肝纤维化不同证型与TGF-β1/Smad基因蛋白表达关系的实验研究

摘 要:目的:观察肝纤维化不同证型与TGF-β1/Smad基因蛋白的关系。方法:分别设立正常对照组、单纯肝纤维化组、肝纤维化肝郁脾虚证组和气虚血瘀证组,各模型组先用CCl4注射法复制肝硬化疾病模型,然后肝郁脾虚证组附加夹尾和大黄灌胃法、气虚血瘀证组附加游泳疲劳法,并以相应药物干预。采用免疫组化法测定肝组织TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3及Smad7水平,用比色法测定肝组织Smad3mRNA。结果:TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3和Smad7在模型对照组中表达明显增强,以肝纤维化气虚血瘀组最为显著,肝纤维化肝郁脾虚组和单纯肝纤维化组的表达面积和强度相似。各模型组Smad3mRNA呈上调表达,差异均具有十分显著的意义(P

关键词:肝纤维化;TGF-β1/Smad基因蛋白;肝郁脾虚;气虚血瘀

中图分类号:R2-03 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0023-06

Experimental Study on the Relations between the TGF-β1/Smad and Different TCM Syndromes of Liver Fibrosis

XU Shan,BAO Jianfeng,ZHOU Min,ZHANG Yongsheng

(Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,Zhejiang,China)

Abstract:Objective:To observe the relations between the TGF-β1/Smad and different TCM syndromes of liver fibrosis.Methods:All rats of model groups were treated by CCl4 to establish the liver fibrosis models. Besides CCl4, the rats of liver-stagnation and spleen-deficiency group were treated by stimulating tails with forceps clip and gastric infusion of rhubarb decoction, and the rats of qi-deficiency and blood-stasis group were treated by the method of swimming-fatigue. Then every group was intervened by the relevant medicine. After all treatments, the TGF-β1,TβR-Ⅰ,Smad2/3, Smad7 and Smad3mRNA of liver were examined.Results:The TGF-β1, TβR-Ⅰ, Smad2/3 , Smad7 and Smad3mRNA of model groups were expressed significantly(P

Key words:liver fibrosis;TGF-β1/Smad;liver-stagnation and spleen-deficiency;qi-deficiency and blood-stasis

肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理学基础,是发展至肝硬化的必经阶段,中医药在阻断和逆转肝纤维化方面取得了较好的效果,是防治肝硬化的研究热点。研究发现TGF-β1在肝纤维化的启动、进展乃至肝硬化的形成中发挥了重要作用[1-4],而近年Smad蛋白家族的发现,则从细胞内信号转导、细胞因子水平揭示了肝纤维化形成机制。因此研究TGF-β1/Smad基因蛋白的表达与肝纤维化及肝纤维化中医辨证分型的关系,将为中医治疗肝纤维化的作用机制和靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

清洁级雄性SD大鼠140只,体重(200±20)g(由浙江中医药大学实验动物中心提供),随机分为4组:正常对照组20只、单纯肝纤维化组30只、肝纤维化肝郁脾虚证组、肝纤维化气虚血瘀证组各45只。

1.2 主要药品及试剂

四氯化碳(上海凌峰化学试剂有限公司,批号:050322);橄榄油(国药集团化学试剂有限公司,批号:F20040614);大黄(浙江中医药大学第二门诊部)打粉,水浴浓缩为2g/mL,4℃冷藏备用;逍遥丸(杭州胡庆余堂药业有限公司,批号:20050101);扶正化瘀胶囊(上海黄海制药有限责任公司,批号:20050501);TGF-β1兔抗人多克隆抗体、TβR-Ⅰ兔抗人多克隆抗体(Santa Cruz公司,批号:SC398);Smad2/3兔抗人多克隆抗体、Smad7兔抗人多克隆抗体(武汉博士德生物技术公司,批号:BA1397);EnVisionIgG二抗(DAKO公司,批号:050-2);RNA提取试剂盒(上海申能生物有限公司提供,批号:20051009);逆转录试剂盒、扩增试剂盒(上海生物工程有限公司提供BBI公司产品,批号:20051108);引物(上海生物工程有限公司合成,批号:20060808);Tris(上海申能生物有限公司提供,批号:20051014);100bp DNA Ladder Marker(大连宝生物工程有限公司,批号:20060703)。

