口腔细菌代谢产碱及其分子生物学研究进展

【摘要】口腔细菌代谢产碱对牙菌斑生物膜菌群平衡和酸碱平衡极其重要，口腔中唾液和细菌的代谢产碱水平与龋病的发生呈负相关。口腔中代谢产碱是由多细菌多途径组成的复杂体系，受诸多环境因素的密切调控。本文就生物膜中细菌代谢产碱的主要途径、生物膜中细菌代谢产碱与龋病的关系、口腔细菌代谢产碱的分子生物学研究进展等作一综述。

【关键词】龋病；牙菌斑；口腔细菌；代谢产碱

【中图分类号】R780.2

【文献标志码】A

牙菌斑生物膜是定植于牙表面的微生物群落，其与宿主防御之间存在着动态平衡，且与定植部位相适应。牙菌斑生物膜的细菌组成和代谢与龋病和牙周病关系密切。牙菌斑生物膜中糖源物质的摄入，致变异链球菌和乳杆菌等菌群产酸和耐酸菌并过度生长形成优势菌群，牙菌斑内pH迅速下降至临界值，从而引起牙齿脱矿。过去普遍认为，细菌产酸是龋病发生的直接原因。有学者认为，牙菌斑生物膜中耐酸菌比例的增加和口腔非耐酸性益生菌比例的减少是导致龋病的重要原因。当下的研究却发现，大部分的口腔益生菌都具有精氨酸脱亚氨酶系统（arginine　deiminase　system，ADS）或者尿素酶系统，可利用精氨酸或尿素为底物产碱，细菌代谢产碱可积极地调控牙齿脱矿与再矿化之间的平衡，阻止产酸和耐酸菌形成优势菌群，从而防止致龋性牙菌斑生物膜的形成。

研究显示，龋病与口腔微生物的产碱能力降低密切相关，调控牙菌斑生物膜中细菌代谢产碱的能力可作为一种有潜在应用前景的防龋策略。随着细菌代谢产碱的能力与龋病呈负相关性的结论不断地得以证实，越来越多的研究者开始关注牙菌斑生物膜中细菌代谢产碱的细菌学和分子生物学等基础和临床研究。本综述着重介绍口腔细菌代谢产碱的分子生物学研究进展，为未来的研究方向提供线索。

1　生物膜中细菌代谢产碱的主要途径

牙菌斑生物膜中细菌代谢产碱最主要的两大途径包括尿素酶和ADS。尿素在健康人群口腔中的浓度为3～10mmol·L-1，主要来源于唾液和龈沟液。尿素在口腔中可以被细菌尿素酶迅速分解并产生氨、二氧化碳和水。具有尿素酶活性的细菌包括唾液链球菌和内氏放线菌以及口腔嗜血菌属等。相对于尿素，精氨酸在口腔中的平均浓度仅为50μmol·L-1。精氨酸可以被细菌ADS分解代谢为鸟氨酸、氨、二氧化碳和腺苷三磷酸（adenosine　triphosphate，ATP）。与尿素分解代谢不同的是，精氨酸代谢还为细菌提供了ATP，因此赋予了细菌额外的生长能量优势。多种口腔微生物均具有ADS，包括血链球菌、格氏链球菌和副血链球菌以及某些种类的乳杆菌属细菌和螺旋体。

精胺代谢是口腔中的另一条碱代谢途径。与尿素和精氨酸代谢相比较，精胺代谢酶活性较弱。精胺是精氨酸在细菌精氨酸脱羧酶作用下产生的中间代谢产物，也可来源于一些食物。精胺在牙菌斑生物膜和唾液中的浓度分别为0.75和0.2mol·L-1。精胺在细菌鲱精氨酸脱亚氨酶系统（agmatine　deiminase　system，AgDS）的作用下产生腐胺、氨、二氧化碳和ATP。该系统与ADS具有高度同源性。基因组分析和功能研究表明，AgDS存在于包括变异链球菌、表兄链球菌、汗毛链球菌、大鼠链球菌、链球菌、缓症链球菌和仓鼠链球菌以及唾液乳杆菌和短乳杆菌在内的众多口腔细菌中，其中大量的细菌与龋病密切相关。目前在所有具有AgDS的细菌中，仅大鼠链球菌、血链球菌和唾液链球菌等益生菌同时具有ADS和尿素酶系统。

