微生物检测方式对比

微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大类，由于多数微生物的个体较小，肉眼无法观察，对其计数一般比较困难。在目前的微生物实验教学中，对微生物计数的方法主要有三大类:总细胞计数法、活细胞计数法和微生物生长量测定法。并不是每一种方法都是通用的，不同的微生物种类需要不同的计数方法，目前多用以下8种方法进行计数:

1总细胞计数法

1.1血细胞计数板计数法

血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上划有计数室，通过对计数室中的微生物数量的读取，计算原溶液中的微生物数量。此方法由于计数板较厚，且计数室的高度是0.1~，不能采用油镜进行观察，故只能对体积较大的真核微生物进行测定，如酵母菌、霉菌抱子等，只能测得所有细胞的总数，不能区别死细胞和活细胞，尤其是对运动能力强的活细胞难以计数。目前已经提出一些方法，如结合特定的美蓝染色技术，区别酵母菌死活细胞;将运动的细胞加人甲醛溶液中，破坏其运动以便计数等。

1.2细菌计数板计数法

细菌计数板是在血细胞计数板的基础上改进而来，主要是降低计数板的厚度，同时将计数室的高度从0.1~降低到0.02~，以用油镜对较小的原核微生物进行计数。

1.3膜过滤计数法

利用计数板对高浓度的菌液测定比较准确，但当样品中细菌的数量很低时，如湖水、海水或饮用水等，用膜过滤计数法更精确些，可以将一定体积样品溶液加结晶紫染色，再用0.22卜m的聚偏二氟乙烯膜负压过滤，再用无菌水冲洗至无色后，将过滤的膜进行抽干，将膜放到载玻片上，滴加甘油，盖上盖玻片，即可在显微镜下计数。一般随机抽取20个视野进行计数，最后算平均数，计算整个滤膜上的菌的数量，得到原菌液中的微生物数量。此测定方法一般只能用于样品中细菌数量很低的情况，多数时候细菌个体由于粘附成团而影响结果。所以，过滤前的细胞分散处理很重要，例如将细菌悬液经过酸碱或超声波处理，将聚团的细胞打散，可以增加此方法的准确性。

2活细胞计数法

2.1平板菌落计数法

平板菌落计数法只能用于测定活细胞的数量，但是操作过程相对计数板而言复杂一些，而且测得的细菌数量往往小于实际值。主要原因是在计算细菌浓度时，往往每个菌落并不一定是由一个单细胞生长繁殖而来，有可能是2个或多个，致使结果比实际菌液样品中的细菌数量低，这也就是为什么现在都用菌落形成单位数(c何mL)来取代过去的绝对细菌数量。为了使菌落数更接近实际菌液中细菌的数量值，目前多数办法是:尽量扩大稀释倍数，涂布平板时少取稀释菌液，使平板中的菌落数减少，避免由于菌液中细菌数过多造成多个细菌形成一个菌落。例如，将系列梯度稀释至10一8或更低(稀释倍数取决于原菌液)。

2.2比浊法

微生物细胞在一定浓度范围内，与浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。故可通过分光光度计测定吸光值，通常测定600nm下的吸光值OD石(X)，通过与标准曲线对比，求出样品中菌液浓度，计算出细胞的数量。实验测定时容易出现误差，必须控制菌浓度在与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。

2.3霉菌计数法

对于霉菌的计数一般比较困难，由于霉菌生长快、菌丝叠加导致无法准确计数。国标霉菌计数法的原理是:将待测菌液进行10倍梯度系列稀释，利用高盐察氏培养基(CAO)与待测菌液混匀后倒平板，25℃一28(土1)℃下培养3d后开始计数，选择菌落数在10一150之间的平板进行计数，取同稀释度的两个平板的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每g(或mL)检样中所含霉菌数。

3微生物生长量测定法

3.1凯氏定氮计数法

蛋白质是微生物细胞的主要成分，含量较稳定，可以通过测定样品中含量稳定的蛋白质的量计算细菌的数量，将细胞洗涤收集，用凯氏定氮法测全氮，蛋白质含氮量为16%，细菌中蛋白质含量因种类的不同而有差别，平均值为65%，根据每一种微生物细胞内的蛋白质总含量可以计算出待侧样品中细胞的总质量，最后根据单个细胞的质量计算出样品的细胞数量。总含氮量与蛋白质之间的关系为:蛋白质总量=含氮量/16%，那么，微生物细胞总质量二蛋白质总量/65%，微生物细胞总数=细胞总质量/单个细胞质量。每一种微生物细胞的蛋白质含量不同，且不同时期的细胞蛋白质含量、单个细胞的质量都有差别，所以用此方法测定的结果误差较大，只能作为参考。

3.2DNA含量测定法

相比凯氏定氮计数法较大误差，DNA含量测定法相对较准确。每个微生物细胞的DNA含量非常恒定，平均为8.4xl0-5，将一定体积的细菌悬液离心，从细菌细胞中提取DNA，得其重量，则可计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数。

4总结

本文对常用的8种微生物数量测定方法进行总结与比较，血细胞计数板和细菌计数板常用于测定单细胞或抱子，相对比较准确;膜过滤用于测定细胞浓度很低的样品，平板菌落计数对多数微生物的测定都适用，但是相对其他计数法要复杂;比浊法相对准确，但需要作标准曲线;对于丝状微生物的数量测定，国际上有明确的标准;而凯氏定氮法和DNA含量测定法都是通过对微生物细胞内含量相对稳定的物质进行定量测定，再算出细胞的数量，操作相对复杂。