羽毛肽粉的组分分离综述

根据标准样洗脱曲线，获得标准样的洗脱体积Ve和分配系数Kav［Kav＝（Ve－V0）／（Vt－V0）］。以Kav为横坐标，lgM为纵坐标，利用Oringe7．0作图，求出回归方程lgM＝A＋B×Kav。1．2．5饲用羽毛肽溶液的制备及待测样品预处理将待测样品稀释至约5mg•mL－1，12000r•min－1离心10min，过0．22μm滤膜，上柱，洗脱条件与标准品的洗脱条件一致。通过AKTA收集分析系统，自动生成洗脱体积－吸光度曲线。根据标准曲线方程，样品中肽分子量M＝10A＋B×Kaw。利用Fractioncollectorfrac900收集样品，用于氨基酸组成鉴定。同时，重复1次实验，以证明分离效果是否稳定。各组分氨基酸组成分析将收集的各饲用羽毛肽溶液组分，标准水解法（6mol•L－1HCl真空水解24h）水解后，测试分析其氨基酸组成。

结果与分析

标准曲线及回归方程图1～5依次为蓝色葡聚糖、L－酪氨酸、胰蛋白酶、胃蛋白酶、BSA的洗脱曲线。SephacrylS－100预装柱的外水体积、总体积及各标准品洗脱体积、Kav值、分子量如表1。从图6可见，Kav－lgM直线拟合度佳，回归方程为：lgM＝5．00152－2．48965Kav，R＝－0．99929，SD＝0．05423，P＜0．01均表明线性拟合方程回归显著，lgM与Kav线性相关。羽毛肽粉洗脱及各组分氨基酸组成分析图7为羽毛肽粉溶液洗脱曲线，5个峰（从左至右依次命名为峰1～峰5）对应羽毛肽粉中5类不同分子量大小的组分。峰1的洗脱体积小于外水体积（39．1mL），因此峰1主成分的分子量应大于2000000。根据公式M＝105．00152－2．48965Kav，其余4种组分所对应的分子量分别为6456．54、758．58、398．11、186．21。根据分子量判断，峰1对应的组分为尚未被完全降解的羽毛蛋白；峰2为含50～60个氨基酸的多肽；组分3对应的是六肽或七肽；组分4和组分5分别是二肽或三肽及游离氨基酸。氨基酸自动分析仪对样品氨基酸组成分析结果表明组分5为天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸。组分4及组分3的氨基酸组成分别为：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸；天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸。组分2、组分1氨基酸组成与羽毛原毛相比较少了胱氨酸、甲硫氨酸。

讨论

饲用肽产品开发的意义研究表明，饲料肽制品因富含寡肽（85％含有30个以内氨基酸残基），生物利用率高，在缓解幼小动物的断奶应激、降低腹泻和促进生长等方面都具有良好的效果［13］。可见通过生化技术将大分子量蛋白质降解成肽，可以明显提高蛋白源的应用价值。现代消化理论［14－15］认为，肽可直接被动物体消化道吸收，具有转运速度快，耗能低和不易饱和等特点，避免与游离氨基酸的吸收出现竞争，大大提高了蛋白的吸收利用率。经过体外降解处理的蛋白，吸收利用率也得到显著的提高。寡肽的营养作用包括［16］：（1）促进氨基酸吸收；（2）促进蛋白质合成；（3）促进钙、铁等矿物质吸收；（4）某些寡肽具有免疫活性作用，可以刺激巨噬细胞的生长，促进淋巴细胞的转移和淋巴因子的分泌，提高机体免疫机能。同时，寡肽能够加强动物消化道内的有益菌群的繁殖，提高菌体蛋白的合成，促进鱼苗机体的抗应激能力。因此，饲用羽毛肽粉中寡肽、小肽等小分子量的营养物质的种类及含量是产品质量的重要衡量指标。目前，寡肽产品在养殖中已经得到了广泛的应用［16］：冯键等在草鱼饲料中添加0．25％～1．00％的虾蛋白肽饲养草鱼，明显降低饲料系数。Zambonino等在饲料中添加小肽饲喂海鲈，鱼苗的存活率得到提高。王碧莲等［17］报道了在欧鳗饲料中添加2％和4％的小肽制品后，欧鳗的特定生长率有显著的提高。3．2饲用羽毛肽粉营养分析由氨基酸的平均分子量为110，可以推断AKTApurifier100分离羽毛肽溶液获得的洗脱峰4、5分别对应的是二肽或三肽、游离氨基酸。凝胶排阻法测定峰5所含游离氨基酸的分子量为186．21，根据氨基酸分子量推断组分5应为酪氨酸（M＝181）、精氨酸（M＝174）。但氨基酸自动分析色谱分离结果表明峰5为天冬氨酸（M＝133）、苏氨酸（M＝119）、丝氨酸（M＝105）、谷氨酸（M＝147）。分析认为导致试验结果偏离的可能原因是有：商品化羽毛粉加工过程加入的贝壳粉、膨化剂等助磨、助膨化成分内含有Cu、Fe等金属离子，会与氨基酸螯合，导致凝胶排阻法测定时氨基酸分子量偏大；这与Glahn［18］关于氨基酸对Fe3＋等金属离子具有明显的螯合作用的研究结论相一致；Spears［19］还发现，氨基酸金属螯合物在饲料上的生物学效价要明显高于无机金属源。可明显促进生物体对微量元素的吸收利用，如Fe3＋的吸收利用率提高了83％。现已发现的抗菌肽分子量多为4000～6000Da［20］，峰2所对应的肽含50～60个氨基酸，与抗菌肽所具有的肽链长度较为接近，存在潜在的抗菌性。组分1、2较羽毛原毛少了Cys、Met的可能原因有：（1）采用标准水解法（6mol•L－1盐酸水解）会导致样品中色氨酸（Trp）遭破坏；含硫氨基酸部分氧化，测定结果不准；（2）羽毛肽溶液在分离制备过程中导致部分氨基酸丢失。综合分析实验结果表明饲用羽毛肽粉富含不同分子量的肽段，不仅能在蛋白质吸收利用上提高饲料的生物学效价，其中含有的游离氨基酸还可以促进饲料中其他营养元素如微量元素（Fe、Ca等）的吸收利用、峰2对应的肽可能还具有潜在的抗菌性能，在饲料蛋白源领域具有显著的潜在应用价值。

作者：姚清华 黄薇 林虬 宋永康 林香信 胡兵 单位：福建省精密仪器农业测试重点实验室 福建省农业科学院中心实验室 福建天马饲料有限公司