不同剂量刀豆蛋白A腹腔注射诱导昆明小鼠肝纤维化的效果观察

【摘要】 目的 观察不同剂量刀豆蛋白A(Con A)诱导昆明小鼠肝纤维化的效果，探讨其最佳剂量及成模时间。方法 昆明小鼠96只，随机分为低剂量ConA组(A组)、中剂量Con A组(B组)、高剂量Con A组(C组)及正常对照组（N组），每组24只，分别经腹腔注射Con A-PBS溶液15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg及PBS溶液，每周一次。于注射6、7、8、9周后分批处死各组昆明小鼠6只，测ALT、AST，肝脏作病理学检查。结果 实验组ALT、AST一直明显增高，B组第8周出现典型的肝纤维化病理改变，且无动物死亡。结论 20mg/kg Con A腹腔注射是合适的剂量，每周1次，注射8次可建立肝纤维化动物模型。

【关键词】 肝纤维化；动物模型；刀豆蛋白A

合适的动物模型是研究肝纤维化的重要工具，我们已经采用Con A进行反复腹腔注射的方式成功建立昆明小鼠肝纤维化模型［1］，此次期望通过改进和完善找到最佳剂量和成模时间，使之成为简便、价廉、可重复性好的动物模型。1 材料与方法

1.1 实验动物 ①实验动物：昆明小鼠96只，体重在18-22g，由江苏大学动物实验中心提供，均适应环境一周后开始实验；②主要试剂：Con A购于sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 昆明小鼠96只，随机平均分为4组，每组24只：低剂量Con A组(A组)、中剂量Con A组(B组)、高剂量Con A组(C组)和正常对照组（N组）。

1.2.2 动物的处理 A组、B组、C组及N组分别经腹腔注射Con A溶液15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg及PBS溶液，每周一次。于注射6、7、8、9周后（注射后24h）分批摘除小鼠眼球取血，将取血后的小鼠颈椎脱臼处死，取出肝脏，每组6只。

1.2.3 观察指标及检测 ①血浆ALT、AST：小鼠摘除眼球取血，采用全自动生化仪测定ALT及AST。②病理学检查：HE染色肝组织常规病理，Masson胶原染色，半定量计分系统(SSS)评估纤维化程度。

1.3 统计学处理 所有计量资料用χ±s表示，采SPSS17.0.统计分析软件进行数据处理，P

2.1 实验动物安全性 N组、A组未发现动物明显不良反应；B组有1只小鼠在第1次注射后出现呼吸急促及躁动，自行缓解；C组有2只小鼠死亡，分别为第1次及第2次注射后数分钟内出现皮肤明显紫绀，呼吸急促及躁动，并最终死亡。

2.2 小鼠ALT、AST检测结果 在注射不同剂量的ConA后6-9周，A、B、C组的ALT、AST相对稳定，且明显高于N组（PALT，见表1、2。

表1 各组小鼠血清ALT水平变化（u/l）

n 6周 7周 8周 9周

N 6 39.00±5.48 41.67±6.19 40.17±5.71 39.33±4.63

A 6 182.83±35.28 175.00±12.98 174.67±15.86 170.33±14.80

B 6 230.17±40.70* 209.83±25.36# 198.33±16.27# 194.50±19.15#

C 4 308.75±55.60# 261.25±32.45# 259.50±9.75 237.25±24.60#

注：A、B、C组分别与N组比较：P0.05，#P

表2 小鼠血清AST水平变化（u/l）

n 6周 7周 8周 9周

N组 6 53.50±5.47 52.67±7.69 51.50±7.31 53.67±9.18

A组 6 141.50±17.22 155.00±20.31 149.00±14.89 153.00±13.30

B组 6 294.67±66.82 315.50±37.73 322.50±54.71 330.50±57.50

C组 4 628.25±75.79 630.00±52.78 631.00±38.88 636.00±30.82

注：A、B、C组分别与N组比较：P

2.3 病理组织学观察。

正常对照组（HE） ConA 20mg/8周（HE）

正常对照组（Masson） ConA 20mg/8周（Masson）

HE染色：N组小鼠HE染色镜下肝小叶结构正常，汇管区无纤维组织增生和炎细胞浸润。A组第9周、B组第8周、C组第7周出现典型的肝纤维化改变：变性肝细胞数目减少，正常肝细胞明显减少，再生肝细胞更多，近半数肝小叶破坏、结构紊乱。

Masson胶原染色：N组小鼠仅在中央静脉及肝窦内有轻微的胶原纤维分布；A组第9周、B组第8周、C组第7周可见近半数中央静脉外周有小纤维性条索形成，向外周延伸。A、B、C组随注射ConA剂量的增加，肝纤维化半定量计分增高，肝纤维化半定量计分，见表3。A、B、C各组随注射ConA时间的延长，肝纤维化半定量计分逐渐增高，有明显的相关性（A组r=0.946、P

