稀土离子(La3+、Ce3+、Nd3+)对超氧化物歧化酶活性的影响

摘要：利用微量邻苯三酚自氧化法（320 nm）研究了25 ℃下，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲体系中（pH 8.2）不同稀土离子（La3+、Ce3+、Nd3+）对邻苯三酚自氧化和铜锌超氧化物歧化酶（Cu， Zn-SOD）活性的影响，并对可能的抑制作用机理进行了讨论。结果表明，稀土离子La3+、Nd3+对邻苯三酚自氧化有抑制作用，Ce3+对邻苯三酚自氧化表现出先抑制后促进的作用；3种稀土离子对Cu，Zn-SOD酶活性均存在抑制作用，并随稀土离子浓度的增加抑制程度不断增强，而当加入的稀土离子浓度大于2.22×10-5 mol/L时，Cu，Zn-SOD完全失活。

关键词：铜锌超氧化物歧化酶；稀土离子；邻苯三酚；活性

中图分类号：O614.33；Q55 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3145-05

铜锌超氧化物歧化酶（Cu，Zn-SOD）是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基（·O2-）发生歧化反应，清除生物体内超氧阴离子自由基[1]，具有抗衰老、抗癌、防白内障等作用，在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用[2]。

稀土元素有“农业维生素”之称，自20世纪80年代以来，稀土作为微量元素肥料已被广泛应用于农业生产。大量研究表明，稀土对提高作物产量，改善作物品质都起到了积极作用[3，4]。关于稀土元素对生物体内超氧化物歧化酶活性的影响研究广泛，有报道认为，稀土元素对提高植物的超氧化物歧化酶活性以及降低脂质过氧化产物丙二醛的含量有十分重要的作用[5]；另有报道认为稀土离子对生物体内超氧化物歧化酶活性影响不大[6]。因此，弄清稀土元素与超氧化物歧化酶的相互作用，将直接证明稀土元素对生物体的保护及刺激作用，从而明确稀土元素对提高作物产量、改善作物品质的机理，并有希望将稀土化合物开发为清除超氧阴离子自由基的药物。

本研究利用邻苯三酚在碱性条件下自氧化生成超氧阴离子自由基的性质，来分析和探讨稀土离子和超氧化物歧化酶在纯化学条件下的相互作用。邻苯三酚在碱性条件下可发生链式反应生成超氧阴离子自由基，并受抗氧化酶的抑制，尽管与生物体内的生化反应尚有很大差别，但可为明确稀土在生物内对抗氧化酶的作用机制提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 SP-1920UV系列双光束紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司），pHS-3E型数字酸度计（上海雷磁分析仪器有限公司），BSA124S型电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），SYP-Ⅱ型恒温水槽（南京桑力电子设备有限公司）。

1.1.2 试剂 牛血Cu， Zn-SOD（3 000 U/mg，Fluka），三羟甲基氨基甲烷（>99.9%，上海源聚生物科技有限公司），盐酸（开封东大化工有限公司），邻苯三酚（贵州遵义佳宏化工有限责任公司），氯化镧、氯化亚铈、氯化钕（国药集团化学试剂有限公司），除标注外其他试剂均为分析纯试剂，水为二次蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 邻苯三酚自氧化测定 准确量取4.50 mL浓度为 0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.2） 和4.20 mL蒸馏水，混匀后立即加入在25 ℃下恒温20 min的2.5 mmol/L邻苯三酚0.30 mL（对照管用0.01 mol/L的盐酸溶液代替），立即混匀，迅速倒入比色池中，在波长为320 nm下采用紫外可见分光法对邻苯三酚自氧化产物进行扫描，扫描间隔为1 s，记录该扫描曲线初始阶段斜率即为邻苯三酚的自氧化速率A/min，每次试验均重复3次。

1.2.2 稀土离子对邻苯三酚自氧化的影响 测定稀土离子对邻苯三酚影响时同“1.2.1”，只是在加入邻苯三酚前，分别先加入一定量的稀土离子，并减少同体积的二次蒸馏水的量，记录在320 nm处吸光度（A）随时间（t）的变化曲线，并求取曲线斜率。

