出口海水网箱养殖鱼类病害调查研究

摘要：为了提高海水养殖鱼类品质、规范养殖生产、减少养殖自身污染、保障鱼类食用安全和出口质量，本文作者开展了“出口海水网箱养殖鱼类的病害研究及防治对策”项目的研究。对浙江省台州海域8个养殖区域进行实地调查，及时取样，实验与分析相结合的方法，通过各县水产技术推广站每年提供的数据等获取流行病学资料，按流行病学统计方法进行资料分析和处理。结果显示，海水网箱养殖鱼类细菌性病害仍是危害养殖生产的最常见、影响最大、经济损失最严重的病害。为此，本文作者以浙江省地方标准(DB／T5682005)“深水网箱无公害鱼类养殖技术规范”为依据，结合台州海区潮流、岛礁海湾屏障条件、海水网箱类型以及排列方式，本文作者设计了通用性的、生态性的、调控性的海水鱼类健康养殖技术模式及其操作规范，以期达到对养殖鱼类病害实行综合防控，保障海水网箱养殖鱼类的质量安全。

关键词：养殖鱼类；病害调查；综合防控

中图分类号：S941　文献标识码：A　文章编号：1674－0432(2011)－05－0309－3

为了提高海水养殖鱼类品质、规范养殖生产、减少养殖自身污染、保障鱼类食用安全和出口质量，本文作者开展了出口海水网箱养殖鱼类的病害调查研究。对浙江省台州海域8个养殖区域(其中玉环5个、温岭2个、乐清1个)进行周年实地调查，及时取样，实验与分析相结合的方法，通过相关县市水产技术推广站每年提供的数据等获取流行病学资料，按流行病学统计方法进行资料分析和处理。结果显示，海水网箱养殖鱼类细菌性病害仍是危害养殖生产的最常见、影响最大、经济损失最严重的病害。

1　实验对象和方法

1.1实验对象

以鲈鱼、美国红鱼、黑鲷、真鲷等主要品种为调查实验对象。分4个不同季节对8个养殖区域随机抽样检测分析。

1.2常规检测方法

肉眼观察：主要观察鱼类外观症状如长短、粗细、体形，体表及鳍条有否破溃、附着物、缺损、充出血、肿块；鳃盖有否肿大，是否红肿等。解剖检查：将鱼置于白搪瓷盘中从排泄孔处解剖，检查各脏器；打开鳃盖，检查鳃部。显微镜检查：体表刮取少量粘液置于载玻片上，加滴蒸馏水，盖上盖玻片制成水封片于显微镜下镜检；用剪刀剪取部分鳃丝做成水封片镜检；剪开肠管，刮取前中后肠壁上的粘液和内容物做成水封片镜检；剪取少量后。肾组织做成水封片镜检。细菌培养纯化和药物敏感试验：在无菌状态下剪取病鳗体组织，接种于选择性细菌培养基上(如糊精品红培养基、RS培养基、AOA培养基)，适当温度下培养并纯化，用于药物敏感试验。

1.3快速检测手段

1.3.1血清学凝集反应在一定的电解质存在下，抗原吸附其相应抗体而发生凝集块的过程。多种凝集技术已应用于鱼类的细菌病诊断。凝集反应的灵敏度虽然低一些，但速度快，几小时即可获得结果，不仅适用于实验室，也可用于养殖场实地诊断。以(Yoshimizu pokimura，1985)协同凝集反应技术为例：①配制抗体致敏葡萄球菌(sensitizel staphylococuil)；②取病鱼肝、肾或病灶组织，加4 9滴PBS液，匀浆；③经4000r／min离心后，取上清液；④在玻片上加1滴组织上清液，1滴抗体致敏的葡萄球菌悬液，混匀后置于湿盒内反应30－90min；⑤肉眼或低倍显微镜检查结果，凝集反应阳性则表示组织内含有抗体相应的病原。

1.3.2免疫荧光抗体技术采用荧光色素标记免疫球蛋白，抗体与荧光色素经化学偶合后，仍然保持其免疫学反应特性，荧光标记的抗体，能鉴定组织涂片的病原体，不需从病鱼中分离病原。以Rogers 1981年鉴别E.i ctaluri为例，简述其方法：①从病鱼肝、肾或病灶取一小块组织，在玻片上涂片，晾干，60℃微热固定；②加几滴免抗E.ictaluri血清于玻片上，于室温5min，最好放置在一避光潮湿的容器内；③用PH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗；④加几滴异硫氰酸荧光素标记的羊抗免IgG放置5min；⑤用PBS冲洗、晾干；⑥加1滴封闭液，覆上盖玻片，在荧光显微镜下检查。如在涂片的不同部位，显现苹果绿颜色荧光即表示存在E.ictaluri病原。

