卷烟烟气联合作用的突变

本文作者：木 潆 潘秀颉 杨陟华 齐绍武 朱茂祥 单位：军事医学科学院放射与辐射医学研究所 湖南农业大学烟草工程技术研究中心

卷烟烟气是由数千种化学物质组成的气溶胶，其中鉴定出的有害成分已超过100种［1］。但对于有害物之间的交互作用仍少见报道，尤其是卷烟烟气有害物在人体内相关代谢问题的研究更为缺乏。由于卷烟烟气的复杂性，使得如何构建符合其特征性的危害性研究方法，已成为研究减害降焦的关键点。谢剑平等［2］研究发现，在卷烟烟气众多有害成分中，对卷烟主流烟气危害性影响最大的7项有害成分指标为：CO，HCN，NH3，4-甲基亚硝基-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK），苯并［a］芘（B［a］P），苯酚和巴豆醛。这些有害物质之间的交互作用，使得采用某种单一纯化学物质的毒理学评价结果不能有效地评价卷烟产品的毒性。然而，近年来，国内外对卷烟烟气中有害成分的研究大多集中在单一物质的毒性影响方面［3-6］，对有害成分之间联合作用的研究仍较缺乏。故有必要结合体外毒理学方法，继续深入探讨卷烟烟气的毒性作用机制和毒性物质之间的联合作用。鼠伤寒沙门氏菌突变实验（Ames）是一种广泛用于检测基因毒性的方法，为CORESTA推荐的检测卷烟产品相对毒性3项体外检测实验之一，可检测卷烟主流烟气的细菌诱变性［7-8］。其中微量波动试验（Microtitrefluctuationtest）是通过细菌代谢产物导致培养基酸碱性变化，来检测受试物的致突变性，比平板法灵敏性更强［9］。B［a］P和NNK为2种卷烟烟气重要代表有害物［10-11］，近年来已成为有关烟草致癌研究的热点。相关研究表明，在主流烟气众多有害物质中，B［a］P和NNK以其强烈的致癌性，已成为卷烟烟气危害性研究的重要代表有害物。B［a］P与多氯联苯联合作用时，能抑制B［a］P代谢产物葡萄糖化，减缓B［a］P代谢速率［12-14］；NNK能诱导支气管上皮细胞的恶性转化［15］，与肺癌的相关性很高［16］；α粒子和NNK联合作用于BEP-2D细胞时，协同效应显著［17］；而B［a］P和NNK之间的联合作用却少见文献报道。探究B［a］P，NNK在卷烟烟气复杂基质中的相互作用关系，有利于分析卷烟烟气有害物质的毒性作用及相关机理，有利于降焦减害研究的发展。为此，对B［a］P，NNK在卷烟烟气复杂基质中的联合作用进行了分析，探讨其联合致突变性的特点，为研发低危害卷烟产品提供一定的实验依据。

1材料与方法

1.1仪器、试剂与材料洁净工作台（北京冠鹏净化设备有限公司）；TS100倒置显微镜（Nikon公司）；BB15型CO2孵箱（Thermo公司）；Milli-Q50超纯水仪（Millipore公司）；680酶标仪（Multiakan公司）；JJ100型单通道吸烟机（中国烟草总公司郑州烟草研究院）；低温冰箱（ThermoFormat公司）；低温高速离心机（Kubota公司）；DHP-9082型电热恒温培养箱（上海-恒科学仪器有限公司）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；MDF-192型-80℃低温冰箱（Sanyo公司）；96孔培养板（Corning公司）。肯塔基参比卷烟3R4F（美国肯塔基大学）；NNK,叠氮化钠（纯度≥99.0%，AlfarAesar公司）；B［a］P、二甲基亚砜（DMSO)、组氨酸、葡萄糖-6-磷酸盐、生物素（AR，Sigma公司）；牛肉膏(Ausable）、胰胨(OXOID)、氧化性辅酶-Ⅱ（Roche公司）；氯化钠（AR，广东西陇化工股份有限公司）；磷酸氢二钠、硫酸镁、柠檬酸、磷酸氢二钾、氯化镁（AR，北京国药集团化学试剂有限公司）；氯化钾、无水乙醇（AR，北京化学试剂公司）；磷酸氢钠铵、二氨基芴（AR，北京百灵威化学技术有限公司）；溴甲酚紫（AR，上海众华生物科技有限公司）；无菌水（自制）。组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌中可检测各种移码型诱变剂的TA98菌株，可检测引起碱基对置换诱变剂的TA100菌株。菌株购至美国ATCC公司，试验前按Ames实验规定方法对菌株进行鉴定，经鉴定合乎试验要求。

