玉米ZmbZIP基因植物表达载体的构建

摘要：根据玉米（Zea mays）ZmbZIP的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物，以质粒pGM-T-ZmbZIP为模板PCR扩增ZmbZIP基因片段，双酶切目的片段及载体，回收后连接，构建该基因的植物表达载体。结果表明，扩增出的ZmbZIP基因片段长度为894 bp。经PCR检测及测序鉴定，表明植物表达载体构建成功，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

关键词：植物表达载体；玉米（Zea mays）；ZmbZIP

中图分类号：S515；Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3175-03

植物碱性亮氨酸拉链（Basic leucine zipper， bZIP）蛋白是一个大的转录因子家族，它的成员参与调控逆境应答和激素信号转导[1-3]。碱性亮氨酸拉链蛋白包含一个碱性DNA结合区域和一个亮氨酸拉链二聚基序。根据植物中bZIP转录因子的结构差异，可将bZIP转录因子分为A、B、C、D、E、F、G、H、I和S亚族共10个亚族。研究表明转基因植物过表达A族bZIP基因可增强植物对非生物胁迫的忍耐。例如拟南芥AREB1/ABF2是葡萄糖信号传递中的重要元件，它的过表达影响拟南芥对多种逆境的忍耐[4，5]，过表达ABF3或AREB2/ABF4可提高转基因植物对干旱的忍耐能力[6]。在水稻中，OsbZIP72是ABA信号转导的正调控子，过表达OsbZIP72增强水稻苗期的抗旱能力[7]。

玉米（Zea mays）是重要的粮食和饲料作物，它的生长发育受多种非生物逆境的严重影响[8]，因此揭示玉米非生物逆境应答的分子机制是非常重要的。利用模式植物拟南芥研究基因的功能是目前广泛采用的方法，而构建植物表达载体是在植物体内研究基因功能的前提。因此，本研究构建了玉米ZmbZIP基因的植物表达载体，经菌液PCR和测序鉴定所构建载体的正确性，为进一步转化模式植物拟南芥研究基因的功能奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA连接酶、大肠杆菌感受态细胞Top10购于天根生化科技（北京）有限公司。各种限制性内切酶购于宝生物工程（大连）有限公司。引物合成及序列测定由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司完成。含有ZmbZIP基因cDNA序列的pGM-T-ZmbZIP菌液和植物表达载体pCAMBIA3301菌液由新乡学院生命科学与技术系园林教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增 根据ZmbZIP基因cDNA序列和pCAMBIA3301的多克隆位点设计一对引物，上游引物添加Nco Ⅰ酶切位点，下游引物添加Bgl Ⅱ酶切位点，引物序列为：F，5′-ATACCATGGATGGACGAG

CTGCTCCAGAGC-3′； R，5′-TAAAGATCTTCACCA

GGGGGCCGTCAACGT-3′ （下划线分别表示NcoⅠ 和Bgl Ⅱ酶切位点）。按照TIANGEN质粒小提试剂盒说明书提取pGM-T-ZmbZIP质粒。以pGM-T-ZmbZIP质粒为模板进行PCR扩增。PCR反应体系包括质粒（50 ng/μL） 1 μL、10×PCR buffer 5 μL、dNTPs （10 mmol/L） 2 μL、引物（10 μmol/L） 2 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，补ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，用紫外凝胶成像仪（Bio-Rad）观察结果，采用凝胶回收试剂盒回收长度正确的扩增片段产物。

1.2.2 植物表达载体的构建 按TaKaRa限制性内切酶使用说明书推荐体系，用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切ZmbZIP回收产物和植物表达载体pCAMBIA3301，酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，凝胶回收试剂盒回收酶切产物，用T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接目的片段到植物表达载体中。连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂于含有卡那霉素的LB固体培养基上，过夜培养后挑取阳性克隆，经含有卡那霉素的液体培养基振荡培养12 h后，菌液PCR检测是否有插入片段，阳性克隆送北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序。

2 结果与分析

2.1 ZmbZIP基因片段的PCR扩增

以含有ZmbZIP基因cDNA序列的质粒pGM-T-ZmbZIP为模板，PCR扩增带有Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位点的产物，琼脂糖凝胶电泳检测发现，扩增产物大小为894 bp，与预期大小一致（图1），且产物条带清晰明亮，满足后续实验的要求。

2.2 植物表达载体的构建及鉴定

用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切目的片段和载体后，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，对重组质粒pCAMBIA3301-ZmbZIP进行菌液PCR鉴定，结果表明，能够从转化pCAMBIA3301-ZmbZIP的大肠杆菌菌液中扩增出大小为894 bp的目的片段，阳性菌液送北京鼎国昌盛公司测序，测序比对发现，插入序列与ZmbZIP序列完全一致，表明pCAMBIA3301-ZmbZIP载体构建成功（图2）。

3 讨论

玉米中存在170个碱性亮氨酸拉链蛋白，但是仅有很少的玉米碱性亮氨酸拉链蛋白的功能被研究[9，10]。本研究成功构建了玉米ZmbZIP基因的植物表达载体并采用菌液PCR结合测序的方法对构建的植物表达载体进行了鉴定，与酶切鉴定相比，测序鉴定能够保证插入片段序列的正确性，只有未发生碱基突变的序列才能在植物体内编码正确的碱性亮氨酸拉链蛋白，行使其生物学功能。本研究通过测序验证了插入的ZmbZIP序列与原始序列一致，为进一步转化拟南芥揭示ZmbZIP基因的功能奠定了实验基础。

参考文献：

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