人肾细胞生长分化过程中miRNA表达量的变化分析

【摘要】 目的:分析特定miRNA在人肾细胞生长分化过程中的变化,以及miRNA在肾细胞癌发病进展中的作用。方法:建立人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293总RNA库,通过小分子RNA深度测序技术,确定人肾细胞生长、分化过程中miRNA的表达谱,并分析特定miRNA在人肾细胞生长分化过程中的变化。结果:miR-16、21、29a/b、27a、374a等miRNA在肾癌细胞分化过程中表达量下调超过两倍,而miR-368则有显著上调。在人胚肾细胞对数生长期,miR-142、16、32、20a、19a、196b等显著上调;而在接触抑制生长期,miR-19b与miR-92a显著上调,而miR-142与miR-196b则显著下调。结论:miR-16在人肾细胞的生长分化过程中起了相反的作用,miR-196b则对于维持人肾细胞的正常生长具有重要影响。本研究为明确miRNA对于人肾细胞以及肾细胞癌的生长、发育和抑制机制奠定了基础。

【关键词】 Micro-RNA; 人肾细胞癌; 深度测序技术

Micro-RNA(miRNA)是一类由22~23个核苷酸组成的短分子RNA,能在转录和翻译后水平调节各类基因。miRNA广泛作用于细胞生长、发育、代谢、凋亡等多种生物反应进程, 其表达量的改变与多种疾病直接相关[1-2],是近十年来生命科学领域的研究重点和热点之一。利用新的生物学技术与计算机技术探索和发现新的miRNA、研究miRNA表达谱、确定miRNA作用靶标以及研究体内miRNA表达等,是目前miRNA研究的重点,旨在揭示miRNA在生命进程与疾病中起到的重要作用。

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC),起源于肾脏的肾小管或集合管的上皮细胞,具有不同的病理类型,其发病原因还不十分明确[3]。miRNA在肾的正常发育、肾细胞癌病变过程中的作用还没有明确的报道,需要深入研究。笔者利用小分子RNA深度测序技术[4],在培养的人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293中建立了相应的miRNA表达谱,分析与人胚肾细胞正常生长于癌细胞分化过程定miRNA的表达差异,为揭示miRNA在相应过程中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293购自中科院上海细胞所。

1.1.2 RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司,DMEM培养基购自GIBCO公司,其他相关生物材料与试剂由国内生物公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养 常规条件培养HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293,37 ℃,5%CO2,DMEM培养基培养。

1.2.2 RNA的提取 提取细胞总RNA前,弃培养基上清,加入PBS洗两次,弃去PBS后,加入Trizol,刮下细胞,按说明书步骤提取细胞总RNA,整个RNA提取过程,在低温或者冰上进行,以减少RNA降解。

1.2.3 小分子RNA的深度测序 提取实验组细胞总RNA跑胶回收30 bp以下小分子RNA,在5’和3’分别加上一对Solexa Adaptor,这些小分子RNA再用Adaptor引物经17个循环的扩增,回收90 bp(小分子RNA+Adaptor)左右片段,送武汉华大基因生物公司测序。

2 结果

2.1 人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1分化不同阶段miRNA表达量变化 人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1分化的不同阶段,多数miRNA表达量(拷贝数)相对恒定,这些表达量恒定的miRNA具有维持正常细胞功能的作用。而miR-16,21,29a/b,27a,424/322簇,99b,374a等miRNA在HRC-DH1细胞分化过程中,表达量下降,降幅超过2倍,miR-368则有两倍以上的表达量增加(表1)。这种表达量变化,与分化时间,即分化程度相关(图1)。

2.2 人胚肾细胞细胞系HEK293不同生长状态miRNA表达量变化 培养人胚肾细胞细胞系HEK293细胞,分别收获正常生长状态、指数生长期和接触抑制期的细胞,提取总RNA进行小分子RNA深度测序。结果显示,不同生长状态下,特有miRNA表达量有显著变化,见表2。在对数生长期状态下,miR-142、16、32、92a、424/322簇、20a、19a、10a等miRNA有两倍以上表达量上升,提示这些miRNA在细胞快速生长过程中起到重要作用。相对于对数生长状态,接触抑制生长状态下的HEK293细胞其miR-142、32、19a、196b和10a等miRNA表达量有一定程度减少,其中miR-142下降幅度超过2倍,见图2。

3 讨论

目前发现的人类miRNA已超过1000种,越来越多的miRNA的确切功能正逐渐被确定。如miR-133a参与肌细胞发育,内皮细胞,血管构造,功能及血管再生等。miRNA同样也参与了复杂的疾病调控,如miR-378,miR-296等调控肿瘤血管生成。心室肥厚、心律紊乱、心力衰竭等心脏疾病中也存在miRNA的调控作用[5],但是miRNA在肾的正常发育、肾细胞癌病变过程中的作用还没有明确的报道。本研究发现,特定miRNA在肾细胞不同生长状态,或不同分化状态下表达量呈现一定规律。如上所述miR-16、21、29a/b、27a、424/322簇、99b、274a等miRNA在HRC-DH1细胞分化过程中,表达量下降,降幅超过2倍,而miR-368则有两倍以上的表达量增加。但其中miR-21、29b、27a、29a、374a在HEK293细胞生长状态下则检测到的拷贝数很低,亦无明显表达量的改变,因此推测这类miRNA可能为与肾癌细胞的分化相关,与人胚肾细胞生长关系不紧密。相反,miR-142、19b、32、92a、20a、19a、196b与10a等miRNA则在人胚肾细胞生长过程中起到一定作用,而在肾癌细胞分化过程中作用不明显。