原料奶、婴儿配方奶粉及酸奶中蛋白去除效果的研究

【摘要】 建立了毛细管电泳法分析α-乳白蛋白、β-乳球蛋白a及β-乳球蛋白b的方法，考察了不同浓度冰乙酸（hac）及三氯乙酸(tca)对原料奶、婴儿配方奶粉a和b及酸奶中蛋白的去除效果。结果表明，tca去除蛋白效果优于hac，不同样品所需tca浓度不同：2 g原料奶需3 ml 100 g/l tca；0.5 g婴儿配方奶粉a和b分别需5 ml 10 g/l 及20 g/l tca；2 g酸奶则需3 ml 20 g/l tca才能将蛋白完全沉淀。为原料奶、婴儿配方奶粉及酸奶等乳制品的样品前处理提供了有价值的参考。

【关键词】 乳制品; 婴儿配方奶粉; 酸奶; 蛋白质; 毛细管电泳

investigation of removal of proteins in　raw milk，infant formula and yogurtding xiao-jing*，yang yuan-yuan，li yun，zhao shan，wang zhi*(beijing center for disease prevention and control，beijing 100013)(college of food science and technology，agricultural university of hebei，baoding 071001)(department of public health and domestic medicine，capital medical university，beijing 100069)abstract on the basis of the development of a new ce method for the analysis of α-lactalbumin(α-lac)，β-lactoglobulin a(β-lga) and β-lactoglobulin b(β-lgb)，different concentrations of acetic acid (hac) and trichloroacetic acid (tca) for the removal of proteins in raw milk，infant formula a and b，and yogurt were investigated.it was shown that tca is better than hac for eliminating of proteins in the above four samples.the proteins in 2 g of raw milk could be eliminated by 3 ml of 100 g/l tca.0.5 g of infant formula a and b needs 5 ml of 10 g/l and 20 g/l tca to remove the proteins，respectively.for 2 g of yogurt，3 ml of 20 g/l tca is enough.the present research may provide valuable information for protein-containing sample(such as raw milk，infant formula and yogurt) pretreatment.

keywords raw milk; infant formula; yogurt; protein; capillary electrophoresis

1 引言

色谱法分析原料奶、婴儿配方奶粉及酸奶等乳制品中有益或有害化学成分时，必须除去其中的蛋白以得到准确结果，因为蛋白很容易在色谱柱上产生不可逆吸附，导致柱效下降。牛奶蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，其中酪蛋白约占总蛋白的80%，乳清蛋白约占15%。乳清蛋白是酪蛋白沉淀后上清液中含有的蛋白〖1〗?

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饕?瑟?联乳白蛋白(α-lac)、β-乳球蛋白(β-lg)、免疫球蛋白g (igg)和牛血清白蛋白(bsa)组成。其中α-lac约占乳清蛋白的3%， β-lg约占9%，igg约占2%，bsa约占1%，其它为非蛋白氮(npn)〖2〗??糜昧磕芊窠?鲜种样品中的蛋白去除干净，需分析蛋白沉淀后的样品上清液中是否仍有蛋白残留。因此，有必要建立能够准确测定乳清蛋白中含量较高的α-lac， β-lga及β-lgb的方法，以监测去除蛋白前后3种蛋白含量的变化，获知蛋白的去除效果。

毛细管电泳（ce）法因其非常适合蛋白分析而成为首选方法。常用的ce法一般利用涂层管或裸管，通过往分离缓冲液中添加高分子聚合物以实现蛋白分离〖5，6〗???薅?渴?荨1狙芯拷?⒘?e同时分离并测定α-lac， β-lga及β-lgb的方法，考察了hac和tca对原料奶、婴儿配方奶粉及酸奶中蛋白的去除效果。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

beckman p/ace 5000型毛细管电泳仪（美国beckman公司），配备紫外检测器；p/ace工作站；f-33 ph/mv型酸度计（北京屹源电子仪器科技公司）；universal 32型离心机（德国hettich公司）；millipore milli-elix/rios型超纯水器（美国millipore公司）；旋涡混合器（法国gilson公司）。

硼酸（优级纯，铁岭地区开源化工厂）；csoh·h2o（99.5%，北京百灵威化学技术有限公司）；冰乙酸(99%)和naoh（北京化学试剂公司）；羟丙基-β-环糊精(hp-β-cd，分子量：1540 g/mol)，聚氧化乙烯(peo，分子量：4000 kg/mol)， α-lac， β-lga及β-lgb（sigma-aldrich公司）。原料奶采自当地奶牛场，婴儿配方奶粉及大果粒酸奶购于当地超市。