2　生物膜中细菌代谢产碱与龋病的关系

有报道称，慢性肾功能衰竭患者唾液中的尿素水平较健康人高50倍，即使高糖饮食，其患龋率明显低于健康人群。Nascimento等发现：无龋人群的牙菌斑整体碱活性明显高于龋活跃人群；成年人非龋易患者唾液中的尿素酶活性是龋易患者的3～5倍，牙菌斑中的精氨酸脱亚氨酶活性是龋易患者的2倍。有报道称，儿童非龋易患者的牙菌斑尿素酶活性是龋易患者的2倍，唾液尿素酶活性是龋易患者的3倍，而且牙菌斑精氨酸活性是龋易患者的2倍。还有报道称，在牙膏或漱口液中加入精氨酸类化合物可降低人群的龋失补牙指数。上述研究均表明，牙菌斑生物膜中的细菌代谢产碱水平与龋病的发生呈负相关性。

3　生物膜中细菌代谢产碱的分子生物学研究

3.1尿素酶

口腔细菌代谢产碱途径的分子生物学研究最早开始于尿素酶，以前的综述中已经有详细的介绍。尿素酶是一种含镍的低聚物酶，编码尿素酶的7个基因排列成操纵子结构，ureC、A、B基因翻译产生α、β和γ三个亚基组成（αβγ）3结构，ureDEFG编码的辅助蛋白用于镍离子的整合和酶的激活。在有关口腔细菌尿素酶的研究中，唾液链球菌和内氏放线菌尿素酶的生物学特性及其基因表达调控的研究最为深入。这两种细菌的尿素酶有许多相似之处，均受多种环境因素的影响。以内氏放线菌为例，其尿素酶的活性在酸性环境下和有大量糖类物底物时增强，同时其酶活性也依赖于环境中氮源底物的量。值得注意的是，这些因素均与龋病密切相关；因此，Burne等提出当宿主处于患龋高风险时，唾液链球菌和内氏放线菌的尿素酶能够为防止龋病的发生发挥积极的作用。

3.2精氨酸脱亚氨酶系统

原核生物中广泛存在着ADS，该系统酶具有保守的一级结构。编码ADS的多个基因通常排列组成操纵子结构，但是其基因的排列顺序在不同的细菌间存在着差异。arcA基因负责编码精氨酸脱亚氨酶，这种酶可水解精氨酸生成瓜氨酸和氨。arcB基因编码一种分解代谢性鸟氨酸氨甲酰基转移酶，可将瓜氨酸转化为鸟氨酸和氨甲酰磷酸。位于arcB基因下游的arcC基因编码一种分解代谢性的氨甲酸酯激酶，后者可将氨甲酰磷酸的一个磷酸基团转移给腺苷二磷酸，从而生成ATP、二氧化碳和氨。此外，许多具有ADS的细菌，其操纵子中还存在一种编码精氨酸和鸟氨酸反向转运蛋白的arcD基因；精氨酸氨肽酶和相关转录调控子也是由ads基因簇中的基因编码。在具有ADS的细菌中，格氏链球菌是唯一由精氨酸脱亚氨酶arc操纵子与queA基因相连并共转录的细菌，这种基因被预测编码一种修饰tRNA的S－腺苷甲硫氨酸：tRNA核糖转移酶异构酶，后者与ADS转录调控子arcR共转录。