1.2.3 邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性 超氧化物歧化酶活性测定法同“1.2.1”，加入邻苯三酚前先加入一定量超氧化物歧化酶（4 μg/mL），并减少同体积二次蒸馏水，记录该曲线的斜率。

1.2.4 稀土离子对超氧化物歧化酶活性的影响 测定稀土离子对超氧化物歧化酶活性的影响同“1.2.1”，在加入邻苯三酚之前，先加一定量的超氧化物歧化酶和一定量的稀土离子，并减少同体积二次蒸馏水。记录在320 nm处吸光度（A）随时间（t）的变化曲线，并求取曲线斜率。

2 结果与分析

2.1 邻苯三酚自氧化中最大吸收波长的确定

邻苯三酚自氧化产物在特定波长处有灵敏吸收峰，但在具体应用中，测定波长的选择存在较大差异，主要有420 nm[7]和325 nm[8]两种。为了准确测定其最大吸收峰位置，对邻苯三酚自氧化过程在不同时间进行了光谱扫描，扫描波长范围为200～700 nm，其结果见图1。邻苯三酚自氧化产物在440 nm和320 nm处有吸收峰，与文献报道的420 nm和325 nm并不相同。320 nm处在反应初期即有较强吸收，并随反应进行该处的吸收强度不断增强，在反应30 min时峰强度有所降低，主要是由于自氧化进程在30 min时反应已基本完成；而440 nm处直到10 min后才观测到有明显的峰出现，而且在整个扫描时间段，该处峰值比320 nm处的峰值要低。考虑到测量的灵敏度，本试验均选择在波长为320 nm处进行测定。

2.2 邻苯三酚的自氧化过程

在碱性条件下邻苯三酚自氧化反应产生超氧阴离子自由基，该自由基进一步与中间产物反应生成具有强吸收的醌，其在320 nm处有最大吸收。通过对邻苯三酚自氧化过程进行时间扫描，得到了吸光度（A）随时间（t）的变化曲线，如图2所示。在反应初期吸光度值随时间变化呈一直线（线性相关系数可达0.999以上），直线范围维持至5 min左右，此后斜率渐变平缓。为了准确表示反应初期邻苯三酚的自氧化速率，以下每次试验均选取前3 min内直线斜率来表示邻苯三酚的自氧化速率A/min。

2.3 邻苯三酚自氧化最佳浓度的确定

邻苯三酚浓度可对其自氧化产物的浓度产生影响，从而影响吸收信号的强度。因此，固定其他条件不变，仅改变邻苯三酚的浓度，测定其对自氧化速率的影响，结果如图3所示。结果表明，邻苯三酚自氧化速率与其浓度变化呈正比，线性方程为A =-0.006 13+ 0.027 19 C（R2=0.999 09），从而说明邻苯三酚自氧化具有一级反应动力学特征，这与袁倬斌等[9]的观点是一致的。另外，在邻苯三酚浓度为2.5 mmol/L时其自氧化速率约为0.068，据张宏等[10]的报道，邻苯三酚自氧化速率处于0.06～0.07之间时具有较高的稳定性和准确性，因此在以下试验中均选用邻苯三酚的浓度为2.5 mmol/L。

2.4 超氧化物歧化酶最佳加入量的确定

为了了解超氧化物歧化酶对邻苯三酚自氧化速率的影响，固定邻苯三酚的浓度为2.5 mmol/L，改变超氧化物歧化酶的加入量，测定超氧化物歧化酶的加入量对邻苯三酚的氧化速率的影响，结果见图4。邻苯三酚自氧化速率随酶量增加呈指数衰减，该现象可用邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶活性的原理[11]得到解释。

在碱性条件下，邻苯三酚可在羟基发生离解时与溶液中的溶解氧发生反应生成半醌自由基，并产生·O2-；然后半醌自由基可进一步被·O2-氧化成具有强吸收的醌，如下式所示：

