一次力竭离心运动后大鼠骨骼肌HSP70的变化及针刺对其影响

【前言】一次力竭离心运动后大鼠骨骼肌HSP70的变化及针刺对其影响由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。（1.Beijing Sport University, Beijing 100084, China；2.P.E.Dept.，Luoyang Normal University,Luoyang 471022，Henan China； 3.P.E.Dept.，Baotou Normal University，Baotou 041030，Neimonggu China） Abstract:Purpose：The purpose of this study was to obs...

摘要：目的：观察一次力竭离心运动后大鼠腓肠肌HSP70表达的变化，及针刺对运动后不同恢复时间骨骼肌hsp70表达的影响。方法：雄性SD大鼠，分为安静对照组，单纯运动组和运动加针刺组。除对照组外，其他大鼠均进行一次力竭离心运动。单纯运动组运动后不做处理，运动加针刺组在运动后立即进行针刺，具体方法为从远端斜刺（进针角度为30°）穿过腓肠肌肌腹，并留针5 min。在运动后即刻、恢复12 h、24 h取大鼠腓肠肌进行分析。用免疫荧光组织化学法和western blot检测HSP70蛋白的表达。结果：1）一次性力竭离心运动后即刻、12 h、24 h组腓肠肌HSP70蛋白表达水平均增高，与对照组有显著性差异（P

关键词：针刺；离心运动；骨骼肌；热休克蛋白70

中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编号：1007-3612（2011）08-0044-04

The Changes of HSP70 in Skeletal Muscle after an Exhaustive Eccentric Exercise and the Effects of Acupuncture

LI Jun-ping1，MA Yan-chao2，ZHANG Wei3

（1.Beijing Sport University, Beijing 100084, China；2.P.E.Dept.，Luoyang Normal University,Luoyang 471022，Henan China；

3.P.E.Dept.，Baotou Normal University，Baotou 041030，Neimonggu China）

Abstract:Purpose：The purpose of this study was to observe the changes of HSP70 expression in rat gastrocnemius muscle after an exhaustive eccentric exercise，and to explore the effects of acupuncture on HSP70 expression in skeletal muscle after exercise. Method：Male SD rats were randomly divided into four groups: control group， non-acupuncture group and acupuncture group after an exhaustive eccentricexercise. The rats of non-acupuncture and acupuncture group were carried out an exhaustive eccentric exercise. After the exercise， the rats of acupuncture group were handled acupuncture on the gastrocnemius vertically from the further side （the angle of the needle was 30 degree） and through the belly of gastrocnemius where the needle stayed for 5 minutes.Then the gastrocnemius was obtained from rats of different groups.The expression of HSP70 of gastrocnemius was detected by western blot and immunofluorescence histochemical method.Results:1）The expression of HSP70 of gastrocnemius in non-acupuncture group were increased markedly immediately，12 hours and 24 hours after exhaustive eccentric exercise（P

Key words: acupuncture； eccentric exercise； skeletal muscle； HSP70

投稿日期：2010-09-17

基金项目：北京体育大学校管课题“一次力竭离心运动后大鼠骨骼肌热休克蛋白的变化及针刺对其影响”（课题号：2009A017）。

作者简介：李俊平，讲师，博士，研究方向运动的骨骼肌反应与适应。热休克蛋白（HSP）是生物体在各种刺激作用下激活HSP基因，产生的一组在结构上高度保守的多肽。很多研究证实，骨骼肌在运动与缺氧的情况下热休克蛋白的表达会有所增加。热休克蛋白赋予细胞保护作用，从而使细胞免遭高热、缺氧、缺血再灌注、自由基等损伤。

超过习惯性负荷的肌肉运动能够造成人和动物的延迟性肌肉损伤，主要表现为肌节缩短；Z带扭曲、增宽、部分或全部消失；M线模糊、扭曲或消失；肌丝排列改变，粗细肌丝相互位置紊乱，部分肌丝断裂或消失等。研究发现，针刺能促进大负荷运动后骨骼肌超微结构的恢复［1，2］。