1.2方法

1.2.1卷烟烟气冷凝物（CSC）的制备设定吸烟机抽吸周期为60s,抽吸时间为2s,抽吸容量30mL。连接好密封的两个玻璃气体采样器，第一个气体采样器内盛有5.0mL95%的乙醇，第二个气体采样器内盛有5.0mL蒸馏水。点燃卷烟，将卷烟的烟气导入气体采样器管，然后按设定的速率，连续抽吸10支卷烟。待最后一支吸完，气体采样器管内气体完全吸收后，将两管中的收集液混在一起，并用乙醇洗涤气体采样器，与前混合液混合在一起；定容至10.0mL容量瓶中，摇匀后分装在0.50mLEP管中，放至液氮罐中储藏。该参比卷烟的焦油释放量为10mg/支,用10mL溶液连续收集10支卷烟烟气，故卷烟烟气冷凝物CSC的浓度为10mg/mL。

1.2.2微量波动试验96孔板中每孔加入50μL含500个细菌的受试物混合物（1×Vogel-Bonner盐缓冲液，16mg/mL葡萄糖，0.002mg/mL组氨酸，0.0003mg/mL生物素，0.024mol/L磷酸盐缓冲液，0.0066mol/L氯化钾，0.0016mol/L氯化镁，0.001mol/L葡萄糖－6－磷酸，0.0008mol/L辅酶Ⅱ，2%肝S9液及相应浓度受试物）。各受试物单独作用分别采用以下浓度进行测试，CSC:0（CK）,0.005,0.010,0.015,0.020mg/mL无水乙醇溶液；NNK：0（CK）,0.005,0.010,0.020,0.040mg/mL无菌水溶液；B［a］P：0（CK）,0.00025,0.00050,0.00075,0.00100mg/mLDMSO溶液，每种浓度每种菌接种48个孔，37℃孵育16h后加入选择培养基150μL（1×Vogel-Bonner盐缓冲液，8mg/mL葡萄糖，0.0067mg/mL溴甲酚紫）。用二甲基亚砜作阴性对照物，叠氮化钠、二氨基芴作阳性对照物。继续培养72h后观察结果，凡培养液呈黄色浑浊者为阳性反应孔，仍保持蓝色透明者为阴性反应孔，介于黄蓝之间为阴性［18-21］。结果判定：计数每种菌每种受试物每个浓度的突变菌落数或阳性孔数，突变率为阳性孔数/48孔，以浓度为横坐标，突变率为纵坐标作图，比较不同受试物的突变性。

1.2.3联合作用致突变性的测定与分析采用线性回归分析CSC,B［a］P,NNK三者之间的联合作用致突变性。即先测出三者单独作用的致突变性，再任选三者中的两者以固定低剂量（以单一作用致突变率≥0.10剂量为准）与另外一种受试物混合后作用于两种鼠伤寒沙门氏菌株。计算出CSC,B［a］P,NNK两两作用或者三者联合作用的预期值［17］，与实测值相比较。实际作用曲线位于预期曲线上方或者与曲线相接近，表明受试物之间为相加作用；若位于预期曲线下方和单独作用曲线之间，则表明受试物之间为协同作用（弱相加）；若位于单独作用组曲线下方，则表明受试物之间为拮抗作用，若与单独作用曲线相接近，则无明显协同作用。

2结果与讨论

2.1CSC，B［a］P，NNK单独作用致突变性由图1可知，随受试物浓度的增大，突变率逐渐升高，表现出良好的剂量效应趋势。3种受试物单独作用的致突变性差异较大，表现为：B［a］P>NNK>CSC。本实验联合作用研究选择突变率较低的剂量，3种有害物的剂量选择如下：CSC为0.005mg/mL，B［a］P为0.00025mg/mL，NNK为0.005mg/mL。