1.3 器材

隔水式电热恒温培养箱(PYX-DHS-35×40,上海),组织切片机(Leitz 1512型,上海),彩色病理分析系统(HPIAS-1000型,武汉),荧光显微镜摄像机(OLYMPUS BX60型,日本),TGL-16G型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂生产),DDL-5低速离心机(上海安亭科学仪器厂生产),PCR扩增仪(美国TECHNE公司),电泳仪(美国BIO-RAD公司),紫外分光光度计(美国BIO-RAD公司),紫外透射反射分析仪(上海嘉鹏科技有限公司),GIS凝胶图像处理系统(上海TANON科技有限公司实验)。

1.4 模型制备

1.4.1 单纯肝纤维化模型的建立[5] 将CCl4与橄榄油按4∶6比例配成40%油剂。按0.3mL/100g剂量皮下注射,2次/周。6周后据随机抽取大鼠10只处死,取肝组织行病理观察,按实验动物肝纤维化组织学Ⅵ级标准进行肝纤维化程度评判[6],示模型制备成功。治疗期间继续使用CCl4维持至实验结束。

1.4.2 中医病证结合模型的建立 在单纯肝纤维化造模的基础上,肝纤维化肝郁脾虚证组第4周始加用慢性夹尾激怒加高浓度大黄灌胃法造模,共2周,至出现肝郁脾虚的证候群[7];肝纤维化气虚血瘀组除用CCl4造模不变外,第4周始加用游泳疲劳试验,共2周[8-9]。6周后各组鼠处死10只,余下各组大鼠造模法(包括病证结合造模法)不变的情况下,予相应药物及生理盐水干预。

1.5 药物干预

药物用生理盐水溶解,肝纤维化肝郁脾虚证治疗组按0.95g/kg体重灌服逍遥丸,肝纤维化气虚血瘀证治疗组按0.48g/kg体重灌服及扶正化瘀胶囊,阴性对照组和单纯模型组全部以生理盐水2mL灌胃,以上干预均为1次/天,连续3周。

1.6 标本的采集和处理

干预结束后处死全部大鼠,处死前禁食12h,采用1%戊巴比妥按35mg/kg注射麻醉,剖开腹腔,取大鼠肝脏右叶,立即用10%中性磷酸缓冲液(PBS)福尔马林液中固定24h,余组织液氮冷冻备份。

1.7 指标检测

按说明书采用EnVision法[10]行免疫组织化学检测肝组织TGF-β1蛋白、TβR-Ⅰ蛋白、Smad2/3蛋白及Smad7蛋白水平。先在光镜下进行定性观察,染色以细胞浆、细胞膜或间质有棕黄色颗粒或线状沉积为阳性,否则为阴性。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。然后在400倍光镜下进行半定量检测,每张切片选取5个不同视野,要求每个视野包含一个汇管区和一个肝小叶或纤维间隔,用HPIAS1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统计算阳性面积百分比,取平均值。按说明书采用RT-PCR法测定Smad3mRNA水平。

1.8 统计学方法

数据采用SPSS 11.0统计分析软件处理。计量资料以均值±标准差(±s)表示,当方差齐时采用One-Way ANOVA单因素方差分析S-N-K检验,当方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。

