生物安全型高压灭菌器在BSL—3实验室中的应用

BSL-3实验室是进行对人体危害性较高实验的活动场所，实验活动过程中产生的废弃物具有高致病性，必须经过消毒处理后方可排出实验室。《实验室生物安全通用要求》GB19489-2008中规定，BSL-3实验室应在防护区内设置生物安全型高压蒸汽灭菌器，实验室产生的固体废弃物或少量液体废弃物可经实验室专用高压灭菌器灭活后排出。因此，高压灭菌器在BSL-3实验室中是不可或缺的重要设备，同时，高压灭菌器在设计制造和使用方面有特殊要求。

下面将以某BSL-3实验室为例，介绍该实验室所用生物安全型高压灭菌器的系统构成、工作原理、结合BSL-3实验室要求的工作流程以及灭菌效果监测方法等。

一、工作原理和构成

（一）工作原理

目前国际上高压灭菌器广泛采用的处理方法是高温高压灭菌法，以蒸汽作为灭菌因子，在灭菌器不存在冷空气的条件下，充入纯蒸汽并施加压力可提高蒸汽温度，当蒸汽与物品充分接触时放出潜热加热物品达到杀菌目的。高温灭菌消毒的原理是高温对微生物具有明显的致死作用，用高温处理微生物时可对菌体蛋白质、核酸、酶系统等产生直接破坏作用，可使蛋白质中的氢键破坏从而使蛋白质变性和凝固，使酶失去活性，导致菌体死亡。高温灭菌消毒具有效果可靠、性能稳定、对自然环境无污染的优点。

（二）系统构成

该BSL-3实验室所用生物安全型脉动真空灭菌器主要由灭菌室腔体、夹套、蒸汽发生器、真空泵、软化水泵、腔门及密封圈、管路系统、空气过滤器、电气及控制系统等组成。该灭菌器根据BSL-3实验室需求，设置了八个灭菌程序，分别为固体灭菌、敞开液体灭菌、封口液体灭菌、密封测试、过滤器消毒、橡胶塞灭菌、常规121℃灭菌、BD测试程序。

1.灭菌室腔体。用于放置BSL-3实验室内需要灭菌的物品，内有层架满足物品分类放置。工作时处于高温高压状态，里面设有温度和压力传感器，腔体底部的排放口用于蒸汽和冷凝水排放，蒸汽通过腔体底部的排放口进入，同时灭菌冷凝水，所有的冷凝水一直留存在腔体内和装载的物品一起被灭菌。

2.夹套。包裹在灭菌室腔体外面，工作时充满高温高压蒸汽，给腔体起隔热作用。

3.蒸汽发生器。用于产生纯净的蒸汽供灭菌使用，通过压力开关、水位传感器等控制自身加热丝的通断来产生满足一定压力要求的蒸汽。

4.真空泵。用于在脉冲阶段将灭菌室腔体抽至真空或一定压力的设备。真空泵连接在高效冷凝器上，用以高效移除空气并防止泵因温度过高而损坏。

5.腔门及密封圈。该灭菌器腔体门有两扇，一扇门在BSL-3实验室污染走廊，另一扇门在BSL-3实验室外侧（清洁区）。BSL-3实验室对密封性和压差梯度有严格的要求，因此高压灭菌器门只有在完成一个灭菌程序后，内外侧门只能开其中一个，安全互锁。任何情况下两侧门不能同时打开。

由压缩空气提供动力驱动汽缸来开关灭菌室腔体门，门的密封通过O型硅胶密封条来实现。当一个程序开始时，密封条后部通入蒸汽（有压力）， 从而紧密贴合门背部，实现密封。当程序结束时，密封条后部气体通过真空被吸回，卸载端的门打开。

6.管路系统。蒸汽管路、无菌空气管路、冷凝水管路等管路和阀门均采用不锈钢，还包括压力表、冷凝器等。

7.空气过滤器。提供可更换的空气过滤器，用于压缩空气进入腔体和门的密封。过滤后的气体用来给门加压密封，在灭菌循环结束后平衡腔体内外压力。过滤器为不锈钢材质，对于0.2μm物质的效率可达到99.999%。

BSL-3实验室污染走廊侧门在开门时，可能会有含病原微生物的空气进入高压灭菌器腔体，因此在抽真空时腔体内气体必须经过高效过滤后方可排出，高效过滤器在每个灭菌循环都被灭菌。

8.电气和控制系统。采用PACS 3000模块PLC控制系统，监测系统操作、声光报警、参数设置等。

二、工作流程

该BSL-3实验室生物安全型高压灭菌器工作流程如下：

1.开启纯水开关，检查纯水压力是否在0.1～0.3MPa范围内；开启软化水阀，检查供水压力至0.25～0.4MPa；打开压缩空气开关，待压力至0.6～0.8MPa。

2.合上电源总开关，把灭菌器的电源开关旋至开“1”的位置，观察现场系统各仪表、阀门指示灯是否正常。控制系统首先检查蒸汽发生器水位是否正常，如果正常则启动蒸汽发生器制造蒸汽，通过蒸汽发生器内电热丝的通断使蒸汽压力在2.6～2.9bar范围内达到平衡。与此同时夹套蒸汽阀打开，蒸汽通过管路源源不断被输送到夹套中，使夹套中的温度和压力不断升高。

3.把高压灭菌器清洁区侧门打开，放入BD测试包，选择BD测试程序，待“开始”按钮灯亮后才能运行该程序验证高压灭菌器抽真空能力，程序运行完成后把污染走廊侧门打开查看验证效果，验证合格后方可进行BSL-3实验室灭菌。

