天然黄酮类化合物分离方法研究进展

[作者简介] 马森林（1983-），男，河北张家口人，河北师范大学化学与材料科学学院硕士研究生，主要从事天然药物化学研究。

[通讯作者] 陈四平（1963-），男，河北师范大学药物研究所研究员，硕士生导师，主要研究中药和天然药物。

[摘要] 黄酮类化合物因具有多种生理活性被广泛应用，从植物中提取和分离得到黄酮类化合物的方法也经过不断改进和完善。为了更好地运用传统分离方法以及新方法对黄酮类化合物的研究，现将近些年来有关黄酮类化合物的分离方法进行综述，为黄酮类化合物的研究、开发和应用提供借鉴和参考。

[关键词] 黄酮类化合物；分离方法；前景

[中图分类号] R284.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2011）07（c）-008-03

黄酮类化合物是广泛分布于植物界的一类多酚化合物，已知化学结构的化合物已有4 000多种，并且种类在不断增加。黄酮类化合物作为中草药的一大类有效成分，具有多种生理活性和药用价值。黄酮类化合物具有降血压、降血脂、抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗癌、抑菌、抗病毒、改善记忆等生理活性[1-3]。目前对黄酮类物质的研究呈上升趋势。黄酮类化合物的分离纯化主要是根据其极性大小、酸性强弱、分子大小以及特殊性质的不同而分离。

1 薄层色谱法

1.1 制备型薄层色谱法（PTLC）

制备型薄层色谱法具有操作简单、用时少、分离效果好等特点，可以得到毫克级的物质，一直是分离微量天然药物不可或缺的方法。陈欣安等[4]利用制备型薄层色谱法，以硅胶H-CMC为薄层板，以氯仿-丙酮-醋酸和甲苯-氯仿-丙酮两种三元展开剂，双向展开的方式，从鱼藤中分离出了9种异黄酮类化合物。刘玉红等[5]对聚酰胺柱层析得到的黄酮类化合物组分进行硅胶GF254薄层板（100 mm×200 mm）层析，加点数次，层析后刮下并合并比移值相同的物质，用乙醇溶解洗脱，得到各组分的溶液后，以HPLC鉴定由薄层层析得到的样品已经达到色谱纯的要求，可以用于结构鉴定。

1.2 高效薄层色谱法（HPTLC）

该法可用于混合物的分离、定性及定量分析，与薄层色谱相比，主要是因为支持剂的改进，而具有了展开时间短、所需样品少、分辨率高等特点，且具有较好的光学活性。王克勤等[6]采用G60高效硅胶板，以氯仿-甲醇-水（18.00∶2.30∶0.35）为展开剂，芹菜素标样和试样有相同的比移值0.65；用最小二乘法作线性回归，芹菜素含量与斑点峰面积的标准曲线回归方程：Y=15 138X+7 594.8，r2=0.993，线性范围：0.332~0.996 μg斑点。精密度实验RSD=1.33%（n=5），平均回收率达到97.82%。

2 柱色谱分离法

2.1 硅胶柱色谱

该法以硅胶为吸附剂，是一种较为广泛的分离方法。可用于分离二氢黄酮，二氢黄酮醇和高度甲基化或乙酰化的黄酮及黄酮醇等。加水活化后可用于分离多羟基黄酮醇及其苷类等极性较大的化合物。通常使用的洗脱剂主要有：乙酸乙酯-石油醚，氯仿-甲醇，石油醚-丙酮。可用氯仿-甲醇-水或乙酸乙酯-丙酮-水作流动相来分离黄酮苷，以氯仿-甲醇为流动相来分离酮苷元。应注意的是硅胶中含有微量金属离子，可用浓盐酸预先处理。另外，甲醇可溶解部分硅胶，要注意调整甲醇比例及分出物质后的处理问题。梁鸿等[7]从北柴胡根醇提物中取正丁醇萃取物，经硅胶（200~300目）干柱层析，以氯仿-甲醇-水（65∶30∶10）进行洗脱，经纯化后得到8 g黄酮类化合物。姜红芳等[8]从毫纯提物中取正丁醇萃取物30 g，拌以等量硅胶，装入600 g（160~200目）硅胶柱内，以石油醚-乙酸乙酯（3∶1、1∶1、1∶4）梯度洗脱，得到三个黄酮类化合物。

