不同基原虫草的成分比较及其对人胚胎成纤维细胞抗纤维化作用的初步研究お

[摘要]该研究以尿苷、腺苷、虫草素为主要评价指标，采用高效液相、液质联用等色谱方法，对6种不同基原的10个虫草样品的虫体/草体/全体进行高效液相/液质联用的测定和比对；并利用TGFβ1诱导人胚胎成纤维细胞CCCESF1建立体外细胞外基质聚集模型，观察不同基原虫草提取物的抗纤维化活性。实验结果显示，不同基原子实体和菌丝成分数量上基本相同，但是各成分的含量分布具有明显的差异；不同基原的虫草提取物中，体外抗纤维化活性结果为：虫草花>蝉虫草（金蝉花）>桑蚕蛹虫草>柞蚕蛹虫草>天然冬虫夏草。该研究结果为找寻天然冬虫夏草的人工替代品提供了科学的参考和依据。

[关键词]不同基原； 虫草； 人胚胎成纤维细胞； 抗纤维化活性

冬虫夏草Cordyceps sinensis是我国传统名贵滋补中药材之一，其营养成分高于人参，可入药，也可食用，具有很高的营养价值。冬虫夏草可以增强机体的免疫力，滋补肺肾，对肺癌、肝癌等有明显的抑制作用。在临床上对肺虚久咳、气喘、肺结核咯血、盗汗、肾虚腰膝酸痛、阳痿遗精、神经衰弱及化疗、放疗后的红细胞下降都有疗效。然而，由于自然条件的限制，资源紧缺，价格昂贵。为满足市场的需求，人们积极的找寻天然冬虫夏草的替代产品，如蛹虫草（又名北虫草、北冬虫夏草）子实体为麦角菌科虫草属真菌蛹草菌Cmilitaris （L） Link 的干燥子座，是虫草属的模式种，也是与冬虫夏草极为相似的种[1]。研究结果表明，蛹虫草子实体的活性成分与野生冬虫夏草类似，含有虫草素、腺苷、腺嘌呤、虫草酸、虫草多糖等[23]。其中虫草素和腺苷更被认为是虫草的主要活性成分[4]，虫草素具有抗病毒和肿瘤等作用[5]，腺苷具有改善心脑血液循环的作用[6]。目前人工培育的蛹虫草以柞蚕蛹虫草为主，此外还有桑蚕蛹虫草，以及人工培养基培育的虫草花和虫草菌丝体。桑蚕蛹虫草是采用蛹虫草菌通过人工接种在活的桑蚕蛹体上人工培养的子座；虫草花是采用蛹虫草菌接种在以大米、玉米等固体培养基上人工培养的子座；虫草菌丝体是从天然冬虫夏草提取菌株，然后在大容积的液体培养基里进行接种、培养、发酵得到的发酵产物。此外还有产于大别山区的蝉虫草（金蝉花），也在民间广泛使用。

现代研究表明[79]，各种虫草替代品均含有较为接近的活性成分，因此被认为有着相似的保健功效。但不同基原虫草的全面成分和生物活性的比较研究，尤其是天然虫草与蛹虫草的子实体和菌丝中成分的比较研究还比较欠缺。

本课题组全面收集不同基原的虫草样品，包括：天然冬虫夏草、柞蚕蛹虫草、桑蚕蛹虫草、蝉虫草以及不同培养基培育的虫草花样品，利用高效液相色谱法建立并比对了虫体和草体的成分分布情况；取其中代表性样品进行提取，利用高效液相三重四级杆质谱联用技术对提取物成分进行了鉴定分析，选择虫草的主要药效活性之一――抗纤维化作用作为药效筛选指标，利用TGFβ1诱导人胚胎皮肤成纤维细胞CCCESF1建立细胞外基质聚集模型，对各个提取物进行了体外抗纤维化活性筛选。比较不同基原不同提取方法样品的成分与功效之间的关联性。为找寻天然虫草的最佳替代品，阐明成分与功效之间的关系，提供了理论依据。

1 材料

本实验采集不同基原及产地的虫草样品，所有样本均经过中国中医科学院中药研究所生物技术中心进行基因条形码鉴定认证，见表 1。

人胚胎成纤维细胞CCCESF1购自国家细胞资源平台，于 DMEM 培养基（含10% 胎牛血清） 中培养传代。

腺苷（国家食品药品检定研究院，纯度≥98%，编号1.10879200202）；酪氨酸（国家食品药品检定研究院，编号1.4062.4.200805）；尿苷（北京赛百草科技有限公司，纯度≥98%，SN201.3080407）；虫草素（纯度≥98%，由杨立新老师提供，用于定性鉴别）。

