物医学进展,2012,12(22):4358-4359.