如果溶液中含有超氧化物歧化酶，则·O2-一经产生即被超氧化物歧化酶歧化生成H2O2和O2，半醌自由基不能形成具有强吸收的醌，检测到的吸收强度将比无超氧化物歧化酶时减弱，且减弱的程度与超氧化物歧化酶的浓度或活性有关，依据此原理可对超氧化物歧化酶的活性进行测定。因此，酶加入量越多，对邻苯三酚的抑制就越强，自氧化速率就越小。据张宏等[10]的报道，最优的加酶量应为能抑制邻苯三酚的自氧化下降50%为宜，此时测定的准确度和灵敏度都会比较高。最终确定酶的加入量为0.50 mL。

2.5 不同种类稀土离子对邻苯三酚自氧化速率的影响

为了考察稀土离子La3+、Ce3+、Nd3+对超氧化物歧化酶活性的影响，首先要弄清稀土离子对底物邻苯三酚是否存在作用。因此，首先测定了3种稀土离子对邻苯三酚自氧化速率的影响，结果见图5。邻苯三酚自氧化速率随La3+和Nd3+浓度的增加而降低，而随着Ce3+浓度的增加表现出先增加后减小的趋势。结果表明，La3+和Nd3+对邻苯三酚自氧化存在抑制作用。王春霞等[12]采用脉冲辐解法研究了不同稀土离子对超氧阴离子自由基的抑制作用，结果表明，稀土离子对超氧阴离子自由基有明显的抑制作用，并随着稀土离子浓度的增加而抑制程度增加，其中La3+和Nd3+相比，Nd3+的抑制效果要强于La3+，与本试验结果是一致的。由于稀土离子对超氧阴离子自由基的抑制作用，使得邻苯三酚自氧化中间产物阻断，从而导致难以生成强吸收的醌，因此表现出自氧化速率降低。

而Ce3+对邻苯三酚自氧化速率影响较为复杂，推测其原因可能是由于铈离子是变价金属，存在+3和+4价，而邻苯三酚自氧化本身反应机理就较为复杂[9]，存在着活性氧自由基的相互转化，期间会涉及到电子的转移过程，加入Ce3+后，Ce3+极有可能参与了这些反应，使机理更加复杂。王金胜等[13]认为，低浓度的Ce3+可清除大量的·O2-，其反应如下：

Ce3++·O2-+2H+Ce4++H2O2，Ce4++·O2-Ce3++O2

而其他两种稀土离子因为仅存在+3稳定价态，影响较为单一。关于稀土元素具有清除·O2-的作用，有报道解释是由于稀土离子与过氧化物-自由基发生了加合作用，其中还包括键合作用，电子转移和磁偶极-偶极相互作用等的结果[14]。

另外，从图5可看出，La3+、Nd3+及Ce3+（在低浓度时）对邻苯三酚自氧化速率均有抑制作用，这与超氧化物歧化酶对邻苯三酚自氧化速率有抑制作用是相似的，但比较图4与图5，从邻苯三酚自氧化速率的改变范围可明显看出，超氧化物歧化酶对邻苯三酚自氧化的抑制作用明显强于稀土离子对邻苯三酚自氧化的抑制作用。

2.6 稀土离子对超氧化物歧化酶活性的影响

为了研究稀土离子和酶的相互作用，在固定其他条件不变的情况下，将超氧化物歧化酶和稀土离子作用1 h后再加入邻苯三酚。图6为超氧化物歧化酶与不同浓度稀土离子作用后对邻苯三酚自氧化速率和影响曲线。由图6可知，3种稀土离子与酶作用后对邻苯三酚自氧化速率的影响情况基本相同，均随稀土离子浓度的增加呈现先增加后基本不变的趋势。比较图5与图 6，除Ce3+外，随稀土离子浓度增加，邻苯三酚自氧化速率的变化方向是相反的，说明稀土离子对超氧化物歧化酶是有作用的，因为在不加稀土离子时，酶对邻苯三酚自氧化有抑制作用，而在不加酶时，稀土离子对邻苯三酚自氧化也是抑制作用。但从图 6可看出，在将酶与稀土作用一段时间后，邻苯三酚的自氧化速率反而增加了（需要特别说明的是，尽管表观上自氧化速率是增加了，但与不加稀土和酶时的自氧化速率0.068相比，仍均处于0.068下方，说明表观的增加实际反映的是抑制程度的减弱），从而从侧面说明在酶和稀土作用一段时间后，由于两者之间的相互作用，导致酶的活性被稀土离子所抑制。在稀土离子浓度较低时，超氧化物歧化酶过量，随着稀土离子浓度的增加，剩余超氧化物歧化酶的量不断越少，从而对邻苯三酚自氧化的抑制程度不断降低，因此在图6中表现为稀土离子浓度较小时，邻苯三酚自氧化速率不断增加；而伴随稀土离子浓度的不断增加，当La3+、Ce3+、Nd3+的浓度大于2.22×10-5 mol/L时，超氧化物歧化酶被稀土离子完全抑制，此后再增加稀土离子时，稀土离子会过量，此时主要表现为多余的稀土离子对邻苯三酚自氧化的影响，而该影响程度可从图5中看出，3种稀土离子在浓度大于2.22×10-5 mol/L后，对邻苯三酚的影响均较小，这与图6中的结果恰好是一致的。