2 g/l peo储备液：称取0.2 g peo于100 ml试剂瓶中， 加入100 ml水后于50 ℃水浴中加热直至溶解，摇匀后于室温放置备用。

α-lac， β-lga及β-lgb储备液：准确称取10 mg α-lac，10 mg β-lga 及10 mg β-lgb于1.5 ml塑料离心管中，分别加入1 ml水溶解，得到质量浓度为10 g/l 的标准储备液。短期保存可置于4 ℃冰箱，若长时间保存，则将标准储备液分装后于－20 ℃冻存。工作液由储备液经0.05 mol/l hac稀释后制得。

2.2 电泳条件

2.2.1 测定条件 毛细管(50 μm×57 cm有效长度：50 cm，河北永年锐沣色谱配件有限公司）。

分离缓冲液：0.5 mol/l h3bo3 + 0.025 mol/l hp-β-cd + 0.8 g/l peo，ph 9.10 (1 mol/l csoh调节)；样品介质：0.05 mol/l hac。分离电压：14 kv；检测波长：214 nm；操作温度：25 ℃；进样压力及时间：3.448 kpa， 5 s； 工作电流： 约80 μa。

2.2.2 毛细管的预处理 新的毛细管分别用1 mol/l naoh洗15 min、水洗5 min及分离缓冲液洗10 min。每次进样前，分别用0.1 mol/l naoh及分离缓冲液洗15 min，以保证方法的重现性。

3 结果与讨论

3.1 分离缓冲液及ph、添加剂的选择

α-lac，β-lga及β-lgb的分子量分别为14.178， 18.363 及18.276 kda，等电点(pi)分别为4.4，5.1 及5.2〖9〗?羲嵝缘鞍祝?ü?鹘诜掷牖撼逡旱?h值，使之高于3种蛋白的等电点，3种蛋白带负电，而毛细管壁表面也带负电，从而减少吸附〖10〗?。由于3种蛋白均为糖基化蛋白，易于与bo3－3形成带负电的络离子，能进一步增加与毛细管壁的库仑排斥力，因此分离缓冲体系选用硼酸盐缓冲体系可减少吸附。另外，高浓度硼酸盐还可以改善分离，然而，硼酸盐的浓度过高将产生较多的焦耳热，引起色谱峰展宽，本实验表明h3bo3的最佳浓度为0.5 mol/l，如此高的浓度限制了分离缓冲液的ph值，分离缓冲液的最佳ph为9.10，此时3种蛋白在管壁的吸附仍未得到有效抑制。本研究将peo及hp-β-cd作为分离缓冲液添加剂联合使用，既有效抑制了吸附又改善了3种蛋白与杂质间的分离，经优化，peo及hp-β-cd的最佳浓度分别为0.8 g/l及0.025 mol/l。在上述最佳分离条件下，3种蛋白均得到很好的分离。

3.2 校准曲线、线性范围、精密度、检出限及定量限

在上述最佳电泳条件下，分别将3种蛋白的标准储备液用0.05 mol/l hac稀释成50，100，150，200，250和400 mg/l的α-lac、β-lga及β-lgb工作液，依次注入电泳仪，外标法定量，峰面积(a)与质量浓度(ρ，mg/l)具有良好的线性关系，线性回归方程分别为α-lac：a=301.2ρ－5091.3； β-lga：a=391.56ρ－7310； β-lgb：a=275.64ρ－3833.8。线性相关系数分别为0.9980，0.9991和0.9994； 线性范围均为50～400 mg/l；检出限(s/n=3)分别为10，15和12 mg/l；定量限(s/n=10)分别为30，50和40 mg/l。

分别将质量浓度均为 60，100 和200 mg/l的3种蛋白的混合标准溶液，连续进样7次，所得迁移时间的相对标准偏差(rsd)分别为：α-lac：0.64%，0.38% 和0.18%；β-lga：0.79%，0.47%和0.16%；β-lgb：0.74%，0.42% 和0.13%。峰面积的rsd分别为α-lac：3.8%，1.6% 和 1.9%；β-lga：4.3%，1.8% 和 2.5%；β-lgb：3.2%，4.4% 和1.2%。

3.3 加标回收率

由于酸奶中α-lac的含量较低，且不含β-lga 及β-lgb，因此，以酸奶样品为本底，测定本方法的回收率，以验证方法的准确度。加标质量浓度为50 mg/l时，α-lac，β-lga及β-lgb的回收率分别为116.8%，98.5% 及 108.5%，相应的相对标准偏差（rsd，n=5）分别为7.2 %， 8.6 % 及10.8%。 加标质量浓度为150 mg/l时，α-lac，β-lga 及β-lgb的回收率分别为111.7%，95.6% 及 90.7%，相应的rsd分别为3.0%，1.8%及 4.2%。回收率的结果进一步证明0.05 mol/l hac只能沉淀酪蛋白，而不能沉淀上述3种蛋白。

