乳腺癌NKG2D表达及对NK细胞杀伤活性的影响

【摘要】 目的 分析乳腺癌NKG2D表达及对NK细胞细胞毒的影响。方法 应用免疫荧光技术和流式细胞术(FCM)分选25例乳腺癌、25例健康对照的外周血NK细胞,定量分析NKG2D 蛋白表达。用MTT比色法检测抗NKG2DpAb加入前后NK细胞的细胞毒效应。结果 乳腺癌患者NK细胞的NKG2D蛋白表达量均低于正常对照,差异有显著性(P

【关键词】 乳腺癌;杀伤细胞,天然;NKG2D

Expression of NKG2D and Its Effect on Cytotoxicity of NK Cells in Human Breast Cancer

ZHOU Feng-ling, LIN Na.Department of biochemical laboratory,Jining medical college,Jining 272013,China

【Abstract】 Objective To analyze the expression of NKG2D and its effect on cytotoxicity of natural killer (NK) cells in patients with breast cancer.Methods NK cells in the peripheral blood of 25 patients with breast cancer and 25 healthy subjects were sorted by immunofluorescence technique and flow cytometry(FCM).Expression of NKG2D protein was quantitatively analyzed.The cytotoxicity of NK cells before and after addition of NKG2DpAb was detected by monotetrazolium(MTT) colorimetry. Results The levels of NKG2D expression in NK cells of patients with breast cancer were significantly lower than those in normal controls (P

【Key words】 Breast cancer; Natural killer cell; NKG2D

NKG2D是NK细胞表面主要的活化性受体,近年来研究表明NKG2D在NK细胞的感染免疫和肿瘤免疫发挥重要的作用,成为肿瘤免疫机制研究热点。国内外很多研究发现,NKG2D受体的下调可导致多种肿瘤的发生[1,2]。作者应用流式细胞术(FCM)比较和分析乳腺癌外周血NK细胞NKG2D的表达情况,并以白血病细胞K562分析抗NKG2 DpAb对NK细胞的细胞毒作用的影响,以期探讨NKG2D表达异常与乳腺癌的相关性,为乳腺癌防治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取活检病理诊断明确的原发性乳腺癌25例,均未经手术及放、化疗治疗,平均年龄42.3岁,对照组为健康献血员25例,平均年龄41.1岁。

1.2 主要试剂和设备

鼠抗NKG2D多抗购自美国eBioscience。鼠抗人CD3/PE-Cy5,鼠抗人CD56/FITC及PE标记的鼠IgG1同型对照均为晶美生物技术有限公司公司提供。流式细胞仪为美国Becton Dickson公司产品。人白血病细胞株K562 (美国ATCC)由济宁医学院生化实验室冻存。

1.3 FCM检测NKG2D的表达 试验管中加入鼠抗人CD3/PE-Cy5 5 μl, 鼠抗人CD56/FITC 10 μl,鼠抗人NKG2D/PE 20 μl;对照管中加入鼠抗人CD3/PE-Cy5 5 μl, 鼠抗人CD56/FITC 10 μl,鼠IgG1同型对照20 μl。各加入抗凝全血20 μl,混匀,暗处封闭放置30 min。加入溶血素2 ml,混匀,暗处封闭放置10 min。以3000 r/min,离心5 min,弃上清。每管加PBS液2 ml,混匀,以3000 r/min,离心5 min,弃上清。送于流式细胞仪上测定NKG2D的表达:选择氢离子激光激发,激发波长为488 nm,测定中以前向角散射(FSC)对侧向角散射(SSC)设门,调整电压及增益,圈出淋巴细胞群,选择CD56+CD3-的细胞群设门分析,避免T细胞(CD56+CD3+)的干扰,获取门内10 000个细胞。检测后用Cellguest软件进行分析,得出荧光标记阳性细胞的百分数。

1.4 NK细胞的细胞毒实验及抗NKG2DpAb的阻断作用检测 取对数生长的靶细胞,用RPMI1640完全培养液调整细胞密度为1×106/ml, 加于96孔板中,每孔0.1 ml 。于37℃、50 ml/L COS2条件下培养24 h后,根据效靶比50∶1分别加入相应量的效应细胞,各组均设3个平行孔。继续孵育24 h后,加入5 g/L的MTT 液20 μl,继续培养4 h。弃去MTT ,加入150 μl DMSO ,充分振匀后,在SUNRISE酶标仪上于波长570 nm测定每孔吸光度(A)值。将浓度分别为0.1 mg/L、0.5 mg/L及1 mg/L的NKG2DpAb和效应细胞于37℃ CO2孵箱孵育45 min后,进行细胞毒实验,检测抗NKG2DpAb对NK细胞杀伤效应的阻断作用[3]。

1.5 统计学处理 两组间计量数据比较用t检验。

2 结果

2.1 乳腺癌外周血NK细胞NKG2D表达情况 乳腺癌患者外周血自然杀伤细胞表面NKG2D受体的表达量为(95.10±2.97)%,正常对照组为(98.03±0.80)%,乳腺癌组的表达量较正常对照组降低,差异具有统计学意义(P