2.7 稀土离子对超氧化物歧化酶活性影响的相关性分析

稀土离子对超氧化物歧化酶有抑制作用，其可能原因可从Cu，Zn-SOD的分子结构入手来探讨。Cu，Zn-SOD分子由2个相同的亚基组成，每个亚基含有1个Cu2+和1个Zn2+，Cu2+由酶蛋白的4个组氨酸咪唑基的N原子和1个水分子配位，形成菱形对称配位环境，Zn2+被包埋在蛋白质的疏水集团中，主要起稳定酶结构的作用。Cu2+是酶的活性中心，周围由带正电荷的氨基酸包围着，Cu2+活性中心通过电子传递催化超氧阴离子发生歧化反应，催化机理被描述如下[15]：

E-Cu（Ⅱ）+·O2-？葑E′-Cu（Ⅰ）+O2

E′-Cu（Ⅰ）+·O2-+2H+？葑E-Cu（Ⅱ）+H2O2

2·O2-+2H+？葑H2O2+O2

关于稀土离子对酶活性影响的研究表明，稀土离子对酶的抑制机理主要存在以下情况：一是稀土离子作用于酶的活性中心，稀土离子由于半径与金属酶活性中心离子半径相当从而替换出离子导致酶失活；二是稀土离子作用于酶活性中心的周围环境，由于稀土离子具有空轨道，容易和酶蛋白的氨基酸残基作用产生配合物，使部分酶的空间结构发生变化而失去活性。在本研究中，考虑到稀土离子Ce3+、La3+、Nd3+与Cu， Zn-SOD活性中心离子Cu2+、Zn2+半径相差较大，较难替换酶中心离子而失活，因此推测3种稀土离子主要是由于第二种原因导致了酶活性的改变。冯志祥等[6]采用ESR谱证实稀土离子Ce3+对Cu，Zn-SOD酶活性的影响主要是通过与活性中心附近的氨基酸的羧基作用而导致酶活性的改变，该结论也可从侧面证明我们推测的可能性。

3 小结与讨论

本研究采用邻苯三酚自氧化法测定了不同稀土离子对邻苯三酚自氧化和超氧化物歧化酶活性的影响。研究表明，在不加酶、只加稀土离子的情况下，随着稀土离子La3+、Nd3+浓度的增加，邻苯三酚自氧化速率不断降低，说明La3+、Nd3+对邻苯三酚自氧化中间物超氧阴离子自由基存在抑制作用，而随着Ce3+浓度的增加，邻苯三酚自氧化速率表现出先减后增的趋势，推测可能与其为变价金属，参与了自氧化进程有关。

另外，在加入稀土离子和超氧化物歧化酶的情况下，3种稀土离子都表现出了对超氧化物歧化酶活性的抑制作用，在加入稀土离子大于2.22×10-5 mol/L时，超氧化物歧化酶活性被完全抑制，表现为稀土离子与超氧化物歧化酶作用后，剩余的稀土离子与邻苯三酚的作用。推测可能的抑制机理是由于稀土离子与超氧化物歧化酶活性中心外的氨基酸残基作用导致酶失活。

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