凝胶色谱法测定头孢菌素中高分子杂质心得

【摘要】凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是于六十年代初发展起来的一种快速简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便且对高分子物质有很高的分离效果，所以凝胶色谱法在测定头孢菌素中高分子杂质方面应用很广，有鉴于此本文对头孢菌素中高分子杂质的凝胶色谱法测定进行了详细的阐释，对具体的测定方法及操作方法也一并做了介绍，希望对我国头孢菌素类药物高分子杂质的测试有所帮助。

【关键词】头孢菌素类药物；凝胶色谱技术；高分子杂质

【中图分类号】R927，2

【文献标识码】A

【文章编号】1672-5158（2012）12-0391-01

目前经国内外临床试验研究证明多数抗生素所致的速发型过敏反应与药品中的高分子杂质有关，可见高分子杂质的含量对药品质量影响很大。所以为了有效提高药品的纯度及减少不良反应的发生，就要不断采取措施减少头孢菌素类药物中的高分子杂质的含量。

一、仪器与实验准备上的注意事项

在采用液相色谱仪测定抗生素中的高分子杂质含量时，应该严格遵守实验室液相色谱仪的检定规程定期进行检定。在仪器的使用过程中要认真参阅操作说明书，严格按照规范操作才能使得测量结果更加准确。

1、仪器准备

在实验准备中，如果采用自行配置的简易仪器或系统应包括输液单元、检测单元和记录及数据处理单元三部分。输液单元应能在实验过程中提供稳定的流速，而检测单元应该满足紫外检测能力，应能向色谱工作站或积分记录仪输出模拟信号，以进行数据的记录和处理。在自行配置的仪器系统中也可以参照液相色谱仪的检测规定，拟定自检规程和技术指标，也要注意定期的检定以此来保证实验的重现性。

2、凝胶色谱柱准备

在色谱柱规格的选择上应该从仪器系统的最大进样能力、所分析样品的溶解能力以及检测限度等方面综合进行考虑。通常凝胶色谱柱的体积小于柱床体积，所以一般头孢菌素抗生素高分子杂质测定的柱床体积应为60ml以上。

3、玻璃柱管的分端及凝胶介质的选取

在玻璃柱管的分端上，一般开口的玻璃柱管可以采用玻璃棉加开口橡胶塞来封端，也可以在一端烧结石英过滤板或者通过直接购买带调节头的商品玻璃柱管。凝胶色谱法在凝胶介质的选取上可选用的凝胶有很多种，目前对抗生素高分子杂质的测定多数采用的是葡聚糖凝胶，选取这种凝胶介质后一定要注意在使用之前需用水充分的溶胀，可以根据需要填制的凝胶柱柱床体积来具体计算用量。如果溶胀使采用蒸馏水浸泡的方式，也可以在温度为4℃的冰箱中放置48小时，也可在水浴中煮沸一小时，这样才能保证溶胀充分。在这两种溶胀方式中都应该注意随时搅拌出去气泡，必要情况下还可以进一步的进行真空脱气。

4、装柱

将溶胀好的凝胶介质用蒸馏水悬浮静置后，每次倾去上层液，以去除凝胶碎屑和杂质。按照这种方法进行多次洗涤，直到上层的精置液澄清为止。实践中可将凝胶介质用水制成悬浆，然后一次性的倒人垂直放置的玻璃柱管中，待凝胶颗粒沉降完毕后即完成装柱。也可在垂直放置的玻璃柱管和漏斗上放开柱管下口，保持液流顺畅，用滴灌逐管从漏斗中加入凝胶悬浆，让凝胶颗粒在蒸馏水中缓慢沉降，注意让漏斗中随时保持一定的凝胶悬浆。运用此种方法会使装柱得时间较长，必要时可以在出柱口增加负压加快装柱时间。另外需要注意新填装的色谱柱要先用水连续冲洗，这样才能让凝胶紧密均匀地填充在柱管中。