1.3.3免疫酶标吸附试验(ELISA)方法与荧光标记抗体诊断法类似，采用酶标记抗体作为示踪抗体。酶联免疫吸附检测方法：多采用13cm×8cm的96孔微量酶标板，它可检测鱼体组织内的病原体，亦可检测其血清中相应的抗体水平，以推断鱼体是否感染过病原菌。以Adams等(1990)诊断A.salmonicida为例，简述该方法：①加100μ1抗A.salmonicida血清缓冲液(每毫升缓冲液含5μg免疫球蛋白)到板孔内，塑料薄膜密封后放置过夜；②取出病鱼的肝脏，肾或病灶组织，加8倍磷酸缓冲液匀浆，取上清液；⑧加100μ1 0.25％酪蛋白封闭液到各孔，置1h；④倒去封闭液用吐温磷酸缓冲液冲洗2次；⑤加100μl组织上清液(含病原菌抗原)到检测孔，设阳性与阴性对照，亦可稀释抗原作抗原定量分析，薄膜密封后置lh；⑥倒去孔内溶液，用PBSTween溶液冲洗3次；⑦加100μ1酶标记的抗A.salmonicida免疫球蛋白缓冲液(1：1000稀释在磷酸缓冲液)，薄膜密封后在室温下置1h；⑧倒去孔内溶液，用PBS Tween溶液冲洗3次；⑨加100μ1显色液置20 60min或显示合适的颜色为止，加100μ10.4m01／1NaOH停止显色，比较检测孔和对照孔，记录结果即可。

1.3.4 PCR,快速检测技术DNA链扩增反应(Polymerase ChainReaction，PCR)是八十年代末发展起来的一项极具应用潜力技术，已经广泛应用于分子生物学研究以及病原的检测和疾病诊断。其原理是根据已知的病原微生物核酸序列设计出一对特异引物，在含有DNA聚合酶和底物条件下进行DNA体外扩增反应，由于使用了耐热DNA聚合酶，扩增反应可以反复进行，通过20－30个循环可将被检测对象扩增数百万倍。通过电泳或其他方法观察、分析，即可判断结果。Pollard等(1990)设计了一对20bp的寡核苷酸引物，用来检测嗜水气单胞菌aer基因。样品经过PCR扩增后，仅对产β溶血毒素的嗜水气单胞菌产生特异反应，而温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维隆气单胞菌等不含aer基因的气单胞菌，均为阴性反应，检测结果：准确率为100％，敏感度为1ng，真可谓灵敏、准确。

2　结果与分析

从全年4季节随机抽样的4个不同品种的检测结果分析，夏季养殖鱼类均被检出有细菌，弧菌、发光杆菌、巴斯德菌等为主的病原细菌易引发病害的发生或爆发，应引起高度重视。春冬季节基本未被检出细菌，依据病害调查该时期亦不是病害的高发时期。然而，有检出异尖线虫，美国红鱼和真鲷的检出率最高，异尖线虫数量亦是最多，这将影响鱼类出口的检疫，应引起特别重

视。

2.1主要病原体分析及药物试验报告

根据病原体检测结果，本研究周期主要检出异尖线虫和细菌2类病原体。

2.1.1寄生虫类异尖线虫

危害和影响：

①由于寄生吸收鱼体的营养而致养殖鱼类发病、死亡，严重时可并发细菌性疾病而造成大面积的病害，影响鱼类成活率及经济效益。

②影响养殖鱼类的商品外观和品质，尤其是出口养殖鱼类，严重时影响出口销售，且一旦大量发现可能增加出口检疫程序，从而影响出口创汇。

③喜食生鲜海鱼和烹调不当的消费者食用后造成寄生虫感染而出现各种症状，如胃肠不适、腹部剧痛、恶心、呕吐和腹泻等，严重时可并发其他疾病。

因目前还未有药物可直接杀死鱼类体内的异尖线虫，故应从环境治理和切断病原体入手，同时增强养殖鱼类的体质。

预防措施：

①合理布局，改善环境。从检出鱼来源分析，主要是养殖年份较长和养殖密度较高的海区。因此要着重对养殖渔排进行改造和布局的调整，以力求改善养殖环境，减少寄生虫滋生的温床，即减少渔排数量、增大网箱规格、加大渔排间距、实行海区轮养等。

②合理选用饲料品种。饲料种类直接影响养殖鱼类的体质和寄生虫的感染率。因此最好的投喂饲料首选为质量较好的配合饲料，在目前还没有质量完好的且养殖单位没有完全接受配合饲料的情况下，宜选用新鲜的小鱼虾，以选用非肉食性的鲐鲣鱼(即青鲇鱼)为佳，而肉食性的小杂鱼(尤其是近海捕捞的白姑鱼、龙头鱼等)相对寄生的寄生虫多些。