目前，已有众多关于口腔链球菌和非口腔细菌ads基因调控机制的研究报道。在口腔细菌中，ads基因的组成和调控研究主要集中在格氏链球菌、血链球菌和大鼠链球菌。虽然，ADS在不同细菌中的表达均受到多种环境因素的调控，如pH值、糖源、氧分压和精氨酸等，但是细菌间调控模式和机制却不完全相同。以格氏链球菌为例，其ADS主要受精氨酸和低pH值诱导，但是碳源性分解代谢物阻遏和高氧分压对精氨酸脱亚氨酶活性可产生抑制。这些环境因素对ADS的调控主要作用在转录水平，环境因素的调控作用主要通过多种调控蛋白质和多个双组分系统的交叉协同作用来实现。精氨酸对ADS　arc基因转录的诱导作用主要通过ArcR进行调控；酸性环境诱导arc基因转录主要通过ArcR以及VicRK、CiaRH和ComDE的共同作用；碳源性分解代谢物对ADS的阻遏作用，则是通过宏观调控碳代谢蛋白质（carbon　catabolite　protein　A，Ccp-A）实现的；高氧分压的环境信号则通过Fnr样蛋白Flp与双组分系统VicRK的协同作用，实现对精氨酸脱亚氨酶转录的抑制。此外，QueA对arc基因转录的影响整体表现为抑制作用，可能与影响了ads基因或其调控基因的转录效率有关。细菌间相互作用，如格氏链球菌在与内氏放线菌细胞共聚集的状态下，细菌内源性精氨酸的生物合成被激活，也可导致ADS的活性增强。

3.3鲱精氨酸脱亚氨酶系统

AgDS并非如ADS那样在微生物细胞中广泛存在。除部分口腔细菌以外，目前只在粪肠球菌、铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌、希氏乳杆菌和幽门螺杆菌等少数几种细菌中发现了AgDS。与ADS一样，AgDS的基因也通常以aguBDAC操纵子的形式排列。精胺依靠一种精胺－腐胺反向转运蛋白D（agmatine-putrescine　antiporter　D，AguD）进入细胞，并在aguA基因编码的鲱精氨酸脱亚氨酶作用下水解为N－氨甲酰腐胺和氨，而N－氨甲酰腐胺又经aguB基因编码的腐胺氨甲酰基转移酶代谢生成腐胺和氨甲酰磷酸。最终，aguC基因编码的氨甲酸酯激酶将氨甲酰磷酸的一个磷酸基团转移给腺苷二磷酸，从而生成ATP、二氧化碳和氨。腐胺可以在反向转运蛋白作用下交换细胞外的精胺。agu基因的转录调控子由位于agu操纵子上游相反方向的aguR基因编码。

尽管AgDS的活性在口腔链球菌中存在着较大的差异，但其总体活性明显低于细菌ADS和尿素酶系统；尽管在变异链球菌和大鼠链球菌中检测到的AgDS与ADS的活性相似，但仓鼠链球菌和表兄链球菌AgDS却较其ADS的活性低50倍以上。在所有口腔细菌的AgDS活性当中，关于变异链球菌AgDS的研究最为深入细致，变异链球菌AgDS对细菌生长及耐受环境压力有着重要的意义。研究显示，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶缺陷株的生长速度明显慢于野生株。Burne等也曾报道，当变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶活性表达受到抑制时，其耐受酸、氧气和超氧化物的能力明显降低。

变异链球菌AgDS的活性表达受到细菌生长和多种环境因素的影响，其影响主要作用于细菌鲱精氨酸脱亚氨酶的转录水平。变异链球菌AgDS的表达同时依赖外源性底物精胺的供给。在仅有10mmol·L-1外源性精胺供给的情况下，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达可增高5倍。外环境pH值也是影响变异链球菌精胺脱亚氨酶表达的重要因素之一。刘娅玲等利用口腔恒化器模型研究发现，在pH5.5的酸性环境下，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达水平是pH7.0的中性环境下酶活性的3倍；同时，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达水平与细菌生长环境中的氧分压密不可分。氧气对变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达具有明显的抑制作用，当变异链球菌在无氧条件下培养时，其鲱精氨酸脱亚氨酶的表达是有氧培养条件下的3倍。

