高效液相色谱法测定饲料及食品中三聚氰胺的研究

[摘要] 目的:建立用高效液相色谱-二极管阵列法(HPLC-DAD)测定饲料及食品中三聚氰胺残留量的方法。方法:样品经提取分离后,用HPLC-DAD法测定,外标法定量。色谱条件:C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈-辛烷磺酸钠溶液(柠檬酸调节pH至3.0,10∶90),流速为1.0 ml/min;进样量为20 μl;柱温为35℃;190~400 nm波段扫描,检测波长为236 nm。结果:三聚氰胺在0.5～10.0 μg/ml范围内线性关系良好,相关系数R=0.999 98。最低检测浓度为0.05 μg/ml,回收率在89.28%～96.89%范围内,RSD

[关键词] 三聚氰胺;奶制品;饲料;鸡蛋;高效液相色谱法

[中图分类号] O642.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)06(c)-012-03

Determination of melamine residue in feed and food by HPLC

LIU Hongju1, YAN Chong1, LI Guoliang1, ZHOU Peiling1, LIU Hongguo2

(1.School of Pharmacy, Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China; 2.Hebei Ideal & Hightech Pharmaceutical Corporation Limited, Shijiazhuang 050021, China)

[Abstract] Objective: To establish a method for the determination of melamine residue in feed and food using high performance liquid chromatography-diode array detection (HPLC-DAD). Methods: After the sample was extracted and cleaned, melamine was analyzed by HPLC-DAD. Using C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 μm), acetonitrile and 10 mmol/L sodium octanoate solution (adjusted pH to 3.0 with acetic acid, 10∶90) were used for this method. The flow rate was 1.0 ml/min and DAD detection at 236 nm. The temperature of the column was 35℃. Results: The linear range was 0.5-10.0 μg/ml, and the correlation coefficient was 0.999 98. The limit of melamine ranged from 89.28%-96.89% with relative standard deviation (RSD) less than 3.5%. Conclusion: The results indicate that this method is simple and quick, and can meet the requirement for determination of melamine in feed and food.

[Key words] Melamine; Diary products; Feed; Egg; HPLC

三聚氰胺是一种重要的含氮杂环有机化工原料,为尿素后加工产物,主要用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂(NF)的原料,而且还能用作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂。三聚氰胺的含氮量为66.6%,折合粗蛋白含量为416.27%,添加到饲料及食品中可大幅度提高蛋白含量指标,但也能引发肾衰竭并导致死亡。2007年3月,美国发生了宠物饲料导致猫狗致死的事件,而后在回收的宠物食品、死亡动物的尿液结晶和肾脏中都发现有三聚氰胺。2008年9月,我国发生了“三鹿奶粉事件”,此次事件的原因是奶农为提高牛奶中的蛋白含量指标,在其中添加了三聚氰胺,致使大量婴儿摄入过量的三聚氰胺,全国范围内大量婴儿出现肾脏功能障碍,部分婴儿甚至出现肾衰竭而死亡。在对其他奶制品和鸡蛋等食品进行抽样检查时也检测出了三聚氰胺。为了保证人们的身体健康,确保食品安全,企业和食品安全监管部门必须对食品和饲料中的三聚氰胺进行检测。

三聚氰胺的传统检测方法有显微镜法[1]、酶联免疫法[2]、气相色谱-质谱联用法[3-5]、高效液相色谱法(HPLC)[6-7]、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)[8-10]、可见/近红外光谱快速判别法[11]、试纸卡快速检测法[12]等。GC-MS需要衍生化,过程比较繁琐。HPLC由于其无需衍生化,是目前最为常用的检测方法。HPLC-MS/MS灵敏度高、抗干扰能力强,在部分实验室作为确证方法使用。

本文研究饲料、乳制品和鸡蛋中三聚氰胺的高效液相色谱-二极管阵列(HPLC-DAD)检测方法。针对不同的样品,建立了不同的样品前处理方法。为增加三聚氰胺的保留,采用离子对色谱法,并比较了流动相的组成、比例、pH值及离子对试剂的种类对检测效果的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1200型高效液相色谱仪(配有二极管阵列检测器,Agilent公司);RQ1200DB型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Anke TGL-16C离心机(上海安亭有限公司)。