表3 各组肝纤维化半定量计分

n 6周 7周 8周 9周

N组 6 0.83±0.41 0.83±0.41 0.83±0.41 0.83±0.41

A组 6 1.33±0.52# 2.17±0.75* 4.67±0.82* 7.50±0.55*

B组 6 2.00±0.63# 4.83±0.75* 7.33±0.82* 10.33±1.03*

C组 4 4.25±0.50* 7.50±0.58* 10.25±1.26* 12.25±1.71#

注：A组与N组比较：*P0.05；B、C组分别与N组比较：P

合适的动物模型是研究肝纤维化的重要工具。我国培育的昆明小鼠价廉，易饲养，抗病力强。腹腔注射具有作简便快速，动物痛苦小的优点。Con A为单组分药物，反复注射Con A可以诱导肝细胞慢性损伤，持续激活HSC，而发生肝纤维化，这与HBV致肝纤维化的发病机制类似［2］。

反复肝损伤可以激活肝星状细胞，最终导致肝纤维化。作为肝细胞损伤较为敏感的检测指标，当肝细胞严重损伤时AST的释放多于ALT，ALT、AST的比值指示肝脏疾病的进程［3］。实验中，各剂量组的AST、ALT明显高于正常组，剂量越大，ALT、AST越高，且AST更为明显，而在中剂量及高剂量组，AST>ALT，说明ConA剂量越大，对肝细胞损伤严重，这与以往文献报道一致［4］，同时证实了反复注射Con A引起的肝损伤，与人类慢乙肝反复肝损、最终形成肝纤维化的过程相似［5］。

确诊肝纤维化的金标准是病理学检查，我们发现A组第9周、B组第8周、C组第7周出现典型肝纤维化病理表现，另外，在本实验中病理切片可见淋巴细胞浸润，与人肝炎肝纤维化病理切片表现相近，这是其他动物模型少有的［6］。肝纤维化半定量计分系统(SSS)是2002年由中华肝脏病学会肝纤维化学组提出的，它代表的是病变的相对严重程度［7］，各剂量Con A组的肝纤维化半定量计分与病理检查结果一致，通过各组肝纤维化半定量计分分析发现，同周次Con A剂量越大，计分越高；同一剂量，时间越长，计分越高，且有显著相关，提示Con A诱导小鼠肝纤维化具有剂量及时间依赖性。

在实验过程中，A组未发现动物明显不良反应，第9周出现典型肝纤维化表现；B组虽有1只小鼠出现不良反应，但未出现动物死亡，第8周出现典型肝纤维化表现；C组虽在第7周即出现典型肝纤维化表现，但有2只小鼠死亡，为注射后随即出现皮肤黏膜明显紫绀，呼吸急促，最终死亡，故考虑可能为过敏所致。

总之，采用Con A反复腹腔注射昆明小鼠，可成功建立肝纤维化模型，具有简便、价廉、可重复性好的优点，其血清学及病理改变与HBV引起肝损伤类似；对比3种不同剂量的Con A组，A组周期长，C组虽成功建立模型，但出现动物死亡，B组建模成功率高，每只小鼠均出较典型的肝纤维化。可以认为20mg/kg为最佳剂量，腹腔注射8周较为合适。

参考文献

［1］ 张炜，陈明.腹腔注射刀豆蛋白A诱导小鼠肝纤维化模型的建立［J］.免疫学杂志.2007，23(6)：687-690.

［2］ 李鸿立，田聆，魏于全，等.刀豆素蛋白A诱导小鼠肝纤维化模型的建立［J］.免疫学杂志，2004，20：390.

［3］ 李映菊，汪煜华，刘玉美，等.白屈菜红碱对肝维化大鼠肝脏病理学和肝脏脯氨酸含量的影响［J］.实用肝脏病杂志，2009，12(3)：167-170.

［4］ 曲建慧，张修礼.Con A性小鼠肝损伤模型的研究及应用［J］.世界华人消化杂志，2001，6(3)：180-181.

［5］ 张炜，陈明，傅涓涓.不同剂量刀豆蛋白A诱导Balb/c小鼠肝纤维化的量效关系［J］.徐州医学院学报，2007，27（6）：375-378.

［6］ 朱世能.肝脏组织和细胞病理学概要［M］//姚光弼.临床肝脏病学.上海：上海科学技术出版社，2004：119-120.

［7］ 中华肝脏病学会肝纤维化学组.肝纤维化诊断及疗效评估共识［J］.中华肝脏病杂志，2002，10(5)：327-328.