2.2联合作用致突变性

2.2.1CSC与低剂量B［a］P或NNK的两两联合作用由图2可知，固定低剂量B［a］P（0.00025mg/mL）与CSC联合作用致两种细菌突变性均高于CSC单独作用，实测值与预期值相当，提示两者间存在相加作用。固定低剂量NNK（0.005mg/mL）与CSC联合作用；致TA98突变率高于CSC单独作用组（0.020mg/mL除外），实测值与预期值相当，呈相加作用；致TA100突变率低于预期值，且低于CSC单独作用（0,0.005mg/mL除外），呈拮抗作用。

2.2.2B［a］P与低剂量CSC或NNK的两两联合作用由图3可知，固定低剂量CSC（0.005mg/mL）与B［a］P联合致两种细菌的突变率变化趋势均为低剂量（0,0.00025mg/mL）高于单独作用组，呈弱相加作用；中剂量（0.00050mg/mL）低于单独作用组；高剂量（0.00075,0.00100mg/mL）与单独作用组相当无明显协同作用。固定低剂量NNK（0.005mg/mL）与B［a］P联合致两种细菌的突变率，低剂量和高剂量均高于单独作用组，且与预期值相当，呈弱相加作用；中间剂量无明显相关作用。‘

2.2.3NNK与低剂量CSC或B［a］P的两两联合作用由图4可知，固定低剂量CSC（0.005mg/mL）与NNK联合时，致TA98菌株呈协同作用（0.040mg/mL除外）；致TA100菌株低剂量（CK,0.005mg/mL）呈弱相加作用，中间剂量（0.010mg/mL）呈协同作用，高剂量（0.020,0.040mg/mL）无相关作用。固定低剂量B［a］P（0.00025mg/mL）与NNK联合时，致TA98菌株无相关作用；致TA100菌株低剂量（CK,0.005,0.010mg/mL）呈弱相加作用，高剂量（0.020,0.040mg/mL）呈协同作用。

2.2.4CSC，B［a］P，NNK三者联合作用由图5可知，固定低剂量B［a］P和NNK，二者联合与CSC作用［表示为CSC+（B［a］P+NNK）］，致TA98突变率高于CSC单独作用组，与预期值相当，呈相加作用；致TA100突变率低于预期值，联合作用低剂量（0,0.005,0.010mg/mL）高于单独作用组，高剂量（0.015,0.020mg/mL）低于单独作用组，无明显相关作用。固定低剂量CSC和NNK，二者联合与B[a]P作用［表示为B［a］P+（NNK+CSC）］，致TA98和TA100突变率低剂量呈弱相加作用，高剂量无明显相关作用。固定低剂量CSC和B［a］P，二者联合与NNK作用［表示为NNK＋（CSC+B［a］P）］，致TA98突变率呈弱相加作用（0.04mg/mL除外）；致TA100突变率联合作用低剂量呈弱相加作用，中剂量无相关作用，高剂量呈拮抗作用。

3结论

研究结果表明，CSC,NNK和B[a]P均可诱导鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA100发生突变，具有良好的剂量-效应关系。低剂量B[a]P与CSC联合呈相加作用；低剂量CSC与B［a］P联合低剂量弱相加，高剂量无相关作用。低剂量NNK与CSC联合致TA98呈相加作用；致TA100呈拮抗作用。低剂量CSC与NNK联合致TA98呈协同作用；致TA100低剂量呈弱相加，中间剂量呈协同作用，高剂量无相关作用。低剂量B［a］P与NNK联合致TA98菌株无相关作用；致TA100菌株低剂量呈弱相加，高剂量呈协同作用。低剂量NNK与B［a］P联合低剂量和高剂量均呈弱相加作用，中间剂量无明显相关作用。CSC+（B［a］P+NNK）致TA98突变性相加作用显著；B［a］P+(NNK+CSC)致TA98和TA100突变率低剂量呈弱相加作用，高剂量无明显相关作用。NNK＋（CSC+B［a］P）致TA98低剂量呈弱相加作用，高剂量无明显相关作用；致TA100低剂量呈弱相加作用，高剂量呈拮抗作用。CSC,B［a］P与NNK以不同浓度两两或者三者联合作用于细菌时，都具有不同程度的联合效应。NNK和B［a］P在卷烟烟气复杂基质中的联合致突变性呈现量效、时效和先后作用顺序的复杂性。