水为超纯水,三聚氰胺(天津市化学试剂厂,含量不低于99.5%),乙腈为色谱纯,盐酸、高氯酸、甲酸、三氯乙酸、辛烷磺酸钠、柠檬酸均为分析纯。饲料、蛋白粉、液体奶、奶粉、杏仁露、奶糖、鸡蛋均购于超市或市场。

1.2 色谱条件

色谱柱为Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈-10 mmol/L辛烷磺酸钠(柠檬酸调节pH至3.0,体积比为10∶90);流速为1.0 ml/min;进样量为20 μl;柱温为35℃;检测波长为236 nm。

1.3 标准储备液的配制

精密称取三聚氰胺对照品约25 mg,置25 ml量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,得浓度约为1 mg/ml的标准储备液,保存于冰箱中备用。

1.4 样品处理

1.4.1 饲料准确称取样品0.25 g,加入1%三氯乙酸10 ml,摇匀,超声提取20 min,12 000 r/min离心2 min,取上清液0.5 ml,加入流动相1.5 ml,摇匀,用0.45 μm滤膜过滤,取20 μl进样。

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1.4.2 液体奶类精密量取样品1 ml,准确加入乙腈9 ml,摇匀,于12 000 r/min离心2 min,取上清液0.5 ml,准确加入流动相1.5 ml,摇匀,取上清液用0.45 μm滤膜过滤,取20 μl进样。

1.4.3 奶粉和蛋白粉精密称取样品0.25 g,加水1 ml,混匀,加入乙腈9 ml,摇匀,于12 000 r/min离心2 min,取上清液0.5 ml,准确加入流动相1.5 ml,摇匀,用0.45 μm滤膜过滤,取20 μl进样。

1.4.4 奶糖精密称取样品约0.25 g,加入10 ml水研磨至全部溶解,移入分液漏斗中,加入石油醚10 ml,充分振摇后静置10 min,取下层液体1 ml,加入乙腈9 ml,摇匀后于12 000 r/min离心2 min,取上清液5 ml,水浴浓缩至干,加流动相1 ml使溶解,用0.45 μm滤膜过滤,取20 μl进样。

1.4.5 鸡蛋取鸡蛋的蛋黄和蛋清,匀浆后称取2 g,加入乙腈8 ml,摇匀,12 000 r/min离心5 min,取上清液。沉淀物再加乙腈5 ml,摇匀后离心,取上清液。收集2次上清液,置水浴上浓缩至干,残渣用5 ml流动相溶解后转移至分液漏斗中,加入石油醚10 ml,振摇1 min。取下层乳状溶液,于12 000 r/min离心后,取下层澄清溶液,用0.45 μm滤膜过滤,取20 μl进样。

2 结果

2.1 系统适用性试验

在上述色谱条件下,三聚氰胺的保留时间在12.2 min左右,峰形对称,样品中的杂质对测定基本无干扰。三聚氰胺对照品、各空白样品、含三聚氰胺样品的色谱图见图1。

(1:三聚氰胺)

(1: melamine)

图1三聚氰胺对照品(A)、空白饲料(B)、空白牛奶(C)、空白鸡蛋(D)和含三聚氰胺牛奶(E)的色谱图

Fig.1 HPLC chromatograms of melamine reference substance (A), blank feed (B), blank milk (C), blank egg (D) and milk with melamine (E)

2.2 线性关系考察与最低检测限试验

精密量取标准储备液10 ml,至100 ml量瓶中,加水至刻度,得浓度为100 μg/ml的标准溶液,分别吸取此溶液0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 ml于100 ml量瓶中,加水至刻度,得到浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/ml的标准工作液,分别取20 μl进样,高效液相色谱检测,将其所得的峰面积与所对应的浓度(μg/ml)进行线性回归。结果表明,在三聚氰胺的浓度为0.5～10.0 μg/ml范围内,三聚氰胺的峰面积与浓度呈良好的线性关系。回归方程为A=77.53C+1.15,相关系数R=0.999 98。信噪比等于3时检测浓度为0.05 μg/ml。