2.2 聚酰胺柱色谱

聚酰胺是一种最常用于分离黄酮类化合物的吸附剂，具有吸附量大、分离效果好等特点。聚酰胺通过与黄酮类化合物形成氢键，化合物酚羟基越多，吸附的程度越强，从而根据吸附作用的强弱进行分离。另外，聚酰胺的吸附能力还与溶剂有关，在水中形成氢键的能力最强，有机溶剂中较弱。在含水系统中类似于反相分配，非水系统中类似于正相分配。所以，聚酰胺分离黄酮类化合物时，用含水流动相时对苷元的吸附能力较强。有机溶剂流动相中，对苷吸附能力较强。杨彦松等[9]将洋甘菊醇提物与等量聚酰胺拌料，用聚酰胺柱反复层析，以乙醇－水为展开剂梯度洗脱，得到两个黄酮类化合物：芹菜素和木犀草素。杨海艳等[10]用正丁醇、乙酸乙酯、乙醚分别对川楝水溶液中萃取，取正丁醇部萃取物，采用聚酰胺（60~90目）柱层析反复层析，以乙醇-水梯度洗脱，主要得到两种黄酮类化合物。

2.3 葡聚糖凝胶柱色谱

葡聚糖凝胶可以根据分子的大小对化合物进行分离，常用的有Sephadex G型和 Sephadex LH-20两种。分离黄酮苷时可以起到分子筛的作用，分子量越大的越先分离出去。分离苷元时，根据酚羟基的多少而分离，越少的越先分离出去。常用的有机溶剂系统有：醇和醇水，水及水的酸、碱液，氯仿甲醇等[11]。

以上是三种最常用的分离黄酮类化合物的柱色谱分离方法，可以相互结合起来使用。王红燕等[12]运用上述三种柱色谱法从黄芩茎叶中分离得到白杨素、红花素、异红花素等七种黄酮类化合物，日本学者运用硅胶柱色谱和聚酰胺柱色谱从黄芩中分离得到三种黄酮类化合物[13]。

2.4 大孔树脂色谱

大孔树脂是一种吸附性与分子筛性相结合的分离材料。被分离的物质根据其分子的大小以及与树脂形成氢键及范德华力作用的大小而被分离。大孔树脂稳定性高、吸附选择性独特、耐腐蚀、再生简便、解吸条件温和，使用周期长、可重复使用；选择性好，易于分离极性不同的物质；避免了用有机溶剂分离而造成的有机溶剂回收难、损耗大、成本高、易燃易爆、对环境污染严重等缺点；分离得到的产物具有良好的化学纯度；操作条件温和，不易破坏物质的性能，能耗低，操作简单方便，易于工业化[14]。周媛等[15]采用大孔树脂D101柱层析，分别以40%、70%、100%乙醇-水的体系进行洗脱，从虎杖醇提物中得到了黄酮类物质α-葡萄糖苷酶抑制剂。

3 高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱已经广泛应用于天然化合物的分离纯化手段，其柱效高、分离迅速是分离纯化不可缺少的方法。HPLC与纸色谱、柱色谱、薄层色谱的分离效果相比，效果均后者比理想。更多的是制备型的HPLC在中草药有效成分分离上应用较广，且比分析型的进样量大，更适于分离。田娜等[16]采用高效制备液相色谱法从荷叶中制备分离荷叶黄酮类化合物。用60%乙醇回流提取荷叶，粗提液浓缩后经大孔树脂D-101柱及聚酰胺柱色谱分离，再在C18柱上分离，以水-乙腈为流动相进行梯度洗脱，得到了三种黄酮类化合物。经分析确定，该三种物质分别为金丝桃苷、异槲皮苷和紫云英苷。所制备的三种化合物的纯度都在97%以上。