甲醇，色谱级（Fisher公司）；DMEM高糖培养基（Gibco公司）；胎牛血清 （FCS） （SigmaAldrich 公司）；ITS （insulintransferinselenium） （SigmaAldrich 公司）；PBS（phosphate buffer solution） （Gibco 公司）；005%胰蛋白酶消化液 （Gibco 公司）；人重组TGFβ1 （R&D Systems Europe公司）；天狼星红染料 （PSR） （SigmaAldrich 公司）；COLI 包被96 孔细胞培养板（BD bioscience公司）。

KQ2.50B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TAISITE DFD700 电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SL20ADAD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；双压线性离子阱串联高分辨质谱Orbitrap Velos Pro （Thermo Fisher 公司）；戴安 Ultimate3000 超高效液相色谱仪；Varioskan Flash 多功能酶标仪。梅特勒ML104 1/1万分析天平；色谱柱安谱 CNW C1.8WP （4.6 mm×2.50 mm，5 μm）。

2方法

2.1 虫草成分分布的HPLC测定

2.1.1 色谱条件[10]色谱柱为安谱 CNW C1.8WP （4.6 mm×2.50 mm，5 μm）；甲醇（A）水（B），梯度洗脱，见表2；检测波长为2.60 nm；柱温为3.5 ℃；流速1 mL・min-1。理论板数按腺苷峰计算应不低于6 000，见图1。

A酪氨酸； B尿苷； C腺苷； D虫草素。

2.1.2对照品及供试品溶液的制备及测定①对照品溶液的制备：取腺苷、尿苷对照品适量，分别精密称定，腺苷和尿苷均为 40 mg・L-1的溶液，即得。虫草素样品同样配制成40 mg・L-1的溶液，用于定性。②供试品溶液制备：将天然虫草、蛹虫草和蝉虫草样品的虫体和草体剥离，分别粉碎过60目筛。取上述样品08 g，精密称定，置50 mL量瓶中加水4.5 mL，超声处理（功率2.50 W，频率40 kHz）4.5 min使溶解，放冷，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。③测定法：分别精密吸取参照物溶液5 μL与供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2虫草样品成分及抗纤维化活性关联性评价

2.2.1供试样品取上述1，3，6～8号虫草样品，分别粉碎过60目筛。分2种方法进行提取：① 超声提取，精密称定样品粉末08 g，置100 mL锥型瓶中，加水50 mL，超声处理（功率2.50 W，频率40 kHz）4.5 min，放冷，滤过，取续滤液，冻干，即得。②加热提取，精密称定样品粉末08 g，置100 mL锥型瓶中，加水50 mL，100 ℃水浴提取1 h，放冷，滤过，取续滤液，冻干，即得。结果见表3。

将上述虫草提取物冻干样品分别取5 mg加水配制成1 g・L-1的样品溶液， HPLC和LCMS进行分析。

2.22HPLC条件同3.1.1。

2.2.3LCMS条件①色谱条件：色谱柱Thermo Hypersil BDS C1.8柱（2.1 mm×1.50 mm，2.4 μm）；柱温30 ℃；样品盘温度4 ℃；流动相为A（01%甲酸）和B（乙腈），梯度洗脱0～30 min，98%～2% A；流速03 mL・min-1；进样体积2 μL。② 质谱条件：ESI源参数设定为正离子扫描模式，加热器温度为3.50 ℃，毛细管温度为3.50 ℃，毛细管电压为3.5 V，喷雾电压为3.5 kV，鞘气（N2）流速为3.5 arb，辅助气（N2）流速为10 arb；样品一级质谱在FT模式下进行全扫描（分辨率R为3万，m/z扫描范围1.50～1 000），二级及三级质谱采用数据依赖性扫描（data dependent scan）。数据采集和分析采用Xcalibur，Metworks和Mass Frontier 70软件。

2.2.4抗纤维化活性评价――天狼星红染色取对数生长的CCCESF1 细胞接种于96 孔培养板上，完全DMEM培养基培养4.8 h 至细胞铺满后，更换培养基为无血清DMEM（含1% ITS）。无血清培养4.8 h 后，向培养基中加入TGFβ1 （5 μg・L-1）和药物后，实验分组为空白对照组、 TGFβ1 对照组、药物作用组。继续处理4.8 h 后，吸去细胞上清，每孔加入200 μL 冰甲醇，-20 ℃固定过夜，PBS 清洗3 遍，每次10 min，加入01% PSR 溶液，孵育4 h。01% 冰醋酸清洗3 遍，每次10 min，自然风干。向每孔中加入005 mol・L-1 NaOH 溶液200 μL，振荡30 min 使充分溶解，酶标仪上选取波长5.40 nm 读取各孔光密度A。