2.3 精密度和回收率

在空白饲料中添加浓度分别为80、800、1 600 mg/kg的三聚氰胺,在牛奶中添加浓度分别为10、100、500 mg/L的三聚氰胺,在奶糖中添加浓度分别为2、4、6 g/kg的三聚氰胺,在鸡蛋中添加浓度分别为5、15、25 mg/kg的三聚氰胺,分别进行回收率试验,平均回收率和精密度试验结果见表1。

表1回收率试验(%,n=9)

Tab.1Recovery test (%, n=9)

2.4 样品测定

本实验共检测了多种饲料、液体奶、奶粉、蛋白粉、杏仁露、奶糖和鸡蛋,发现一种饲料和舒化奶中含三聚氰胺,其含量分别为397.6 mg/kg和12.5 mg/L,其他样品中均未发现三聚氰胺。

3 讨论

3.1 三聚氰胺的溶解性

三聚氰胺属于强极性碱性化合物,能溶于乙腈、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶,微溶于水、乙醇,不溶于乙醚、苯和四氯化碳。实验中分别用甲醇、甲醇-水、乙腈、乙腈-水、水溶解三聚氰胺,发现三聚氰胺在水中的溶解速度最快、溶解度最大,故标准液用水作溶剂。

3.2 提取条件的选择

3.2.1 饲料由于三聚氰胺在水溶液中溶解度较大,因此选择用1%三氯乙酸水溶液提取饲料并沉淀蛋白。在做饲料回收率试验时发现,饲料与提取溶液的比例越大,提取回收率越低,0.25 g饲料需用10 ml三氯乙酸溶液提取,回收率才能达到90%以上,其原因可能为饲料中的某些物质对三聚氰胺产生“吸附作用”。

3.2.2 牛奶和奶粉提取牛奶时,与1%三氯乙酸相比,用乙腈沉淀蛋白的效果更好,但加入乙腈的量一定要充足,否则蛋白沉淀不完全。实验考察了使用牛奶体积5、6、7、8、9倍量的乙腈对回收率的影响,发现8、9倍时回收率最高,蛋白沉淀最完全。奶粉需要先加水摇匀,再加乙腈沉淀蛋白,若直接加乙腈则蛋白不能沉淀完全。另外,实验发现若蛋白沉淀不完全,三聚氰胺能与牛奶中的某些成分结合,测定时出现2个与三聚氰胺吸收光谱相似的峰,或不出峰,而加入足量时,则只出现1个色谱峰。

3.2.3 奶糖奶糖中含有大量的奶油等非极性物质,所以先用石油醚萃取脱脂,再按照牛奶的处理方法处理。

3.2.4 鸡蛋鸡蛋的蛋黄含有较多的脂类和色素,文献均利用正己烷进行脱脂;而本实验则利用石油醚进行脱脂,脱脂效果比较理想。在脱脂过程中,需要用力振摇,静止一段时间,使分液漏斗中的液体分为三层,最上层为澄清的石油醚层,中间一层为橙黄色的油状脂肪层,最下层呈乳白色的乳化层。取最下层离心后,弃去悬浮的少许橙黄色油状液体,吸取下层的澄清液体,过0.45 μm滤膜后进样测定。

另外,样品进样前都应加入适量的流动相,否则会出现分叉峰、双峰,甚至不出峰。

3.3 流动相的选择

实验比较了多种流动相对色谱峰的峰形、柱效、保留时间等的影响。本实验考察了三聚氰胺在流动相为乙腈-水(5∶95)或乙腈-0.1%甲酸(5∶95)或乙腈-1%氨水(高氯酸调pH为6.56,5∶95)时的保留情况,结果表明三聚氰胺在此类条件下都不保留。实验最终选用乙腈-10 mmol/L辛烷磺酸钠(柠檬酸调pH为3,10∶90)为流动相,保留时间约为12.3 min,峰对称性较好,塔板数大于13 000。当改变pH至3.5、4.0、4.5、5.0时,色谱峰变宽并出现前延。

3.4 最佳检测波长的选择

从三聚氰胺的紫外扫描图谱可以看出,三聚氰胺在236 nm和210 nm处有最大吸收,而多数杂质在210 nm处有吸收,所以选择检测波长为236 nm。

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(收稿日期:2010-03-15)

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