纤维发酵改进

引言

1996年，德国国家生物技术研究中心首次报道了从纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)分离到EpothiloneA和B［1］，随后研究者发现Epothilones具有类似紫杉醇促进微管蛋白聚合的活性［2，3］，其活性是紫杉醇的2000～3000倍，且水溶性好、结构简单，因此，吸引了越来越多人的注意［4，5］。目前，美国、以色列等实验室开始从事这方面的研究工作，而国内主要是山东大学、华南理工等做了一些相关研究。2007年，施贵宝公司开发的EpothiloneB衍生物Ixabepilone获得FDA批准在美国上市，在治疗乳腺癌方面具有明显的效果［6］。化学法可合成EpothiloneB，但其具有反应条件要求高、成本高、产率低以及污染大等缺点，因此工业发酵制备EpothiloneB是首选生产方式。但目前纤维堆囊菌So.ce90菌的产量低(22mg/L)，产量很不稳定，虽然在发酵过程中通过补料方式等方式可以提高Epothilones的产量，但微克级的产量给其开发及应用带来了困难［7］。因此，菌种的筛选、选育以及发酵条件的探索仍然是粘细菌科研工作者需要研究的重点目标之一。作者实验室从土壤中筛选到1株产EpothiloneB的纤维堆囊菌AHB125［8］。该论文主要采用紫外线作为诱变剂，含有EpothiloneB合成前体物质乙酸钠的培养基对诱变株进行抗性筛选，并对选育出的1株突变株进行发酵条件研究。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验材料:纤维堆囊菌AHB125(SorangiumcellulosumAHB125)，作者实验室分离、保存。

1.1.2试剂:EpothiloneB标准品，Sigma公司;酵母粉、蛋白胨(AR)，北京奥博星公司;脱脂奶粉，雅鹿集团有限公司;葡萄糖/无机盐、乙酸钠等(AR)，国药集团生产;XAD－16大孔树脂，罗门哈斯公司。

1.1.3仪器HPLC1100，安捷伦公司;LS－B50型灭菌器，上海博迅设备厂;HYG－11型恒温摇床，上海新星设备厂。

1.1.4培养基CY培养基(g/L):酪胨3.0，酵母浸膏1.0，CaCl21.0，琼脂粉16.0。种子培养基(g/L):土豆淀粉10.0，葡萄糖2.0，酵母2.0，脱脂奶粉4.0，CaCl21.0，MgSO47H2O1.0，Fe(Ⅲ)－Na－EDTA0.008。发酵培养基(g/L):在种子培养基中加入XAD－16大孔树脂20.0，甘油5.0。以上培养基用10%KOH调pH值至7.2～7.4，121℃灭菌20min。1.2材料1.2.1紫外诱变用无菌水将生长于CY培养基上So.cellulosumAHB125菌体洗下，并制成浓度为1～5×107个/mL的菌悬液，取10m于直径9cm的无菌培养皿中，在磁力搅拌下，采用15W紫外灯距离20cm进行照射，分别于20s、40s、60s、80s、100s和12s取出500μL菌液，将对照菌液和诱变菌液分别稀释103、104105倍，取100μL均匀涂布于CY固体培养基上，每个浓度3次重复，30℃培养72h，观察菌落数，计算致死率。

1.2.2变异菌株的筛选选择最佳诱变时间的菌液100μL，均匀涂布于含有2%乙酸钠的CY培养基上，30℃培养72h，测定每个菌落的EpothloneB生产能力。

1.2.3EpothiloneB的发酵与测定CY培养基上的菌落转接到已灭菌的含有30mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃、150r/min培养2d。取种子液1mL加入至含有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中，30℃150r/min培养5d。发酵结束后，取出XAD16树脂，用水洗涤过滤，晾干，放入摇瓶中，加入5倍体积的甲醇解析12h，解析液用0.22μm滤膜过滤后HPLC分析，EpothiloneB的含量采用外标法测定，分析采用AgilentXDBC18柱(4.6mm×15mm，填料4.6μm)，流动相采用65%甲醇(V/V，甲醇:水65:35)，柱温25℃，λ=254nm，进样量5μL。

