肿瘤血管生成拟态影像学的新进展

【关键词】肿瘤；新生血管化，病理性；超声检查；磁共振成像；光学；分子影像学；综述

【中图分类号】R445；R730.4

近年来肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，已成为威胁人类健康的重要原因之一。新生血管一直被认为是肿瘤获得血液供应的唯一途径，其与肿瘤的生长、转移及预后密切相关。但以血管内皮细胞为靶点的抗血管生成治疗在部分高度恶性肿瘤中并未达到预期的效果。因此，研究者们对肿瘤新生血管之外是否存在另外的微循环模式进行了深入的研究。Maniotis等[1]通过研究高侵袭性的葡萄膜黑色素瘤发现其血供方式与经典的肿瘤微血管结构不同，是肿瘤细胞自身直接形成的具有微循环功能的类血管结构，进而首次提出了血管生成拟态（vasculogenicmimicry，VM）的概念。VM的提出解释了肿瘤抗血管生成治疗效果不佳的原因，同时也兼顾了肿瘤血液供应的多种方式。目前评价VM的“金标准”是血管拟态密度（vasculogenicmimicrydensity，VMD），但因其有创性、对准确取材的依赖性等缺点一直未能广泛用于临床。影像学是一种非侵入性的、可重复性较高且方便快捷的可视化监测方法，特别是分子影像学的逐步发展，为VM在活体内定量检测提供了技术支持。

1、VM的特点及发生机制

Maniotis等[1]通过研究人眼葡萄膜黑色素瘤及转移性皮肤黑色素瘤的微循环，发现直径>1cm的瘤体中心很少出现坏死、纤维组织及微血栓，而且普通病理切片上也很少见到由内皮细胞构成的新生血管，于是首次提出了VM的概念，即在无内皮细胞的参与下，由某些具有内皮细胞表型的肿瘤细胞直接形成具有微循环功能的类血管结构。光镜下可以观察到这些类血管结构形态多样，且肿瘤细胞排列成管道结构，管道内衬一层过碘酸希夫（periodicacidSchiff，PAS）染色阳性的细胞基质膜。但经光镜、电镜及免疫组织化学检查均未发现内皮细胞的存在。VM的类型分两种，即管型和图案样基质型VM[2]。管型VM在形态上与新生血管相类似，但管道壁上并未发现内皮细胞；图案样基质型VM在形态学和解剖学上均与新生血管不相类似，而是由层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素、IV型及VI型胶原纤维等多种细胞外基质形成。VM与新生血管相比有以下特征：VM管壁内层无内皮细胞，内皮细胞特异标志分子CD31和CD34染色呈阴性[3]，而是一层PAS染色阳性的基底膜样结构[4]；VM是由多种细胞外基质蛋白组成且与肿瘤血管相吻合的微循环管道，其内可见流动的红细胞；存在VM的肿瘤很少发生中心性坏死，并且很少见到红细胞漏出和微血栓形成；VM多见于高侵袭性肿瘤中，而很少见于低侵袭性及良性肿瘤中。理论上，VM是肿瘤微循环的一部分，且与新生血管相吻合交通，为生长迅速的高侵袭性肿瘤提供了丰富的营养支持；VM管壁由肿瘤细胞直接构成，更有利于肿瘤细胞的远处转移。目前VM的生成机制尚不明确，可能的原因主要是：①肿瘤细胞自身方面：在VM形成过程中，肿瘤细胞由于基因型的改变而具有去分化能力，呈现出多潜能胚胎干细胞表型，从而具有自身的可塑性，使其能够模拟血管内皮细胞形成VM。②肿瘤微环境方面：首先，细胞外基质重塑在VM形成过程中起到了重要作用，而磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号转导通路是参与细胞外基质重塑的主要通路。其次，生长迅速的肿瘤会导致其微环境缺氧，缺氧可刺激缺氧诱导因子的过量表达，进而上调血管内皮生长因子A的表达和血管内皮生长因子的转录，进而诱导VM的形成[5-6]。此外，肿瘤组织液体间质压力、pH值、氧分压等诸多微环境因素也会诱导VM的形成。③肿瘤干细胞方面：肿瘤干细胞是一类特殊干细胞，具备高度的自我更新能力和多向分化潜能，既可以维持祖细胞数量稳定，又可以不断地分化成多种子代细胞来维持瘤体增长。近年越来越多的研究证明肿瘤干细胞参与了VM的形成。在三维培养下能形成VM结构的人眼黑色素瘤可表达肿瘤干细胞表型标志物CD271，未形成VM结构的人眼黑色素瘤却不表达CD271[7]。Yao等[8]认为肿瘤干细胞的相互作用改变了瘤体内的微环境，而微环境的改变又决定了肿瘤干细胞的分化方向，进而影响血管发生和血管拟态的形成。