2 结 果

2.1 中药干预前各组间比较

2.1.1 TGF-β1 TβR-Ⅰ Smad2/3和Smad7在肝脏的表达分布特点

TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3和Smad7在正常组大鼠肝组织中均呈低水平表达,在模型对照组中表达明显增强,以肝纤维化气虚血瘀组最为显著,肝纤维化肝郁脾虚组和单纯肝纤维化组的表达面积和强度相似。TGF-β1深棕色的强阳性表达部位主要在纤维间隔、汇管区,呈弥漫性,也存在于肝窦Dissee间隙,呈细条状;浅棕黄色弱阳性表达主要分布在间质和一部分肝细胞胞浆内,见图1～3。TβR-Ⅰ在纤维间隔、肝窦Dissee间隙、汇管区和中央静脉周围呈带状或片状深棕色强阳性表达,在肝细胞细胞膜,呈特征性的线状强阳性表达;另外,肝细胞细胞浆也有TβR-Ⅰ的弥漫性弱阳性表达,见图4～6。Smad2/3深棕色的强阳性表达主要分布于纤维间隔、汇管区和中央静脉周围成纤维细胞、窦周细胞、炎性细胞以及增生的胆小管周围梭状细胞内,呈点片状,分散不连续;浅棕黄色的较弱表达分布在肝窦Dissee间隙、肝细胞细胞浆和间质,见图7～9。Smad7深棕色的强阳性表达主要分布于纤维间隔、汇管区和中央静脉周围成纤维细胞、窦周细胞、炎性细胞以及增生的胆小管周围梭状细胞内,呈点片状,分散不连续;浅棕黄色的较弱表达分布在肝窦Dissee间隙、肝细胞细胞浆和间质,见图10～12。

2.1.2 各实验组肝组织TGF-β1 TβR-Ⅰ Smad2/3和Smad7蛋白表达的比较

分析结果见表1。

2.1.3 肝纤维化大鼠肝脏TGF-β1 TβR-Ⅰ Smad2/3 Smad7 肝纤维化程度之间相关性分析

(1)TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3、Smad7之间的相关性分析结果见表2。

(2)TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3、Smad7和肝纤维化程度之间的相关性分析结果见表3。

2.1.4 各实验组肝组织Smad3mRNA的比较

正常组、单纯肝纤维化组、肝郁脾虚组、气虚血瘀组肝组织总RNA提取物经紫外分光光度计检测260nm及280nm吸光度比值分别为1.81、1.85、1.83、1.93,均在1.8～2.0的正常值范围内。图13～14所示为各组β-actinmRNA、Smad3mRNA表达情况。

表4所见,与正常对照组相比,各模型组Smad3mRNA呈上调表达(P

2.2 中药干预后各组比较

2.2.1 TGF-β1 TβR-Ⅰ Smad2/3和Smad7在肝脏的表达分布特点

经延长3周造模后,单纯肝纤维化组、肝纤维化肝郁脾虚、气虚血瘀阴性对照组上述指标表达的面积和强度均增强,以气虚血瘀阴性对照组增强最明显(见图15～26)。

病证结合治疗组经相应药物治疗后上述指标表达的面积和强度均减弱(见图27～34)。

2.2.2 各实验组肝组织TGF-β1 TβR-Ⅰ Smad2/3和Smad7蛋白表达的比较

表5所示,9周时与正常对照组比较,各组TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3和Smad7表达的面积和强度均增强(P