1.2.4遗传稳定性实验将生产能力较高的几株菌接种至CY培养基中传代1次，进行发酵实验，检测EpothiloneB的含量。1.2.5碳源、氮源的筛选与发酵条件的优化分别选取葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、玉米淀粉、乳糖、丙三醇、乳酸为碳源，选取酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、花生饼粉、玉米浆、硝酸铵、尿素和丙氨酸为氮源，考察不同碳、氮源对纤维堆囊菌AHB125产EpothiloneB的影响，进而选择最佳碳、氮源。设计正交实验，考察摇床转速、接种量、装液量、温度对EpothiloneB合成的影响。

2结果与分析

2.1紫外诱变结果不同的处理时间对菌株的致死率不同，从而导致不同的诱变率。实验所得到的致死率结果见图1。致死率过高或过低都不利于诱变菌株的筛选，一般致死率为90～95%效果较好。但实验要考虑到诱变菌株在乙酸钠的抗性培养基中培养，所以选择致死率为86%(即80s)的处理时间为最佳。经过多次紫外诱变，得到在含有2%乙酸钠的培养基中生长良好的菌株58株。每一株分别进行发酵性能的测定，发现其中有6株产EpothiloneB的能力比原始菌株高50%以上，结果见表1。从表中可以看出，经过4次诱变的SC4－38菌株

2.2突变株的遗传稳定性经过10次传代培养，发现SC4－50、SC4－49、SC4－38和SC4－6产能分别降低至5.8mg/L、7.6mg/L、6.2mg/L和8.3mg/L。而SC－56和SC4－14的产能水平比较稳定，且波动范围小于5%。说明SC4－56和SC4－14是遗传性能比较稳定的菌株。下面的发酵条件优化以SC4－56为试验菌。

2.3不同碳源对EpothiloneB产量的影响以葡萄糖等代替发酵培养基中的碳源，设计单因素实验，结果见图2。玉米淀粉为碳源时EpothiloneB产量最大，为18.6mg/L，其次为葡萄糖16mg/L。分别配制玉米淀粉浓度为1、2、4、6、8、10g/L的发酵培养基，考察不同浓度的玉米淀粉对EpothiloneB产量的影响，结果见图3。由图3可以看出，当玉米淀粉的浓度在6g/L时，EpothiloneB产量最大，为20.5mg/L。

2.5发酵条件的优化根据最佳碳氮源的单因素实验，选取玉米淀粉和蛋白胨为最优培养基，对发酵过程中影响比较大的摇床转速、培养温度、接种量和装液量作为正交实验的四个因素。前期实验已经分别获得这四个单因素影响EpothiloneB产量的数据，分别选取最佳条件及其上、下相邻的条件，作为正交实验中各因素的三个水平进行正交实验设计L9(34)。因素水平见表2，结果见表3。

3讨论

对产Epothilone的菌株进行诱变已有很多研究报道，如孟凡欣等用硫酸二乙酯对Epothilone产生菌进行诱变，EpothiloneA和B的产量都明显提高［9］;GuoliGong等采用紫外诱变使菌株S.cellulosum0157－2Epothilones产量提高100多倍［10］。虽然有很多文献报道关于Epothilone的育种，而对EpothiloneB产生菌株的选育却很少报道。本文对EpothiloneB产生菌进行选育，并对所获得的1株突变株发酵条件进行优化，目标物质的产量比原始菌株提高约4倍，达到28.24mg/L，虽然取得了明显的效果，但与已有报道相比还有很大距离。EpothiloneB的产量是阻碍其应用的一个重要瓶颈，因此很多研究者通过对其发酵工艺及其提取条件进行研究，期望获得更好的产量。如WenruiCao等采用响应面方法对S.cellulosumSo0157－2的发酵培养基条件进行优化，使Epot-hiloneB产量达到82mg/L［11］。本研究得的突变菌株与发酵条件为后续研究提供基础，为采用其它诱变剂诱变该菌株提供指导。