2、VM的临床意义

VM存在于多种肿瘤中，提示肿瘤组织中VM的存在可能具有潜在的普遍意义，且存在VM的肿瘤预后较差。Sun等[9]在胃肠道间质瘤的研究中发现，VM阳性率高的肿瘤患者与VM阳性率低的患者相比，更易于发生肝转移，Kaplan-Meier生存分析揭示了VM是预后不良的影响因素。Cox比例风险模型更直接地提示了存在VM、肿瘤直径>10cm及出血均为肿瘤不良预后的独立预测因素。在肾脏透明细胞癌的研究[10]中发现，过表达基质金属蛋白酶MMP-2会导致VM的形成，且与临床分期、病理分级及远处转移呈正相关。长期以来，临床上抗肿瘤治疗以血管生成靶向治疗为主，但远期疗效不佳。Xu等[11]的研究表明，抗肿瘤血管生成抑制剂对VM无明显影响，反而药物诱导了VM结构的形成来促进肿瘤的转移。因此，抗肿瘤血管生成治疗也应考虑VM的存在。目前，已有学者致力于抗VM药物的研发。基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9是肿瘤中影响VM形成的重要因素[9]，沙利度胺可通过抑制MMP-2和MMP-9的表达来抑制VM形成的信号通路，进而改变肿瘤的营养供应方式[12]。Luan等[13]发现葡萄籽原花青素可以抑制三阴性乳腺癌中VM的形成。Guo等[14]的研究表明，人参皂苷Rg3可以通过下调血管内皮钙黏蛋白、上皮细胞激酶、MMP-2和MMP-9等信号通路蛋白来抑制胰腺癌VM的形成，进而改善患者预后。以上研究结果为肿瘤VM的靶向治疗提供了新的支持，但仍需要进一步的探究来明确其机制及疗效。