2.3统计分析

数据结果均表示为±s。所有结果应用GraphPad Prism 60 软件进行统计分析。各组之间的参数比较采用Oneway ANOVA 检验。P

3结果

3.1虫草成分分布的HPLC测定

根据HPLC测定结果，可以发现：①在所有样品中，谱图峰数最少的是天然冬虫夏草和亚香棒虫草。几乎不含有虫草素，而且腺苷、尿苷成分的含量也较其他虫草样品低，见图 2；②虫体中几乎检测不到虫草素和N（2）羟基腺苷成分，见图 3；③腺苷、尿苷成分在桑蚕蛹虫草草体中含量最高，见图 4。

3.2虫草样品成分及抗纤维化活性关联性评价

3.2.1HPLC测定以及LCMS成分指认根据HPLC以及LCMS的测定结果，找出样品中7个特征峰，鉴定出峰1为酪氨酸，峰2为尿苷，峰5（S）为腺苷，峰6为虫草素；峰7为N（2）羟基腺苷。

1 酪氨酸； 2 尿苷；3，4 未鉴定出； 5（S） 腺苷； 6 虫草素； 7N（2）羟基腺苷（图5，表4同）。

以腺苷色谱峰作为参照峰（S）计算相对峰面积，结果见图3，5，6，表4。

3.2.2抗纤维化活性评价5 μg・L -1TGFβ1 显著诱导ECM 的生成，见图7，8，表5。虫草提取物CCTQ1，CCTQ5，CCTQ7，CCTQ10在2.5～100 mg・L -1时对ECM 的聚集均有不同程度的抑制作用。

与TGFβ1诱导组相比，*P

4讨论

冬虫夏草是我国名贵中药材。由于其生长条件苛刻，因此资源十分紧缺，寻找天然虫草的代用品具有重要的意义。

根据HPLC对不同基原虫草的虫体和草体成分的比较可以看到，在天然冬虫夏草中检出成分的种类及含量均低于人工培育的蛹虫草或虫草花，包括天然的蝉虫草；除天然冬虫夏草外，其他几种虫草含有的成分种类比较相似，但是各成分之间的比例差别很大，且没有规律可循。而在对虫草的虫体和草体成分的比较中发现，在2.60 nm下，虫体中能够检测到的成分种类多于草体。因此，从成分含量上面观察，现有的人工虫草均可以替代天然冬虫夏草。其中尤以桑蚕蛹虫草最佳。

已有的大量试验研究及临床病例研究证实，冬虫夏草对二甲基二硝胺诱导的肝纤维化、博莱霉素诱导的肺纤维化、糖尿病导致的肾纤维化有较好治疗效果。通过减少细胞外基质的聚集，增加细胞外基质的降解，降解过多Ⅳ型胶原，从而阻止器官纤维化，具有明显的抗纤维化作用[11]。因此，本研究选择抗纤维化作用作为药效指标，以此比对不同基原虫草的药效差异。

转化生长因子TGFβ1能诱导成纤维细胞细胞外基质（ECM）的合成和间质细胞增殖、运动、聚集和激活，是介导包括皮肤、肺、肾、肝、消化道、心脏和血管等多种组织器官纤维化的重要因子，可作为包括系统性硬皮病在内的多种纤维化疾病治疗的重要靶点[1.2.1.3]。本实验采用TGFβ1诱导人皮肤成纤维细胞CCCESF1分泌胶原蛋白，引起ECM大量聚集，使用天狼星红对ECM进行染色和定量分析；对虫草提取物的抗纤维化作用进行筛选。结果显示，人工虫草（包括蝉虫草）的抗纤维化作用均优于天然冬虫夏草。同时，通过对样品成分的分析及鉴定，可以发现天然冬虫夏草中几乎不含有虫草素和N（2）羟基腺苷。由此推测，虫草此2种成分，尤其是N（2）羟基腺苷可能具有较强的抗纤维化作用。

通过实验对比发现，加热提取样品的抗纤维化活性低于超声提取样品，同时通过高效液相分析，加热后各个样品的成分检出个数及含量均有所降低。说明对于虫草中抗纤维化的活性成分，超声提取优于热回流提取。在实验过程中还发现，几种具有抗纤维化活性虫草的作用表现不尽相同，其作用机制有必要进行进一步的深入研究。

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