3 讨 论

3.1 TGF-β1/Smad基因蛋白与肝纤维化的关系

TGFβ-Smad信号转导通路与肝纤维化的发生发展关系非常密切。本实验发现,各模型大鼠肝纤维化时肝脏TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3的表达明显高于正常组的表达,提示肝纤维化时TGF-β1信号转导异常活跃,TGF-β1信号转导体系在细胞外、细胞膜、细胞内3个层次均发生了巨大的变化,这种纵向体系整体的变化可能正是肝纤维化发生发展的更深层次的原因。另外,免疫组化定位研究显示,TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3的表达位置有一定同一性,它们在正常组均弱表达在肝窦Dissee间隙、汇管区和中央静脉周围细胞,肝细胞中未见表达,提示上述3种蛋白分子都参与了正常肝脏的生理活动,而且主要作用部位在非实质细胞而非肝细胞;在模型组,TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3三者在纤维间隔、汇管区和中央静脉周围都有强阳性表达,而在肝细胞胞浆内均有弥漫的弱阳性表达,提示肝纤维化时ECM中以HSC为主要细胞的细胞群TGF-β1的信号转导剧烈而活跃进行,是推动肝纤维化进展的主要动力,而且肝细胞本身也存在TGF-β1的信号转导,在肝纤维化过程中发挥着一定的促进作用。目前认为,TGF-β1对HSC的作用信号主要通过其受体和下游信号分子Smads蛋白转导,其中以Smad3为代表的R-SMAD分子传递的可能是致肝纤维化信号,以Smad7为代表的I-SMAD分子携带的可能是抗肝纤维化信号[11]。本实验发现肝纤维化模型组具有促纤维化作用的Smad2/3表达增加,其增加与减少程度与肝纤维化水平呈正相关,Smad2/3大量磷酸化及随后Smad复合物在核内的信号传导,直接介导HSC向肌成纤维细胞(Myofibroblast Cell,MFB)的转化,激活血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制因子-1(plasminogen activator inhibitor type-1,PAI-1)和α2(Ⅰ)前胶原转录,导致纤维化逐步加重。本实验发现Smad7在造模6周时与Smad2/3同步升高,提示Smad7与Smad2/3之间相互制约。纤维化启动及进展过程中Smad7被磷酸化,通过特异性地与活化的TβR-Ⅰ的胞内区结合,抑制Smad2/3蛋白的磷酸化,起到抑制TGF-β1信号转导作用。

另外,对肝纤维化模型大鼠肝脏TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3三者的相关性研究结果显示,模型组TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3之间均有显著的正相关关系,提示在肝纤维化时TGF-β1、TβR-Ⅰ和Smad2/3之间存在明显的协同性,这种协同效应可能是TGF-β1信号转导过程不断放大和其促肝纤维化效应实现的条件之一;正常组各指标之间无有意义的相关性,笔者推测这种没有相关性的表达可能正是正常肝脏不发生肝纤维化的条件之一。而模型组大鼠肝纤维化分级与TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3之间有着显著的正相关性,提示肝纤维化时,TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3的表达,或TGF-β1的信号转导强度,与肝脏ECM的沉积有着更加明显和更加直接的关系。而Smad7与TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3、肝纤维化分级的正相关性提示肝纤维化时,Smad7作为即刻反应基因,伴随性的上升发挥其反馈性调节作用。

由于Smad3属于受体型Smad,可能直接承担将TGFβ1刺激信号由胞外传入胞内的关键性作用。为考察Smad3蛋白的表达改变是否与mRNA转录水平一致,笔者对Smad3mRNA在大鼠肝纤维化形成过程中的表达作了初步的探讨。结果表明,各模型组中Smad3mRNA含量较正常组升高(P

上述研究结果表明,肝纤维化模型鼠肝组织存在活跃的TGF-β1/Smad信号转导状态,TGF-β1/Smad信号转导通路参与了肝纤维化的发生发展。

3.2 TGF-β1/Smad基因蛋白与肝纤维化辨证分型的关系

中医药作为治疗肝纤维化的重要手段,研究中医辨证治疗肝纤维化的微观机制,为中医药的疗效评价、揭示中医药逆转肝纤维化的发生和发展提供理论依据。那么TGF-β1/Smad基因蛋白表达是否在肝纤维化辨证分型间产生差异,以便为中医证型辨证提供微观依据。本研究表明,TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3、Smad7气虚血瘀组表达率较肝郁脾虚组明显增强,且通过中药干预治疗后下调显著。笔者推测TGF-β1/Smad细胞信号由外到内的传导过程可能类似于中医学的卫气营血传变。正是由于TGF-β1/Smad细胞信号转导状态的差异导致了证型间病理、转归,以及预后的差异。本研究结果揭示了肝纤维化不同证型之间TGF-β1/Smad基因蛋白表达具有差异性。

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