本研究拟探讨针刺是否导致大鼠离心运动后骨骼肌HSP70含量及在细胞中分布的变化，为针刺促进肌肉损伤恢复提供理论基础。

1 研究对象与方法

1.1 实验动物分组与处理 雄性SD大鼠，8周龄，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠分为安静对照组，单纯运动组（运动后即刻、12 h、24 h），运动加针刺组（运动加针刺即刻、12 h、24 h）。每组6只大鼠。

运动组大鼠进行适应性训练3 d后，在跑台上进行持续性下坡跑，跑台坡度为-16°，速度为16 m/min，持续运动直至力竭。在运动后即刻，将针刺组大鼠用针灸针沿腓肠肌的纵向，从远端斜刺（进针角度为30°）穿过腓肠肌肌腹，并留针5 min。

1.2 大鼠骨骼肌样本的采集与处理 大鼠称完体重后，用2%戊巴比妥钠（0.25 mL/100 g）腹腔注射麻醉，注射器腹主动脉取血后，速取右侧腓肠肌，分装后，投入液氮中冻存备用。

用于冷冻切片的腓肠肌，按要求剪取小块，用OCT包埋后，投入异戊烷（固液混合）中速冻，锡纸包好入液氮保存备用。

1.3 骨骼肌HSP70 免疫印迹 准确称取0.2 g组织，加1.8 mL裂解液（150 mMsodium chloride，1.0% Triton X-100，1.0% NP-40，1.0% sodium deoxycholate ，0.1% SDS，50 Mm Tris（pH8.0），1.0mMEDTA，1.0 mM PMSF，1.0 mM NaF），剪碎，匀浆，1 2000转/min离心20 min，取上清。

匀浆液蛋白浓度测定使用Bradford法。调整匀浆液蛋白浓度后，20 μL样品中加入5倍的上样缓冲液5 μL，沸水中煮5 min，－20℃冰箱保存待测。

电泳使用8%的分离胶和5%的浓缩胶。每孔上样量为10 μL（40 μg蛋白）。使用双垂直电泳槽进行凝胶电泳。初始电压为60V，溴酚蓝进入分离胶后电压改为90V，电泳大约2 h停止电泳。在转移槽中倒入预冷的转移缓冲液，300mA恒流，转膜1 h40 min。

将膜在5%PBST奶粉中封闭2 h。PBST洗膜3次，每次10 min。加入一抗： HSP70（1:200, 武汉博士德）、β-tubulin（1:1000, santa cruz）。4℃振摇过夜。PBST洗膜3次，每次10 min。加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（1：2000，Santa cruz），室温振摇40 min。PBST洗膜3次，每次10 min。

在暗室中使用Kodak胶片曝光，曝光时间为2 min。显影至有条带后用定影液定影，自来水冲洗胶片终止反应。Image J处理条带；ImageQuant TL计算Integrated Optical Density值。

1.4 骨骼肌HSP70免疫组化检测 冷冻样本在恒冷切片机内进行切片，厚度为8 μm，按照如下免疫荧光染色流程进行免疫荧光染色：1）冰冻切片吹风机吹干，4℃丙酮固定10 min，PBS漂洗5 min×3次；2）10%正常山羊血清室温孵育10 min，倾去血清，勿洗；3）滴加一抗（1:2 000，武汉博士德）4℃过夜；4）复温30 min，PBS漂洗5 min×3次；5）滴加FITC 标记二抗（1:200，中杉金桥生物技术有限公司），37℃孵育1 h，PBS漂洗5 min×3；6）60%的缓冲甘油封片。使用荧光显微镜采集免疫荧光图像，每张切片随机选取骨骼肌横断面视野5个，将数字化图像储存于计算机。

