儿童IM与ALL基因遗传研究

儿童传染性单核细胞增多症( infectious mono-nucleosis，IM) 是 EB 病毒( epstein-barr virus，EBV)感染所致的急性传染病，其发病机制尚未完全阐明近年的研究提示 EBV 对个体的影响存在不同的遗传易感性，与某些基因多态性有关［1］。急性淋巴细胞白血病( acute lymphocytic leukemia，ALL) 是造血系统的恶性增生性疾病，其发病因素可能与病毒、理化因素、遗传易感性等有关。谷胱甘肽硫转移酶( glutathione S-transferase，GST) 是体内重要的解毒酶系，该酶系中许多成员的编码基因具有多态性，基因的变异可以改变相应的酶激活或灭活异源底物的能力，可能增加暴露个体罹患疾病的危险性。其中的 GSTT1( 编码 θ) 、GSTM1( 编码 μ) 基因在人群中呈多态性分布。已证实 GSTT1、GSTM1 基因多态性与多种恶性肿瘤的易感性有关［2-3］。然而，其在儿童IM 发病中的作用尚不明确，本研究检测 ALL 与 IM患儿 GSTT1 及 GSTM1 基因多态性，分析 GSTT1 及GSTM1 基因多态性在对照组、IM 组与 ALL 组间的差异，为深入了解二者在儿童 IM、ALL 致病机制中的作用、保护易感人群及针对性个体防治方面提供依据。

1 资料与方法

1． 1 研究对象

2008 年 10 月至 2010 年 12 月在深圳市人民医院儿科住院治疗的、根据临床表现、外周血血液细胞形态及 EBV 抗体血清学检测确诊为 IM 的患儿106 例为 IM 组，其中男 56 例，女 50 例，年龄 2 ～ 14 岁( 中位年龄 6． 2 岁) 。2005 年 10 月至 2010 年 12 月于深圳市人民医院儿科住院治疗、根据骨髓细胞形态学、免疫学检查及分子生物学检查确诊 ALL 的患儿，其中 EBV 抗体血清学检测阳性的患儿予以剔除，共 41 例为 ALL 组，其中男 25 例，女 16 例，年龄2 ～ 13 岁( 中位年龄 5 岁) 。按住院号随机抽取与IM 组儿童同期住院的非血液系统性疾病、非肿瘤疾病患儿100 例为对照组，男55 例，女45 例，年龄1 ～14 岁( 中位年龄 6． 6 岁) 。

1． 2 研究方法

在取得患儿家长知情同意的情况下抽取外周血5 mL，EDTA 抗凝。提取基因组 DNA，分光光度计测定纯度，定量后冰冻待用。利用多重等位基因特异聚合酶链式反应( PCR) 方法检测 GSTT1 与 GSTM1基因型，以白蛋白基因阳性为内参照，同时进行扩增。序列及扩增片段大小见表 1。GSTT1 的 PCR 反应条件: 94℃ 预变性 5 min; 然后按 94℃ 变性 45 s，59℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 1 min，共 30 个循环; 最后72℃ 再延伸 7 min。GSTM1 的 PCR 反应的条件:94℃ 预变性 4 min; 然后按 94℃ 变性 1 min，59℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，共30 个循环; 最后72℃再延伸 7 min。PCR 产物经 2%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统中成像。

1． 3 基因型的判断

根据文献［1］，以出现白蛋白基因内参照片段( 350 bp) 为 PCR 扩增成功的标志。GSTT1 非纯合缺失基因型( GSTT1( + / + ) or( + / － )) 与 GSTM1 非纯合缺失基因型 ( GSTM1( + / + ) or( + / － )) 的 DNA 模板经PCR 扩增后分别产生 480 bp 与 219 bp 片段，而GSTT1 纯合缺失基因型( GSTT1( － / － )) 与 GSTM1 纯合缺失基因型( GSTM1( － / － )) 无特异性片段，仅出现内参照片段。

1． 4 统计学分析

采用 SPSS 16． 0 软件进行统计学分析。组间基因型分布比较采用 χ2检验; 应用多因素非条件logistic回归计算相对风险度的比值比( OR) 和 95%可信区间( CI) 。P ＜0． 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2． 1 IM 组与对照组 GSTT1 和 GSTM1 基因多态性分布情况比较

