动态浊度法测定人凝血酶原复合物制品中细菌内毒素含量

摘要： ［目的］ 建立动态浊度法定量测定人凝血酶原复合物制品中细菌内毒素含量的方法。

［方法］ 通过对样品中定量添加标准内毒素的干扰试验，检测其回收率应在50%～200%范围。

［结果］ 人凝血酶原复合物制品对鲎试验无干扰作用，动态浊度法定量检测结果与家兔实验结果基本一致。

［结论］ 应用本方法定量测定人凝血酶原复合物制品中细菌内毒素含量是可行的。

关键词： 人凝血酶原复合物； 细菌内毒素； 动态浊度法； 鲎试验

中图分类号： TQ 460.7+2 文献标志码： B

Kinetic turbidmetric limulus test for quantative determination of bacterial endotoxin in human prothrombin complex

SHENG Fengxian，WANG Huizhi，ZHANG Youjie（Shanghai Xinxing Medicine Co.Ltd., Shanghai 200135,China）

Abstract: ［Objective］ To determine bacterial endotoxin quantitatively in human prothrombin complex by kinetic turbidimetric limulus test.

［Methods］ The validation was investigated, when the amount of endotoxin spiked in the sample were recovered within the range 50%-200%.

［Results］ Human prothrombin complex did not interfere in limulus test. The result by kinetic turbidimetric limulus test was consistent with that of the rabbit pyrogen test.

［Conclusion］ The kinetic turbidimetric limulus test is suitable for quantitative determination of endotoxin in human prothrombin complex.

Key words: Human prothrombin complex； Bacterial endotoxin； Kinetic turbidimetric； Limulus test

人凝血酶原复合物临床上主要用于治疗先天性和获得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏症[1-2]。依据2010年版《中国药典》三部规定，人凝血酶原复合物制品中热原检查是采用家兔法，但此法操作繁琐，时间长且费用高，不适用于制品的生产过程控制和成品的大规模热原检测，故需建立一种快速测定的方法，用于人凝血酶原复合物生产过程中细菌内毒素含量的控制。笔者参阅了有关文献[3-4]，初步建立了动态浊度法定量测定人凝血酶原复合物制品中细菌内毒素含量的方法。

1 材料与方法

1.1 样品和仪器

人凝血酶原复合物（批号为20110610、20110711、20110712、20110713、20110714、20110815、20110816、20110919、 Test1、Test2、Test3，规格为300 IU/瓶)；细菌内毒素检查用水（批号为1010130，规格为5 mL/支，湛江安度斯生物有限公司）；动态浊度法鲎试剂（批号为1010142，规格为1.25 mL/支，λ=0.03 EU/mL，湛江安度斯生物有限公司）；细菌内毒素工作标准品（批号为150601-201071，规格为90 EU/ 支，中国药品生物制品检定所）。Bioprobe—2002型细菌内毒素测定仪，XW-80A型旋涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细菌内毒素限值（L）的确定 采用公式为：L=K/M，式中K为规定的给药途径，人每千克质量每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5 EU/(kg.h)；M为每千克质量每小时的最大给药剂量为30 IU/(kg.h)。计算得样品的内毒素限值L为0.167 EU/IU。

1.2.2 标准曲线制备及可靠性试验 用细菌内毒素检查用水(BET)水1 mL溶解细菌内毒素工作标准品，置漩涡混合器上混合15 min，然后逐级稀释（每步不超过10倍）至最终细菌内毒素浓度分别为2.00、0.25、0.03125 EU/mL,3个标准品溶液各取0.10 mL，分别加到预先加有0.10 mL动态浊度法鲎试剂的试管内，混匀，立即插入Bioprobe—2002型细菌内毒素测定仪内，37℃1 h自动检测，每个浓度重复3管，并同时做阴性对照2管。

1.2.3 干扰实验

① 样品最大稀释倍数计算:公式为MVD=LC/λ1，式中λ1为动态浊度法标准曲线中最低点细菌内毒素浓度0.03125 EU/mL；L为供试品的细菌内毒素限值0.167 EU/IU；C为10 IU/mL。计算得人凝血酶原复合物最大有效稀释倍数MVD为53倍。

② 样品溶液配制及干扰实验:取人凝血酶原复合物样品（批号为20110610，规格为300 IU/mL）用30 mL水复溶，然后用BET水稀释为5、10、20、40、50倍溶液，作为样品溶液，记为Ai液。同时进行同样倍数稀释，但在稀释液中添加浓度为0.25 EU/mL或0.50 EU/mL的细菌内毒素标准品，作为内毒素阳性对照管，记为Bi液。分别吸取上述各液0.10 mL，加入预先加有0.10 mL动态浊度法鲎试剂(TAL)的试管内混匀，立即插入Bioprobe—2002型细菌内毒素测定仪内自动检测，每个浓度重复3管，计算回收率。回收率（%）=（Bi液内毒素值-Ai液内毒素值）/添加内毒素浓度λ×100%。