1.5 数据统计方法 数值均用平均值±标准差形式表示，用统计学分析软件SPSS 11.5 for windows进行ANOVA单因素方差分析，显著性水平为P

2 结 果

2.1 Western blotting测定HSP70蛋白表达结果 一次性力竭离心运动后即刻、12 h、24 h组腓肠肌HSP70蛋白表达水平均增高，与对照组有显著性差异（P

一次性力竭离心运动后对腓肠肌进行针刺，仅12 h组HSP70蛋白表达高于对照组，差异显著（P

表1 腓肠肌HSP70含量的变化

对照组1.00±0.00运动后即刻

运动后12 h

运动后24 h1.57±0.04*

1.27±0.13*

1.17±0.05*1.04±0.10

1.25±0.14*

0.96±0.06注：*与对照组相比，P＜0.05； 与相同时间非针刺组相比，P＜0.05。

2.2 免疫组化测定HSP70蛋白表达结果 将所得照片用IPP-6.0软件分析，获取每组图片不同部位HSP70的平均光密度值。结果显示：一次力竭离心运动后，非针刺组HSP70蛋白在细胞胞质内广泛表达，针刺后即刻HSP70蛋白主要在细胞膜和细胞核表达，随后逐渐分布到细胞质。

3 分析讨论

3.1 一次性力竭运动对大鼠腓肠肌HSP70蛋白表达的影响 HSP的主要功能是细胞保护功能和分子伴侣作用。其中HSP70的分子伴侣作用就是与新生、未折叠、错折叠或聚集的蛋白质相结合，使某些蛋白质聚集物解离，加速正确的肽链折叠和重折叠；维持某些肽链的伸展状态以利其跨膜转位，在线粒体、内质网等不同的区域内发挥作用；同时还促进某些变性蛋白的降解和清除；重新激活某些酶的作用，以维护细胞的功能和生存。

很多研究证明运动可以刺激动物和人体骨骼肌内HSP70的表达。有研究发现无氧阈运动30 min后的4 min、30 min、3 h，股四头肌HSP70 mRNA 浓度分别增加4倍、5倍和3.5倍,而运动后3 h内HSP70含量并没有显著变化。提示一次固定负荷运动可能增加HSP70 mRNA表达,但不足以使HSP70蛋白含量显著增加［3］。让没有训练经验的受试者上肢做大强度离心收缩48 h后，肱二头肌HSP70蛋白含量显著增加的同时,其mRNA水平也有显著增加［4］。受试者进行自行车运动45 min后（70%最大摄氧量）, 分别在1 d、2 d、3 d和6 d取股外侧肌检测，发现HSP70含量直到第6 d平才显著增加，提示运动诱导的骨骼肌HSP 70表达与肌肉损伤的修复和肌肉损伤修复后骨骼肌细胞的重塑有关［5］。让10名优秀划船运动员进行4周的无氧阈训练（乳酸4 mmol/L）,发现各周股外侧肌HSP70含量分别增加181%、405%、456%和363%［6］。骨骼肌HSP70的表达与肌肉募集方式, 肌肉负荷以及运动强度有关［7］。

大鼠进行跑台运动时，腓肠肌中的红肌（RV）HSP70含量在24 m/min的速度时升高，但白肌（WV）HSP70含量达到27 m/min的速度时才升高，比目鱼肌（Sol）HSP 70含量在速度15 m/min时就有升高,而到最高速度33 m/min时反而下降。RV、WV和Sol三者的肌纤维类型和募集方式都不同［8,9］,因此,实验推断HSP70的表达可能与肌肉类型有关。另有研究现实，大鼠经过长期大负荷训练, 腓肠肌白肌HSP表达最高, 腓肠肌红肌次之, 比目鱼肌表达最低, 与其基础表达量呈反比［10］。