3.4 实际样品分析

在上述最佳分离条件下，分别对5个原料奶样品中的3种蛋白进行测定。结果列于表1中。本方法成功地测定了乳清蛋白中的α-lac，β-lga及β-lgb，因此，可用于监测hac或tca对蛋白的去除效果，以利于色谱分析。

图1 1 g原料奶分别用4 ml水稀释（a）和用4 ml 0.05 mol/l hac处理（b）后的电泳图（略）

fig.1 electrophoregram of 1 g of raw milk diluted with (a) 4 ml water and (b) pretreated with 4 ml 0.05 mol/l hac

1.α-lac; 2.β-lgb; 3.β-lga。 电泳条件（ce conditions）： 毛细管（capillary） 50 μm×57 cm， 有效长度（effective length）： 50 cm； 分离缓冲溶液（separation buffer）： 0.5 mol/l h3bo3+0.025 mol/l hp-β-cd + 0.8 g/l peo 400 0000，ph 9.1(1 mol/l csoh)； 样品介质（sample buffer）： 0.05 mol/l hac；分离电压（separation voltage）：14 kv； 检测波长（detection wavelength）： 214 nm； 进样压力及时间（inject pressure and time）： 3.448 kpa×5 s。

表1 原料奶中3种蛋白的测定结果（略）

table 1 determination results of α-lac，β-lga and β-lgb

α-lac： α-lactalbumin; β-lga：β-lactoglobulin a; β-lgb：β-lactoglobulin b.

3.5 hac沉淀蛋白的效果 由于牛乳是一种连续相为水、分散介质为胶体的乳浊液，具有复杂的物理化学性质〖11〗?。必须将原料奶处理成澄清液才能进入色谱系统。hac是常用的蛋白沉淀剂，但至今未见hac沉淀何种蛋白的报道。为证实hac沉淀原料奶中何种蛋白，在1 g原料奶中分别加入4 ml水稀释后直接进样和用4 ml 0.05 mol/l hac处理并于10000 r/min离心10 min后取上清液直接进样的结果进行对比。如图1所示，用0.05 mol/l hac处理原料奶可去除大量酪蛋白，而α-lac，β-lga及β-lgb并未被除掉，均留在上清液中。

为获得乳清蛋白中α-lac，β-lga及β-lgb完全沉淀所需hac浓度，分别以0.05，0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 1.0， 2.0和5.0 mol/l 的hac（3 ml）处理2 g原料奶，均得到澄清的样品溶液，表明共存的大量酪蛋白被去除，当hac浓度在0.05~0.2 mol/l时，3种蛋白峰的峰高基本不变；但当hac浓度增至0.4 mol/l时， 3种蛋白的峰高开始降低，表明3种蛋白开始被高浓度hac沉淀；当hac浓度增至5 mol/l时，3种蛋白被完全沉淀。因此，如果用于α-lac，β-lga 及β-lgb的分析研究，则0.05~0.2 mol/l hac沉淀原料奶中的酪蛋白即可，不会造成上述3种蛋白的损失；但如果用于原料奶中化学成分的分析，则需使用较高浓度hac将α-lac，β-lga及β-lgb除去，因为它们易被不可逆地保留在色谱柱上，将导致柱效逐渐下降直至完全失效。

由于α-lac能提供最接近母乳的氨基酸组合，提高蛋白质的生物利用率，降低蛋白质总量，从而有效减轻肾脏负担；同时α-hac还促进婴儿的大脑发育，因而经常被添加到婴幼儿配方奶粉中。一些婴幼儿对牛奶不耐受，主要是对β-lga和β-lgb不耐受，这两种蛋白是主要的过敏原〖12〗?。因此，配方奶粉在加工过程中去除了这两种蛋白并添加了利于婴儿健康成长的营养成分，这些添加组分干扰?β?-lga 及β-lgb的准确测定，只能通过α-lac监测hac对婴儿配方奶粉中蛋白的去除效果。

图2a和图2b分别为0.025，0.05，0.1，0.2和0.4 mol/l hac（5 ml）处理0.5 g婴儿配方奶粉a 和b时蛋白的去除效果。由图2可见：

婴儿配方奶粉a和b经hac处理后，均得到了澄清的样品溶液，共存的大量酪蛋白被去除，其中的α-lac未被沉淀，而保留在上清液中。但当用于沉淀婴儿配方奶粉a中蛋白的hac浓度增至0.4 mol/l、用于沉淀婴儿配方奶粉b中蛋白的hac浓度增至0.2 mol/l时，溶液开始变浑浊，表明已经沉淀的蛋白因酸性增加而重新溶解；而α-lac仍未被除去，说明婴儿配方奶粉中的添加剂不会影响酪蛋白的沉淀，但会使α-lac不易被沉淀。