IM 组与对照组性别、年龄差异无统计学意义( P＞ 0． 05) 。GSTT1 纯合缺失基因型在 IM 组的分布频率明显高于对照组，差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) ;携带 GSTT1 纯合缺失基因型的患儿发生 IM 的风险是携带 GSTT1 非纯合缺失基因型个体的 2．186 倍( OR =2．186，95%CI: 1． 251 ～ 3． 821) ; GSTM1 纯合缺失基因型在 IM 组和对照组的分布频率差异无统计学意义( P ＞0．05) 。GSTM1/GSTT1 基因联合缺失型个体发生 IM 的风险是非联合缺失型个体的 4．937 倍( OR =4．937，95%CI: 2．455 ～9．928) 。见表2。

2． 2 ALL 组与对照组 GSTT1 和 GSTM1 基因多态性分布情况比较

ALL 组与对照组性别、年龄差异无统计学意义( P ＞0． 05) 。GSTT1 纯合缺失基因型在ALL 组和对照组的分布频率差异无统计学意义( P ＞0． 05) ; ALL 组GSTM1 纯合缺失基因型分布频率明显高于对照组，差异有统计学意义( P ＜0． 05) 。携带 GSTM1 纯合缺失基因型的患儿发生 ALL 的风险是携带 GSTM1 非纯合缺 失 基 因 型 个 体 的 2． 242 倍 ( OR =2． 242，95% CI: 1． 042 ～ 2． 821) 。GSTM1 / GSTT1 基因联合缺失型个体发生 ALL 的风险是非联合缺失型个体的8． 552倍( OR = 8． 552，95% CI: 3． 660 ～ 19． 979) 见表 3。

2． 3 IM 组与 ALL 组 GSTT1 和 GSTM1 基因多态性分布情况的比较

IM 组与 ALL 组性别、年龄差异无统计学意义( P ＞ 0． 05) 。GSTT1 纯合缺失基因型在 IM 组和ALL 组的分布频率差异无统计学意义( P ＞ 0． 05) ;GSTM1 纯合缺失基因型在 IM 组和 ALL 组的分布频率差异无统计学意义( P ＞ 0． 05) 。GSTM1/GSTT1基因联合缺失型在 IM 组和 ALL 组的分布频率分别为 42． 5%、56． 1%，差异无统计学意义( P ＞0． 05) 见表 4。

表 4 IM 组与 ALL 组 GSTT1 和 GSTM1 基因型分布比较 ［例( %) ］组别 例数GSTT1null Non-nullGSTM1null Non-null双缺失IM 组 106 67( 63． 2) 39( 36． 8) 56( 52． 8) 50( 47． 2) 45( 42． 5)ALL 组 41 24( 58． 5) 17( 41． 5) 28( 68． 3) 13( 31． 7) 23( 56． 1)χ2值 0．27 2． 89 2．21P 值 ＞ 0． 05 ＞ 0． 05 ＞ 0． 05注: null 示纯合缺失基因型( GSTT1/M1( － / － )) ; Non-null 示非纯合缺失基因型( GSTT1/M1( + / + ) or( + / － )) ; 双缺失示 GSTT1( － / － )伴有 GSTM1( － / － )。

3 讨论

GST 参与生物转化的Ⅱ相代谢，催化还原型谷胱甘肽( 由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成的三肽)与亲电物质( 各种环境致癌物、污染物、药物和其他宾主共栖物) 发生轭合反应，从而降低该亲电物质的活性、加速其排泄，达到解毒的效果。其催化反应的底物包括致癌剂、化疗药物和氧化反应中产生的自由基等。GSTT1、GSTM1 基因多态性因种族和地域分布而有所差异，本研究结果显示，对照组中GSTT1、GSTM1 纯合缺失基因型频率为 44． 0% 、49． 0% ，与国内相关文献报道相符［4-5］。