③严格处理，切除病原。除配合饲料外，投喂的饲料应进行适当的处理，尤其是病害流行季节，以减少病原的传播。常用的杀灭方法有：一是将饲料鱼进行冷冻处理，即在-20℃的温度下冷冻24h或-4℃冷冻5d以上，可杀死寄生虫；二是将饲料用消毒剂或杀虫剂进行浸泡或喷洒。也可采用熟化的方法。

④防治结合，消灭病害。根据寄生虫发病的流行季节，每年在发病前的半个月至一个月按照寄生虫预防和防治方法，每隔10－15d对养殖鱼类进行预防，减少寄生虫病爆发的可能性，同时在发病期进行寄生虫和细菌性疾病的综合防治。

⑤严格检疫，谨慎出口。养殖鱼类出口前尤其是在发病或流行季节，要仔细检查养殖鱼类是否患有寄生虫病或其他疾病，一旦发现应进行及时治疗，痊愈后方可出口。以免对方在检疫或使用时发现寄生虫而采取的制裁。

2.1.2细菌本研究周期检出的细菌种类有溶藻弧菌，可信度99.4％；美人鱼发光杆菌，可信度96.2％；侵肺巴斯德菌，可信度46.2％；人苍白杆菌，可信度36.2％。可见，溶藻弧菌和美人鱼发光杆菌可信度较高，尤其是溶藻弧菌。溶藻弧菌等弧菌属细菌都是海水养殖环境中的常见菌群，也是海水养殖中最主要的条件致病菌。人工感染试验结果证实试验菌株有致病性，反映养殖水环境中的常见菌群尤其是弧菌一旦进入鱼体会引起感染发病。

2.1.3作者选取溶藻孤茵为代表进行了药物试验，现将结果报告如下

药敏实验：用纸片法对溶藻弧菌进行了药物敏感性实验，结果见表1。在所试的20种化学疗剂中，有12种对病原菌具有明显抑制作用，另外8种对病原菌无抑制作用。有效药物中以复方新诺敏、磺胺+TMP、庆大霉素等3种药物的抑菌作用较强，可以作为防治海水网箱养殖鱼类弧菌病的药物。妥布霉素、多粘菌素等次之，而以前水产养殖中常用的四环素、磺胺甲基异嗯唑等对此病原菌无抑菌作用或不明显，提示病原菌对其可能具有抗性，不适合作为鱼类弧菌病的防治药物。

MIC和MBC值测定：从药敏实验所得结果中选择了3种抗菌能力较好的药物采用两倍稀释法对溶藻弧菌作MIC、MBC值测定，试验结果如表2所示。从表2中可以看出不同药物对溶藻弧菌的MIC值和MBC值各不相同，其中以复方新诺敏的作用效果最明显，分别为1.96μg／cm3和3.92μg／cm3。

表2试验药物对溶藻弧菌的MIC值及MBC值

药敏实验结果表明，所分离的溶藻弧菌对复方新诺敏、磺胺+TMP、庆大霉素等3种药物较为敏感，可作为预防和治疗鱼类弧菌性疾病的药物。根据药物敏感实验结果，选择抑菌作用较强的这3种抗菌药物进行了最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定。结果表明，复方新诺明的MIC值最小，磺胺+TMP次之，庆大霉素最高。这与药敏实验的结果一致。在实际应用中，可参照药物敏感性试验结果，从中选取最佳药物，迅速控制和预防疾病的发生。

3　小结与讨论

海水网箱养殖鱼类是台州海域养殖生产出口创汇的主要途径，尤以鲈鱼、美国红鱼、黑鲷、真鲷等为主要品种。因此，加强对出口创汇品种的疾病检测和病害防控技术研究，是提高海水养殖鱼类品质、确保食品安全和国际市场竞争力、维护消费者利益、保障顺利出口的最根本要求。定期对鲈鱼、美国红鱼、黑鲷、真鲷等出口海水网箱养殖鱼类进行了病原体的检测和分析，达到以防为主，防治结合。从各批次的检测结果分析，夏季养殖鱼类均被检出有细菌，弧菌、发光杆菌、巴斯德菌等为主的病原细菌易引发病害的发生或爆发，应引起高度重视。春冬季节基本未被检出细菌，依据病害调查该时期亦不是病害的高发时期。然而，有检出异尖线虫，美国红鱼和真鲷的检出率最高，异尖线虫数量亦是最多，这将影响鱼类出口的检疫，应引起特别重视。以浙江省地方标准(DB／T568 2005)“深水网箱无公害鱼类养殖技术规范”为依据，结合台州海区潮流、岛礁海湾屏障条件、海水网箱类型以及排列方式，设计了通用性的、生态性的、调控性的海水鱼类健康养殖技术模式及其操作规范，以期达到对养殖鱼类病害实行综合防控，保障海水网箱养殖鱼类的质量安全。