变异链球菌的AgDS活性依赖于细菌的生长周期，变异链球菌的AgDS在细菌对数生长早期表达较低；随着细菌进入对数生长中期，其酶活性表达逐渐增高；当细菌生长到达静止期时，其酶活性表达最高。此外，热刺激效应也可促进变异链球菌的AgDS活性表达。变异链球菌在44℃的条件下生长，其AgDS的活性表达是37℃条件下的2倍。变异链球菌AgDS的基因表达亦受到碳源性分解代谢产物的抑制。作为典型的抑制性糖源，葡萄糖对变异链球菌的AgDS具有较强的抑制作用；而当半乳糖作为糖源时，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的活性是葡萄糖作为糖源培养条件下的5倍。

在变异链球菌中，众多环境因素对AgDS的调节作用是通过多种调控通路的交叉以及多种调控蛋白质的交互作用来完成的。研究显示，AguR作为agu操纵子的主要调控蛋白质，参与低pH和底物精胺对AgDS的调控作用。刘娅玲等发现：AguR是一种位于变异链球菌细胞膜中的跨膜蛋白质，包括4个跨膜结构域，蛋白质C-末端可能位于细胞内；AguR蛋白在激活时会产生变构裂解，最终与agu操纵子结合启动agu的转录。除此之外，AguR调控蛋白与AguD精胺转运蛋白的相互作用是调控agu转录的关键。在低pH值和精胺存在的条件下，AguR调控蛋白可与AguD精胺转运蛋白发生交互作用，从而诱导AgDS的表达。AguR与精胺结合导致AguR的变构激活，从而促进AguR与其靶标agu操纵子结合。酸性环境有利于AguR形成合适的蛋白质构型，使其对靶DNA的信号转导更加高效。在缺乏外源性精胺的情况下，AguR与AguD的相互作用可能会阻止AguR与其底物或靶标的结合。该项研究结果对阐明AgDS的调节机制具有重要意义。除AguR和AguD以外，其他多种宏观调控蛋白和双组分系统也都同时参与了对变异链球菌AgDS的调控作用。CcpA和CcpB作为主要的碳源性分解代谢物阻遏调控蛋白，是不同碳源底物调节AgDS转录的主要调控蛋白。包括CiaRH、ComDE和VicRK在内的多个双组分系统都共同参与了低pH条件下AgDS的诱导，而且CiaRH同时也是变异链球菌感受外界热刺激效应下AgDS优化表达的重要调控因子。目前，虽然有研究例证实双组分系统之间存在交叉调控和串话现象，但外界环境信号是通过怎样的具体途径传导诱导AgDS表达仍需深入研究。

4　结束语

综上所述，口腔是一种多种环境因素不断波动且呈动态平衡的生态环境。定植于口腔中的细菌需要根据环境因素的变化，不断在基因表达水平调节其自身的生理机制以适应生存需要。口腔细菌代谢产碱作为基本的生理代谢途径不仅有助于维持菌细胞内的酸碱平衡，提供细菌生长所需能量，而且对于稳定整个牙菌斑生物膜菌群平衡和酸碱平衡以及防止龋病的发生都具有重要的意义。上述研究为人们了解口腔细菌碱代谢途径的分子生物学特征和调控机制提供了大量的宝贵线索，所构建的高活性碱代谢突变株对于深入研究基因功能和构建商品化口腔益生菌群用于龋病防治具有重大的意义；但是，细菌感受环境因素变化所产生的信号传导以及分子间交叉调控网络的分子机制尚不清楚，如何优化细菌的代谢产碱能力与生存竞争能力仍需大量的研究，如何利用产碱基因改造口腔致病菌从而降低其致病毒力也是目前需要继续深入研究的课题。可以预见，利用细菌代谢产碱系统将会为龋病的生态失衡防治开辟一条崭新的途径。