GSTT1 纯合缺失基因型在 IM 组和对照组的分布频率组间差异具有统计学意义; 携带 GSTT1 纯合缺失基因型的患儿发生 IM 的风险是携带 GSTT1 非纯合缺失基因型个体的 2． 186 倍; 提示 GSTT1 纯合缺失基因型为儿童患 IM 的危险因素，GSTT1 纯合缺失基因型儿童 IM 易感性较高。分析原因可能是: ① GSTT1 底物包括被氧化的脂质和 DNA 等。

由于整个 GSTT1 基因编码区缺失，使其相应的GST θ 同工酶活性减低甚至缺如，全身各器官特别是淋巴组织抵御活化的 T 细胞及 B 细胞的能力下降，更容易出现 IM 的各种临床表现; ② 不同的 GST 最适宜底物不同，在机体生物转化过程中作用不一，GSTT1 不仅存在于肝脏中，还存在于红细胞中，使得红细胞成为一个解毒场所，在 IM 致病过程中，GSTT1 可能比 GSTM1 承担着更重要的角色［6］。儿童 IM 组的 GSTM1 纯合缺失基因型分布频率与对照组之间比较差异无统计学意义，未发现 GSTM1 基因多态性与 IM 易感性之间有显著相关性。可能是因为 GSTM1 基因及其代谢底物在 IM 的发生过程中未发挥关键作用。GSTM1/GSTT1 基因联合缺失型个体发生 IM 的风险明显升高，考虑 GSTT1 与 GSTM1 可能存在协同作用。当 GSTM1/GSTT1 基因联合缺失时，体内 GSTM1/GSTT1 编码产物活性较单一缺失者更低，发生 IM 的风险更高。

本研究显示 GSTM1 纯合缺失基因型在 ALL 组和对照组的分布频率组间差异有统计学意义; 携带GSTM1 纯合缺失基因型的患儿发生 ALL 的风险升高; GSTT1 纯合缺失基因型在 ALL 组和对照组的分布频率组间差异无统计学意义; GSTM1/GSTT1 基因联合缺失型个体发 生 ALL 的 风 险 升 高。提 示GSTM1 基因多态性与 ALL 易感性显著相关，与文献报道一致［2］。当 GSTM1/GSTT1 基因联合缺失时，ALL 易感性更强。考虑原因为: GSTM1 基因代谢底物包括多环芳香族碳氢化合物( PAH) 、烟草、环氧化物等，这些物质均可以与机体 DNA 结合，形成DNA 加合物，从而引起细胞遗传物质损伤，引发恶性肿瘤的发生［7］。研究发现，GSTM1 纯合子缺失者的肺、、外周血白细胞存在高水平的 PAH-DNA加合物，显著高于 GSTM1 杂合基因存在者，其遗传物质更易发生恶性转化［8］。有关 GSTT1 缺失基因型是肿瘤易感基因的研究结果并不完全一致，张利等［2］研究结果表明，GSTT1 纯合缺失基因型与 ALL发生无关; Chan 等［9］的研究结果提示，GSTT1 纯合缺失型女孩发生 ALL 的风险增高 ( OR = 2． 20;P = 0． 027) 。本研究结果显示 GSTT1 纯合缺失基因型在 ALL 组和对照组分布频率组间比较差异无统计学意义，但发现 GSTT1 纯合缺失基因型在 ALL 组中分布频率( 58． 5%) 高于对照组( 44． 0%) ，提示GSTT1 缺失基因型在 ALL 发病中也可能发挥一定的作用，其基因型分布频率与对照组比较差异未达统计学意义可能与样本量小及其他因素有关。当GSTM1 / GSTT1 基因联合缺失时，发生 ALL 风险比单一 GSTM1 缺失时更高，亦提示 GSTM1 和 GSTT1基因编码产物很可能存在协同作用。

IM 组与 ALL 组在 GSTT1 基因缺失、GSTM1 基因缺失及 GSTM1/GSTT1 基因联合缺失的组间差异均无统计学意义，提示 GSTM1/GSTT1 基因编码产物在 IM 及 ALL 发病过程中可能都发挥了作用，两者可能存在共同的发病机制。GSTT1/GSTM1 基因联合缺失可能在共同机制中发挥一定作用，考虑可能与 GSTT1/GSTM1 基因编码蛋白在 EBV 感染及引起 B 细胞转化过程中有一定作用有关，但未见有相关文献报道，这方面仍需进一步研究。