运动强度［5,6,11］，运动时间或周期［12,13］，运动形式［3,4］，肌肉类型［23］，刺激方式［4,14］，恢复时间长短［15］等对HSP70基因与蛋白表达的影响都是不同的。本研究设计一次性力竭离心运动模型中，结果显示大鼠腓肠肌HSP70蛋白表达在运动后即刻即增加至最高，运动后12 h和24 h虽有所降低，但仍高于对照组，提示一次力竭运动可导致骨骼肌HSP70增加。有人研究发现，进行长时间功率自行车运动，在疲劳前40 min、疲劳时刻人体骨骼肌中的HSP70 mRNA含量增加［16］。因此推测一次性力竭运动过程中HSP70基因表达的增加，可能是运动后HSP70蛋白增加的原因。HSP70蛋白含量的增加，可对运动导致的细胞损伤发挥保护作用。运动后12 h组和24 h组腓肠肌HSP70的高表达，提示HSP70可能在促进损伤细胞的恢复中，也发挥着重要的作用。

3.2 针刺对一次性力竭运动后大鼠腓肠肌HSP70蛋白表达的影响 研究发现，针刺能促进大负荷运动后骨骼肌超微结构的恢复。屈竹青［17］发现大负荷斜蹲后，针刺腿股外肌肌丝变化显著缓解，肌原纤维排列整齐，明暗带界限清楚，A带长度均匀；粗丝完整，排列有序。徐玉明［18］的研究也发现针刺可以促进大负荷后骨骼肌静息膜电位的恢复。针刺有可能通过某种途径，使膜内外的各种离子的浓度梯度重新建立起来，特别是促进了K+内流，使细胞膜电位得到恢复。屈竹青［19］还发现，电刺激腓肠肌至力竭后3～6 h，肌浆钙持续上升，延迟6 h肌浆钙已比对照组增加一倍以上。力竭的肌肉经针刺处理，胞浆钙变化明显减轻，针刺后3～6 h，胞浆钙与对照组之间已无显著性差异，而离体实验表明针刺的降钙作用在针后10 min便完成。故屈竹青认为针刺加速损伤肌恢复的机制在于：针刺损伤肌通过某种途径促进了Na+-Ca2+交换过程，使损伤肌细胞内钙超载得以缓解；胞浆钙恢复正常将抑制损伤结构的进一步发展，同时促进了异常结构的恢复的加速。

有研究显示，针刺能够增加HSP70在脑组织中的表达是针刺治疗急性脑出血的一个重要机制［20］；针刺不同穴位可抑制多发梗塞性痴呆模型大鼠脑细胞凋亡并且诱导多发梗塞性痴呆模型大鼠各脑区HSP70的表达，并且有穴位特异性［21］。提示针刺能增加HSP70的表达并对机体细胞进行保护和促进恢复作用。

本研究结果显示，针刺组大鼠腓肠肌HSP70蛋白含量在运动后即刻和运动后24 h，与对照组无差异，并且均低于相应时间的运动组；仅在运动后12 h组明显高于对照组，但与相同时间的单纯运动组没有差异，但针刺可以使广泛分布在胞质的HSP70聚集在细胞膜或细胞核表达。正常情况下，HSP70位于细胞浆内，当细胞遭受应激作用时，HSP70迅速移入细胞核内包围核仁，细胞浆内只有少量存在。而应激消除后细胞处于恢复阶段时，细胞核内的HSP70又返回胞浆，在细胞浆内呈低水平表达，再次应激又重新返回细胞核［22］。本研究结果提示针刺对于运动后骨骼肌的保护和修复作用，可能是由于针刺改变了HSP70在细胞内的分布，使HSP70聚集到细胞膜和细胞核，从而发挥其细胞保护及修复作用。

4 结 论

1） 一次力竭离心运动后即刻即可诱导大鼠腓肠肌HSP70蛋白高表达，随恢复时间的延长HSP70蛋白表达下降。提示运动后增多的HSP70可能在保护和促进细胞恢复中，发挥着重要的作用。

2） 针刺可使一次力竭离心运动后骨骼肌HSP70从胞质聚集到细胞膜和细胞核，发挥其细胞保护和修复作用。

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