5、凝胶柱的维护及恢复

凝胶柱的维护方面要保证柱床的连续性和平整性，如果发现凝胶出现收缩或气泡的情形，就应该及时将凝胶从柱管中倒出以便重新进行装柱。如果仅仅在柱头发现少许污染或破坏，可用小勺将该部分的凝胶挖掉，然后往内加入少量水用玻棒扰动凝胶面，静置到凝胶颗粒达到重新沉降以后封闭柱头。如果在色谱柱中发生严重的非特异性吸附，就有可能改变凝胶色谱柱的分离机制，还有可能造成柱得堵塞使柱压升高，在这种晴况下就要对凝胶进行恢复性的处理。

二、系统适用性实验

系统适用性试验对溶液的制备更加注重方便性和可操作性，系统适用性试验用溶液的配制方法为用主成分对照品与杂质对照品混合配制，但还是会使得有些杂质对照品不能得到，如性质不稳定或分离提取技术要求太高等，但这些杂质峰恰恰又是与主成分峰最难分离的色谱峰。系统适用性试验目前包括很多内容，主要考察对照品测定系统与高分子杂质测定系统中蓝色葡聚糖2000溶液峰的保留时间的比值，以及理论板数和拖尾因子，以此来控制对照品测定与高分子杂质测定时仪器状态的同一性。在以蓝色葡聚糖2000的保留时间来表示高分子杂质的保留特征时，对照品色谱峰及高分子杂质色谱峰与蓝色葡聚糖2000溶液色谱峰保留时间的比值都应控制在一定的限度内，由此才能实现对色谱柱状态的正常控制。

三、操作方法上的注意事项

1、样品溶液及对照溶液的制备

具体操作中必须要按规定的标准来配制样品溶液，由于某些高浓度抗生素溶液具有一定的不稳定性，所以通常对样品溶液采取即溶即进的形式。对照溶液的制备上，要注意头孢菌高分子杂质的含量测定，通常以样品自身在SDS水溶液或纯水中的缔合物作为对照进行定量。在制备缔合物时特别要注意对浓度及水的纯度的控制，以此来保证缔合完全。

2、进样及进样方式

由于头孢菌素高分子杂质的含量测定，需要对照溶液分别在不同流动相状态下进样，所以更换流动相后凝胶色谱柱应充分平衡后才能进样。进样方式可以采用色谱仪自动进样，也可以选取手动的方式，但是两种进样方式都必须要做到色谱柱端没有死体积，这样才能避免样品的扩散造成峰展宽甚至影响分离。在自动进样操作时可以参照有关液相色谱操作规程进行，手动进样方式主要用于开口柱。

3、凝胶面的平整

手动进样时还要注意保持凝胶面的表面平整。进样前用滴灌吸掉凝胶上的液体保持色谱柱下端流畅，待柱内液体降至凝胶面之下时再用定量器具精密量取规定体积的样品溶液，然后加入到色谱柱凝胶表面上，等到样品溶液降至凝胶表面以下时再吸取少量流动相沿色谱柱管内壁缓缓加入，以洗下残留在色谱柱管壁的样品溶液，再从柱顶端加入一定量的流动相，并恢复流路，开始记录进样时间。

4、记录对照及结果

要分别记录样品和对照溶液的色谱图，积分对照溶液的峰面积和样品溶液中处于外水体积的高聚物杂质面积，按外标法以峰面积计算样品中高分子杂质的含量。按平行实验的平均值作为样品中高分子杂质含量的最终结果，并与标准规定限度比较后作出是否符合规定的判断。

5、样量分析

在一般高效液相色谱仪上使用凝胶柱，应严格限制泵压。由于一般高压液相色谱管路和检测器通路狭窄，极易发生堵塞，所以要注意尽量减少将出柱液连接到检测器的时间，尤其是新填充的色谱柱更应经水或流动相充分平衡后再连接到检测器。

结束语

抗生素类药物中的高分子杂质是指药品中分子量大于药物本身的杂质，生产过程中产生的残留或污染属于蛋白类杂质，而抗生素的生产贮存和使用条件下发生的分子间的聚合反应产物则属于聚合物杂质，这些杂质的存在都对药品的纯度有所影响，所以实践中运用凝胶色谱法来测定头孢菌素中的高分子杂质就显得十分重要，应该注意此方法的改进及运用，从而使头孢菌素类药的纯度不断得到提高，以不断满足消费者对药品质量的需要。