图2 经hac处理0.5 g婴儿配方奶粉a 和b的毛细管电泳图（略）

fig.2 electrophoregram of different concentrations of acetic acid on the extraction of 0.5 g of infant formula a and b

1．α-lac.电泳条件同图1(other conditions are the same as in fig.1）。

分别用3 ml 0.025~1.5 mol/l hac处理2 g大果粒酸奶，均可得到澄清的样品溶液。共存的大量酪蛋白被去除，上清液中仅含α-lac，不含β-lga 及β-lgb，这也证明对牛奶过敏的人对酸奶则不过敏。当hac浓度在0.05~0.2 mol/l时，α-lac的峰高基本不变。但当hac浓度增至0.4 mol/l时，α-lac的峰高开始降低，表明它开始被高浓度hac沉淀。当hac浓度增至1.5 mol/l时，α-lac被完全沉淀。

3.6 tca沉淀蛋白的效果

tca的酸性强于hac（pka=0.5， i= 0.1），3 ml 2 g/l tca即可沉淀2 g原料奶中的酪蛋白，离心后得到澄清的上清液。如图3所示， α-lac，β-lga 及β-lgb未被沉淀，通过峰面积比较发现，2 g/l tca去除2 g原料奶中蛋白效果与0.05 mol/l hac的去除效果相当，说明2 g/l tca处理原料奶仅仅沉淀了酪蛋白。然而，随着其质量浓度的增加，α-lac先被沉淀，β-lga 及 β-lgb后被沉淀。一般2 g原料奶需3 ml 100 g/l tca以保证蛋白被去除干净。图4a及4b为用5 ml 不同质量浓度 tca处理0.5 g婴儿配方奶粉a和b时蛋白的去除效果。由图4a可见：用5 ml 2~10 g/l tca处理0.5 g婴儿配方奶粉a，当tca 浓度为2 g/l时样品溶液浑浊，表明酪蛋白未被完全去除，α-lac与杂质峰重叠在一起；当tca 浓度增至3 g/l时，所得样品溶液依然浑浊，但杂质峰变低，α-lac显现，仍无法与杂质达基线分离；当tca 浓度为5～10 g/l 时，均能得到澄清的样品溶液，当tca质量浓度增至10 g/l时，α-lac被完全沉淀。图4b为用5 ml 2~20 g/l tca处理0.5 g婴儿配方奶粉b的效果， tca浓度为2 g/l时，溶液浑浊，α-lac与未沉淀的杂质不能达基线分离；tca浓度为3 g/l时，溶液澄清，酪蛋白去除干净；tca浓度为5～10 g/l时，溶液渐渐浑浊，已经沉淀的蛋白又重新溶解；继续将tca的浓度增至20 g/l，溶液变澄清，同时α-lac也被完全沉淀。

图3 经不同质量浓度tca沉淀原料奶中蛋白的毛细管电泳图（略）

fig.3 electrophoregram of different concentrations of trichloroacetic acid (tca) on the removal of proteins in 2 g of raw milk

1.α-lac; 2.β-lgb; 3.β-lga。电泳条件同图1（other conditions are the same as in fig.1).

图4 不同质量浓度tca去除0.5 g婴儿配方奶粉a和b中蛋白的结果（略）

fig.4 different concentrations of tca on the removal of proteins in 0.5 g of infant formula a and b

1.α-lac.电泳条件同图1（other conditions are the same as in fig.1）。由此可见，不同婴儿配方奶粉沉淀蛋白所需tca浓度不同。

用3 ml 2~20 g/l tca处理2 g国产大果粒酸奶，均可得到澄清的样品溶液，共存的大量酪蛋白被去除。随着tca浓度的增加，α-lac的峰高逐渐减小； 当tca浓度增至20 g/l时，α-lac被完全沉淀。

综上可知，由于hac能够在很宽的浓度范围内保证α-lac，β-lga及β-lgb不被沉淀，因此，无论是原料奶、婴儿配方奶粉还是酸奶样品，若测定其中的α-lac，β-lga及β-lgb，则hac是较好的选择，但若沉淀蛋白，则tca是较好的选择。不同样品所需tca的浓度不同，用于色谱分析时应分别优化tca的浓度及用量。

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