3、VM与影像学的关系

VM是肿瘤高侵袭性的独立预测因素之一，与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关，因此对VM的明确诊断及分析具有十分重要的临床意义。分子影像学是将特异性的分子探针导入体内，借助于多种模式的影像学方法来显示组织、细胞和亚细胞水平的特定分子，反映活体状态下分子水平的动态变化，进而定量、定性分析其生物学行为。由于VM是功能性管道，且与肿瘤的微循环相吻合交通，对比剂能够进入其中，这给各种影像学技术尤其是分子影像技术对其进行检测带来了希望。超声分子影像学是在体积小于红细胞的超声造影剂的表面结合特异性的亲和组件（如配体或抗体），通过配体-受体相互作用（或抗体-抗原相互作用）原理，在活体组织中与需要显像的靶组织特异性结合，以提高超声成像的敏感度和特异度。Liu等[15]认为聚乳酸是一种可以在表面连接乳腺癌特异性抗体抗Her2抗体（如赫赛汀）的纳米造影剂，它与过度表达Her2受体的乳腺癌细胞特异性结合。经流式细胞仪和共聚焦成像验证得出，Her2阳性细胞在与纳米颗粒孵育后大量着色，说明聚乳酸与乳腺癌细胞可以特异性地结合。高分辨率超声造影显示其强化程度与病理切片的VM结果一致。以上结果提示可以将放射性药物标记在赫赛汀上，让其与乳腺癌细胞特异性结合，达到靶向治疗的目的。因此超声分子影像学能通过靶向药物的浓聚情况来显示VM的特点，进而判断肿瘤的恶性程度及预测靶向治疗的效果。近年来MRI的临床应用已从病理解剖学水平逐步过渡到功能代谢以及分子生物学水平，是分子影像学的重要分支。MRI分子成像采用多参数、多序列、多方位成像技术对特定分子进行成像，可反映活体组织的功能信息及病变导致的功能变化，能够早期、准确地诊断疾病。与传统MRI的最大区别在于，其在传统MRI技术基础上，以特殊分子或细胞作为成像对象（靶结构），把非特异性物理成像转变为特异性分子成像。由于大分子MRI对比剂无法漏过血管壁，以前认为无法用血管造影术证实肿瘤中心的新生血管与VM之间存在着联接通路。随着大分子对比剂的研发及MRI技术的高速发展，使利用MR动态微血管造影显示肿瘤中心的血管和VM成为可能。Shirakawa等[16]将WIBC-9及MC-5肿瘤细胞接种于BALB/c裸鼠上，成功建立乳腺癌模型，并采用大分子MRI对比剂G6D-(1B4M-Gd)256对其行三维动态微MRI检查。G6D-(1B4M-Gd)256不能漏出血管壁，但是可以在微循环中持续30min。多个时间点的动态监测发现对比剂到达WIBC-9瘤内的速度以及浓聚速度快于MC-5肿瘤，而且WIBC-9瘤内信号强度高于MC-5肿瘤，且与病理切片的VM形态一致。电镜及免疫组化发现，WIBC-9瘤内存在VM-新生血管通路。除动物实验外，Yamamoto等[17]利用MRI的FLAIR序列在随访1例患者中发现其右侧额叶有轻微强化的高信号区，且与病理切片上VM的结果一致（图1A~F），提示VM的发现及显像对临床治疗具有一定的指导意义。光学分子成像是在生物体内引入合适的荧光探针，通过用特定波长的红光激发荧光染料，使其发出荧光，或引入报告基因，其表达产物可自发荧光，进而通过光学设备检测发射出的荧光并利用这些信息研究荧光分子的分布，从而记录和显示分子事件及动力学过程。Hillen等[18]利用转基因Tie2-GFP无胸腺裸鼠建立尤文肉瘤模型后观察到在瘤内同时存在肿瘤新生血管及VM，VM的管腔直径大于新生血管，且两者的管腔内均可观察到血液流动。尾静脉内注射若丹明后，在以上2种结构内均可见标记的白细胞。Liu等[19]利用生物发光发现异位表达抑制Hh信号通路蛋白可以阻碍VM的形成，而过表达抑制Hh信号通路蛋白可以使胶质瘤对替莫唑胺和环巴胺的敏感度增加。Fang等[20]的研究表明，3D培养肝癌细胞HCCLM9后发现，该细胞先存在于基质的表面，然后逐步迁移至基质的深处并形成管状、环形及网状结构，均提示肝癌细胞可形成VM。3个时间点的量子点荧光探针成像结果提示肝癌细胞内过表达膜型基质金属蛋白酶会导致树突状伪足向外生长，进而有助于VM的形成。将表达荧光素基因的肿瘤细胞移植到动物模型中，可以原位、动态地监测肿瘤细胞的定植、迁移及增殖过程，但该方法目前只能用于动物模型，还不能用于临床[21]。血管拟态的发现改变了人们对肿瘤血供的传统认识，为高侵袭性肿瘤的治疗提供了新的指导信息，但是VM的研究尚处于探索阶段，还有许多问题亟待解决，如恶性程度不同的肿瘤形成VM的能力不同及其机制、VM和肿瘤新生血管是否有共同靶点、VM怎样与肿瘤新生血管相连接等。随着研究的不断深入，VM的调控机制、解剖及功能特点会逐步明确。分子影像学在VM的研究中遇到很多困难，最亟待解决的是缺乏特异性分子靶点将VM与肿瘤新生血管区分开，从而造成分子靶向对比剂的研发困难，这可能是将来影像学研究发展的方向之一。综上所述，VM是由细胞外基质界定的微循环管道，它是由肿瘤细胞围绕形成，与肿瘤的转移和不良预后密切相关。由于VM是功能性管道，其与肿瘤的微循环相通，对比剂能够进入其中，这给各种影像学技术对其进行检测带来了希望。影像学具有方便、快捷、无创和可重复性等特点，不仅能通过显示瘤体内微循环灌注及VM特点来初步判断肿瘤的分级，还可初步预测放射靶向治疗的疗效，为不同的肿瘤提供治疗指导方针及预后判断。

作者：许立功 吴爽 张景峰 阮凌翔