4.根据BSL-3实验室废弃物类型从程序列表中选择适当程序，把污染走廊侧门打开，将需要灭菌的废弃物放入腔体内，把门关好，待“开始”按钮指示灯亮后可进入所选择的灭菌程序。下面以固体废弃物灭菌程序为例阐述灭菌过程。

5.灭菌过程第一步：负脉冲阶段。该阶段真空泵通过灭菌室腔体底部的冷凝水排放口把腔体抽至近真空（0.15bar），腔体内气体经冷凝器冷却后经高效过滤器过滤后排出，接着灭菌室蒸汽阀打开，当腔体内蒸汽压力达到0.8bar左右，真空泵再次启动将其抽至近真空。如此反复抽放三次可基本抽空灭菌室内原有空气，降低其不冷凝气体含量，提高灭菌效果。

6.灭菌过程第二步：正脉冲阶段。该阶段灭菌室蒸汽阀持续打开直到腔内压力上升至1.85 bar左右时关闭，接着真空泵启动抽取灭菌室内蒸汽直至压力降到1.2bar停止。如此反复抽放5次，可使腔内物品受热更加均匀。

7.灭菌过程第三步：灭菌阶段。该阶段蒸汽持续进入灭菌室腔体，腔内压力和温度同时上升，并根据预设的程序在121℃处保持30分钟。在此过程中，腔中蒸汽不断放热并液化成水，高温高压的蒸汽通过灭菌室蒸汽阀补充进去维持腔内温度和压力，腔体内所有菌体将被彻底杀灭。

8.灭菌过程第四步：后处理阶段。该阶段灭菌室内蒸汽排放，真空泵启动把灭菌室腔压力抽至0.1bar左右，腔体内的水分因压力和沸点降低蒸发成水蒸气，腔体内得到充分的干燥。真空泵停止工作后，空气阀打开，外界空气经过无菌空气过滤器后通过该阀进入灭菌室腔体，使腔体压力与外界压力平衡。到此整个灭菌过程完毕。

9.程序完成后把清洁区侧门打开，操作人员把已灭菌物品取出后按“关门”键关门。

10.一天工作完成后依次关灭菌器、压缩空气、软化水和纯水开关。

三、灭菌效果监测方法

BSL-3实验室实验操作过程所产生的固体或少量液体废弃物中含有病毒和细菌等有害物质，若病毒等有害物质未完全灭活被排出实验室，其对周边环境有很大污染风险，因此必须对BSL-3实验室高压灭菌器灭菌效果进行验证，把污染风险降到最低程度。

BSL-3实验室高压灭菌器效果监测方法主要包括以下几类。

（一）物理参数监测

该实验室所用脉动高压灭菌器具有卓越的PACS3000控制系统和OP30友好用户界面，在可视界面可直观监测腔体和夹套温度、压力、灭菌时间等参数，并在灭菌器配套打印记录仪形成曲线记录、打印下来。另外，高压灭菌器在整个工作流程过程中，若有温度或压力未满足参数设定值要求则系统随时会报警，要求运维人员对相应影响因素进行改进。

BSL-3实验室高压灭菌器每次运行均须对物理参数进行监测，如灭菌阶段温度和压力、灭菌时间等。若灭菌程序运行过程中有报警发生，必须消除故障后再次运行该程序，直到程序完整运行且无报警发生方可开门取出废弃物。

（二）化学监测

化学监测是利用化学指示剂在一定温度、作用时间与饱和蒸汽适当结合的条件下受热变色的特点，用于间接指示灭菌效果或灭菌过程的监测方法。化学监测常用的方法有：

1.BD测试：用于检查灭菌器腔体经抽真空后残留冷空气的浓度，监测真空水平、是否漏气等，残余冷空气的存在是灭菌器灭菌失败的主要原因。测试时将标准BD测试包放于灭菌器排气口上方，灭菌器内不能放入其它待灭菌物品。循环完成后，取出BD包验证是否满足要求。BSL-3实验室每日开始灭菌运行前进行，合格后方可使用。

2.指示胶带：放在灭菌包外，BSL-3实验室每个灭菌包包外均应贴有包外化学指示胶带或包外指示卡用于指示每一包物品是否经过了灭菌处理。

3.指示卡：可以指示灭菌温度和持续作用时间，以间接指示灭菌效果。监测时应放于测试包或待灭菌包内。每次灭菌都要使用，每包必用。灭菌后指示色块达到标准颜色为合格，若发现包内指示卡不合格，应找出原因，重新灭菌处理直到合格为止。

（三）生物监测

生物监测是一种对脉动真空灭菌器灭菌效果进行验证的重要监测方法。将纯绵手术巾折叠成23cm×23cm×15cm大小的标准试验包，将两支嗜热脂肪芽胞肝菌（ATCC 7953）放于包中心，将试验包置于灭菌器腔体冷凝水排放口上方，门关闭并密封后从程序列表中选择固体灭菌程序，灭菌周期完成后从包中取出，挤碎指示管内安瓿让培养液浸透管内菌片，放于56℃专用培养箱内培养48h，连同阳性对照管观察结果。所有包内灭菌后指示管内培养液均没有变色，同时阳性对照管内培养液变成黄色，可判定灭菌合格。压力蒸汽灭菌器每周应进行一次生物监测。

四、结束语

生物安全型高压灭菌器是BSL-3实验室不可或缺的重要设备，正确使用和规范操作高压灭菌器是保证实验室废弃物正常灭活的重要前提，灭菌效果监测是保障BSL-3实验室生物安全的重要依据。 （编辑 吕志新）

参考文献

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