2.2 NKG2DpAb对NK细胞杀伤活性的影响 乳腺癌组NK细胞杀伤活性为(42.51±6.45)%,正常对照组为(64.56±6.46)%,乳腺癌组低于正常对照组,差异具有统计学意义(P

3 讨论

NKG2D是主要表达于NK细胞表面的一种刺激受体。研究表明,由于肿瘤细胞和某些病毒感染细胞的MHC-I类分子丢失或变异, 使得特异性MHC限制的细胞毒T 细胞不能发挥作用,在这种情况下,识别非MHC-I 类分子的NKG2D在介导NK细胞识别和溶解大量肿瘤和感染细胞的免疫反应中可能发挥关键作用[4]。

本研究应用流式细胞术分析乳腺癌外周血N K细胞N KG2D的表达情况,发现乳腺癌患者NK细胞的NKG2D蛋白表达量均低于正常对照,差异有显著性(P

本实验发现,NK细胞对K562细胞有较高的杀伤活性,抗NKG2DpAb能显著抑制NK细胞对K562细胞的细胞毒效应,说明NKG2D在NK细胞对K562细胞的杀伤中起主导作用。抗NKG2DpAb由于可封闭效应细胞表面的NKG2D分子,因而可阻断NKG2D介导的效应细胞对靶细胞的细胞毒作用。进一步证实了NKG2D表达在NK细胞杀伤肿瘤细胞效应中的作用。Groh等[2]的研究也发现,在肿瘤患者大量的肿瘤浸润和相对应的外周血中,NKG2D 的表达显著减少,与本研究结果是一致的。

然而,许多肿瘤细胞天然表达NKG2D的配体,为什么机体免疫系统不能有效的清除这些肿瘤细胞呢?推测其原因可能包括:① 肿瘤细胞天然表达的配体数量较少,不足以激发清除或排斥肿瘤的免疫反应;② 肿瘤细胞在体内发生的早期阶段,不表达或极少表达NKG2D 抗体;③ NKG2D配体表达阳性的肿瘤细胞也表达一定数量的可溶性配体,封闭NKG2D的结合位点,反而使肿瘤细胞逃逸了NKG2D介导的免疫。MICA+肿瘤患者,其血清内可检测到可溶性MICA分子的存在,并且引起T细胞表面NKG2D水平的下调[5,6] 。可溶性的NKG2D配体的表达似乎是引起配体阳性肿瘤细胞“逃逸”的重要原因。但是,什么原因导致了MICA/B、ULBPs或是鼠源的H60/Rae1等的可溶性表达,最近,Salih等[7]和Steinie等[8]报道了金属蛋白酶裂解MICA 和ULBP蛋白,导致MICA 和ULBP蛋白的可溶性表达和细胞表面表达水平的下调,降低了NKG2D介导的细胞毒活性,这可能是导致某些NKG2D配体从胞膜上脱落并使肿瘤细胞“逃逸”免疫的重要原因。另外一个可能的NKG2D配体的“脱落”(shedding)机制是基因在转录过程中的碱基突变或错配,导致终止密码子的过早形成,只能以可溶性形式表达,这一点至今还没有相关的证据支持。研究可溶性配体的脱落机制,对于阐明某些肿瘤细胞免疫逃逸的机制,并最终找到治疗这些肿瘤的有效方法具有重要价值。

肿瘤发生的确切机制仍不很清楚。最近研究认为,肿瘤细胞可能通过抑制信号对激活信号的阻断作用而逃避NK溶解效应。Menier等[9]应用一种能自发表达NK激活配体MICA 和抑制配体HLA-G1两cDNA的M8黑色素瘤细胞系进行对比研究,发现虽然两种配体功能截然相反,但同时表达时,HLA-G1能削弱MICA的激活信号并占主导地位,能抑制NK细胞细胞毒效应。这也提示,NK激活和抑制信号之间的平衡在影响肿瘤进程中起关键作用。

因而尚需进一步研究NKG2D受体及配体表达的调节机制,以及调节刺激两者的表达对NK细胞与靶细胞相互作用的影响。

参 考 文 献

[1] 刘敏,孔北华,曲迅.卵巢肿瘤患者自然杀伤细胞活化性受体NKG2D与其配体MICA表达的初步研究.中国免疫学杂志, 2005, 21(5):347-354.

[2] Groh V, Wu J, Yee C, et al.Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation.Nature, 2002, 419(6908):734-738.

[3] 刘映霞,胡国龄,谭德明,等.NKG2D多克隆抗体抑制NK细胞和LAK细胞细胞毒作用的研究.细胞与分子免疫学杂志,2003,19(2):258-261.

[4] Jamieson AM, Diefenbach A, McMahon CW, et al.The role of the NKG2D immunoreceptor in immune cell activation and natural killing.Immunity, 2002, 17(1): 19-29.

[5] Salih HR, Antropius H, Gieseke F, et al.Functional expression and release of ligands for the activating immunoreceptor NKC2D in leukemia.Blood, 2003, 102(4): 1389-1396.

[6] Groh V, Wu J, Yee C, et al.Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation.Nature, 2002, 419(6908):734-738.

[7] Salih H, Rammensee HG, Steinle A, et al.Cutting edge:down-regulation of MICA on human tumors by proteolytic shedding.J Immunol, 2002, 169(8):4098-4102.

[8] Waldhauer I, Steinle A.Proteolytic release of soluble UL16-binding protein 2 from tumor cells.Cancer Res, 2006, 66(5): 2520-2526.

[9] Menier C , Riteau B , Carosella ED , et al .MICA triggering signal for NK cell tumor lysis is counteracted by HLA-G1-mediated inhibitory signal.Int J Cancer, 2002, 100(1):63-70.