4 高速逆流色谱法（HSCCC）

高效逆流色谱法是一种新的分离技术，主要具有两大优点：①分离量较大，分离效率较高，一次进样可达几十毫升，一次可分离近10 g样品；②不需要载体作为固定相，避免了载体对样品的不可逆吸附，造成样品的损失。陈四平等[17]运用高效逆流色谱法，从黄芩茎叶中分离出了7-O-β-D葡萄糖醛酸苷。李彩侠等[18]运用HSCCC分离纯化荷叶中的黄酮类化合物，TLC分析、颜色反应鉴定得到的分离物纯度很高。

5 液滴逆流色谱法（DCCC）

原理：化合物在两相溶剂中的溶解度不同而实现的分离，具有上样量大、分离快、损失少等特点。

该方法可用于黄酮苷类化合物的分离，常用溶剂体系有氯仿-甲醇-水、氯仿-甲醇-丙醇-水等。在分离异东方蓼黄素-3-O-葡萄糖苷、芦丁和异东方蓼黄素时，使用水层作移动相，结果双糖苷先于单糖苷流出。对极性较小的黄酮，则宜用氯仿-甲醇-水（7∶13∶8）系统。如从墨西哥的一种药用植物黄钟花中得到纯苷，经鉴定为异槲皮素（槲皮素-3-O-葡萄糖苷），采用正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5）作移动相。

6 络合沉淀法

具有邻位羟基、邻二酚羟基、邻位羰基结构的黄酮类化合物与镁、铝、铅等金属形成络合物，而与其他物质分开，加酸可还原。如果所含的黄酮类化合物不具有上述结构，则加中性乙酸铅发生的沉淀为杂质，过滤除去。再向滤液中加碱式乙酸铅，可使其他黄酮类化合物沉淀析出。近年来，在用铅盐沉淀法不理想的情况下，可用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作沉淀剂，PVP与酚羟基形成氢键的最合适条件是pH值为3.5的1%~10%甲醇水溶液。马慧萍等[19]采用铅盐沉淀法对淫羊藿黄酮进行分离，将提取液浓缩后，加入醋酸铅溶液，放置，至无沉淀发生为止，抽滤，冲洗沉淀数次后，将沉淀置于70%乙醇中，加硫酸进行脱铅、过滤、滤液减压浓缩、真空干燥，收率为2.321%，收率较低。

7 萃取法

黄酮类化合物中有酚羟基的取代而显酸性，由于羟基的数目和位置不同，酸性强弱也不同，利用这一特性，可以将植物提取的总黄酮溶于有机溶剂中，分别按弱碱至强碱，由稀碱到浓碱的水溶液的顺序进行梯度萃取，就可以将黄酮从强酸性至弱酸性的顺序中萃取出来。比如将黄酮类化合物的混合物溶于有机溶剂乙醚后，依次用5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH、5%NaOH碱性水溶液分别萃取，可依次萃取出7，4′-二羟基黄酮、7-羟基黄酮或4′-羟基黄酮、一般酚羟基黄酮、5-羟基黄酮。

近年来，随着对黄酮类化合物的药理活性、营养保健等作用的不断研究，人们发现黄酮类化合物对人类的健康有着不可低估的作用，并且，黄酮类化合物不仅可以从中草药中分离得到，而且还发现以往作为废弃物的荷叶、葡萄渣、苹果渣中也富含有黄酮类化合物，有一定的开发利用价值。对天然黄酮类化合物的分离纯化的方法较多，并出现了许多新方法。超临界流体萃取分离法、胶束动电毛细管电泳（MEKC）法、膜分离法、超微粉碎技术、电磁技术以及多种技术的组合，为黄酮类化合物的分离、纯化、分析提供了快速准确的实验方法和新的研究思路。新型的分离技术将推动天然提取物、人工合成物的更大进步。然而各种方法都有它各自的优点和缺点，只有从各方面考虑选择合适的分离纯化方法，才能为下一步的开发、研究奠定良好的基础。

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（收稿日期：2011-03-23）